옐로 피버 모스키토에서 Hemocytes를 수집 및 스테 이닝을위한 프로토콜 Aedes aegypti

이 절차의 전반적인 목표는 모기에서 혈구(hemocytes)를 수집하고 염색하는 것입니다. 이는 먼저 냉각된 모기에 소량의 항응고 희석액을 주입함으로써 수행됩니다. 이는 혈구의 결합을 느슨하게 하여 모든 혈구가 용액 속으로 나오게 하기 위함입니다.

절차의 두 번째 단계는 모기의 다리, 날개, 그리고 복부 끝부분을 제거하는 것입니다. 셋째로, 관류 과정을 시작하기 위해 모기의 다른 부위에 신선한 희석액을 주입합니다. 마지막 단계는 희석된 혈림프를 준비된 슬라이드 위에 떨어뜨려 수집된 혈구 세포를 고정하고 염색하는 것입니다.

최종적으로, 기본적인 글라이드 현미경 검사를 통해 관심 있는 모기 종에서 발견되는 혈구 세포의 주요 유형과 수를 확인할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다. 이 기술이 프로퓨전(profusion)과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은 프로퓨전의 간편함과 고압 주입법의 정확성을 결합하면서도, 최종 목표까지 도달하는 단계가 더 적다는 점입니다. 본 연구의 목적은 면역 자극에 반응하는 혈구 세포의 유형과 그 풍부도를 식별하는 것입니다.

이 기술을 시연할 사람은 제 연구실의 학부생인 Amina Abdul Kum입니다. 프로토콜을 시작하기 전에, 혈림프 희석액을 1 mL씩 분주하여 준비하십시오. 이를 -20 °C에서 보관하고, 분주된 용액 중 사용하지 않은 부분을 다시 냉동하지 마십시오.

이제 1 mm 두께의 현미경 슬라이드 위에 1 cm 크기의 원을 그립니다. 모기 한 마리당 슬라이드 한 장이 필요합니다. 풀드 니들(pulled needles)을 준비합니다.

각 인발 바늘의 끝을 부러뜨려 바늘 입구를 만듭니다. 튜브 및 주사기 구성 요소가 연결된 마이크로 인젝터 홀더에 바늘 하나를 조립합니다. 다음으로, 미네랄 오일을 사용하여 튜브와 바늘 홀더 조립체에서 기포를 제거합니다.

이 핸드헬드 주사기에 미네랄 오일을 채우고 기포가 생기지 않았는지 확인합니다. 떨어지는 오일을 받칠 수 있도록 바늘 아래에 받침대를 놓습니다. 마이크로 인젝터의 이 부분을 열고 오일을 채워 기포를 모두 제거합니다.

그리고 이것을 다른 팁에 연결했던 것과 동일하게 핸드헬드 시린지에 클립으로 고정합니다. 미네랄 오일을 천천히 주입하여 플라스틱 튜브를 통과하게 함으로써 내부에 남아있는 기포를 모두 제거합니다. 그 다음, 다시 한번 팁 윗부분에 미네랄 오일을 방울져 떨어질 때까지 충분히 채웁니다.

그 다음, 기포가 생기지 않도록 이를 유리 주사기에 다시 연결합니다. 그런 다음 조립된 구성 요소에 미네랄 오일을 역충전하여 바늘 튜브와 주사기가 모두 채워질 때까지 반복합니다. 이제 마이크로 인젝터를 희석액 전달에 사용할 준비가 되었습니다.

다음으로, 15마리의 성체 암컷을 얼음에 완전히 잠길 작은 고체 케이지 용기에 흡입하여 동물을 준비합니다. 모기들은 추위에 의해 움직임이 제한될 때 마취되며, 이는 보통 8분 이내에 이루어집니다. 마취된 모기 한 마리를 미세주입이 수행될 함몰 슬라이드 위에 올립니다.

