Name: 모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: 학습하세요 슬롯 블롯 기법을 활용한 보편 항체를 이용한 인플루엔자 바이러스 HA와 NA의 정량 분석 방법을. 이 기술은 백신 개발 및 바이러스 연구에 필수적인 단백질 정량화에 활용됩니다.

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저자는 원고의 광고 문안 검토를 위해 부인 모니카 Tocchi 감사하고 싶습니다. AMH가 캐나다에서 사우디 아라비아 문화 협회를 통해 킹 Abdulaziz 대학에서 장학금으로 지원됩니다.

<ol><li>Webster, R. G., Bean, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of influenza virus.</a> Annu Rev Genet. 12, 415-431 (1978).</li>
<li>Skehel, J. J., Wiley, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+binding+and+membrane+fusion+in+virus+entry%3A+the+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin.</a> Annu Rev Biochem. 69, 531-569 (2000).</li>
<li>Wood, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+the+host+cell+on+standardisation+of+influenza+vaccine+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol+Stand%22%5BJournal%5D)">The influence of the host cell on standardisation of influenza vaccine potency.</a> Dev Biol Stand. 98, 183-188 (1999).</li>
<li>Sylte, M. J., Suarez, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+neuraminidase+as+a+vaccine+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Influenza neuraminidase as a vaccine antigen.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 333, 227-241 (2009).</li>
<li>Bright, R. A., Neuzil, K. M., Pervikov, Y., Palkonyay, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WHO+meeting+on+the+role+of+neuraminidase+in+inducing+protective+immunity+against+influenza+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">WHO meeting on the role of neuraminidase in inducing protective immunity against influenza infection.</a> Vaccine. 27, 6366-6369 (2008).</li>
<li>Chun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+antibodies+and+their+applications+to+the+quantitative+determination+of+virtually+all+subtypes+of+the+influenza+A+viral+hemagglutinins%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Universal antibodies and their applications to the quantitative determination of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins.</a> Vaccine. 26, 6068-6076 (2008).</li>
<li>Gravel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+analyses+of+virtually+all+subtypes+of+influenza+A+and+B+viral+neuraminidases+using+antibodies+targeting+the+universally+conserved+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative analyses of virtually all subtypes of influenza A and B viral neuraminidases using antibodies targeting the universally conserved sequences.</a> Vaccine. 28, 5774-5784 (2010).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+slot+blot+for+the+detection+of+virtually+all+subtypes+of+the+influenza+A+viral+hemagglutinins+using+universal+antibodies+targeting+the+fusion+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A simple slot blot for the detection of virtually all subtypes of the influenza A viral hemagglutinins using universal antibodies targeting the fusion peptide.</a> Nat Protoc. 5, 14-19 (2010).</li>
<li>Harvey, R., Wheeler, J. X., Wallis, C. L., Robertson, J. S., Engelhardt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+haemagglutinin+in+H5N1+influenza+viruses+reveals+low+haemagglutinin+content+of+vaccine+virus+NIBRG-14+%28H5N1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Quantitation of haemagglutinin in H5N1 influenza viruses reveals low haemagglutinin content of vaccine virus NIBRG-14 (H5N1).</a> Vaccine. 26, 6550-6554 (2008).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+deglycosylation+and+electrophoresis+to+the+quantification+of+influenza+viral+hemagglutinins+facilitating+the+production+of+2009+pandemic+influenza+%28H1N1%29+vaccines+at+multiple+manufacturing+sites+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Application of deglycosylation and electrophoresis to the quantification of influenza viral hemagglutinins facilitating the production of 2009 pandemic influenza (H1N1) vaccines at multiple manufacturing sites in China.</a> Biologicals. 38, 284-289 (2010).</li>
<li>Johansson, B. E., Pokorny, B. A., Tiso, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supplementation+of+conventional+trivalent+influenza+vaccine+with+purified+viral+N1+and+N2+neuraminidases+induces+a+balanced+immune+response+without+antigenic+competition%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Supplementation of conventional trivalent influenza vaccine with purified viral N1 and N2 neuraminidases induces a balanced immune response without antigenic competition.</a> Vaccine. 20, 1670-1674 (2002).</li>
<li>Hashem, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+antibodies+against+the+highly+conserved+influenza+fusion+peptide+cross-neutralize+several+subtypes+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Comm%22%5BJournal%5D)">Universal antibodies against the highly conserved influenza fusion peptide cross-neutralize several subtypes of influenza A virus.</a> Biochem Biophys Res Comm. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 두 표면 단백질은 면역 반응을 유도 6-11에게 가장 중요한 요소이기 때문에 바이러스 인플루엔자 바이러스는 HA와 NA의 양적 결정은 백신 연구 및 개발을 위해 중요하다. 이러한 단백질의 검출 이전에 보고된 면역 방법은 스트레인 특정 항체를 필요로합니다. 항