현미경 하에서, 마이크로 인젝터로 혈림프 희석액 12 µL를 흡입합니다. 핀셋을 사용하여 현미경 아래의 모기를 부드럽게 고정한 후, 희석액 3~3.5 µL를 주입합니다. 그러면 복부의 7번째와 8번째 마디 사이가 팽창하게 됩니다.

희석액을 주입하면서 모기 3마리에 주입할 수 있습니다. 마이크로 인젝터를 다시 충전하기 전에, 주입이 완료된 모든 모기를 얼음 위에 놓인 깨끗한 플라스틱 컵에 옮겨 약 5분 동안 회복시킵니다. 배양 과정 동안 항응고제 희석액이 내부 조직에 부착된 혈구들을 제거합니다.

첫 번째 동물 그룹이 배양 기간 동안 회복하는 동안, 일반적으로 3~5마리의 모기를 추가로 주입할 수 있습니다. 컵 안에서 5분이 지난 후, 마이크로 가위를 사용하여 주입된 모기의 다리, 날개, 그리고 복부의 8번째 마디 끝부분을 잘라내어 준비합니다. 이때 다리와 날개를 흉부나 혈강에 너무 가깝게 자르지 않도록 주의하십시오.

림프가 유출될 수 있습니다. 이제 식각 슬라이드를 70% ethanol로 세척하고 킴와이프로 건조하십시오. 현미경 하에서 해부된 모기 한 마리를 식각된 원의 바깥쪽 가장자리에 배치하십시오.

마이크로 인젝터에 12 µL의 신선한 희석액을 채웁니다. 핀셋으로 모기를 잡고 중흉부의 측면에 8~10 µL를 주입합니다. 이 주입 단계 이후에 미네랄 오일이 주입되지 않도록 주의하십시오.

혈림프가 복부에서 식각 원(etch circle) 내부로 수집될 것입니다. 핀셋으로 복부를 부드럽게 눌러 혈림프의 흐름을 유도하고 촉진하십시오. 이제 슬라이드 위에 수집된 혈림프를 건조시킵니다. 이 과정은 약 10분 정도 소요됩니다.

이제 염색 준비가 완료되었습니다. 각 슬라이드를 Hema three로 개별적으로 염색하십시오. 각 슬라이드를 고정액에 5회 담그되, 한 번 담글 때마다 1초 동안만 유지하십시오.

이어서 용액 1에 1초씩 세 번 담근 후, 용액 2에 동일하게 반복합니다. 이제 슬라이드의 뒷면만 탈이온수로 헹구고, 앞면은 헹구지 마십시오. 앞면을 건조시킨 후 마운팅 용액을 사용하여 커버슬립을 덮습니다. 커버슬립을 부드럽게 눌러 마운팅 용액이 염색된 조직 전체에 완전히 채워지도록 합니다.

최적의 결과를 위해 슬라이드를 최소 3시간 동안 건조하십시오. 염색된 적혈구는 준비 후 2주 이내에 관찰 및 이미징해야 합니다. 성체 암컷에서 얻은 이 세포들은 본 프로토콜을 사용하여 식별되었습니다.

첫 번째 이미지는 fal 형태와 높은 핵-세포질 비율을 바탕으로 한 전구 조혈 세포 부위를 보여줍니다. 이 이미지는 fal 형태와 세포질-핵 비율을 바탕으로 한 ENO 세포입니다. 마지막으로, 이는 과립구 유형의 조혈 세포 부위입니다.

이전의 고압 주입법과 비교하여 질감이 더 입자형이며 모양이 더 OID에 가깝습니다. 본 프로토콜을 통해 유사한 총 수의 he cytes를 얻었으며, 숙련된 후에는 입자형 부위가 가장 흔한 세포 유형임을 동일하게 확인하였습니다. 적절하게 수행될 경우, 이 기술을 통해 약 15~20마리의 모기를 1시간 이내에 처리할 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 모기에게 dent를 적절하게 주입하는 방법, 헤모림프를 수집하는 방법, 그리고 시각화 및 이미징을 위해 헤모림프를 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.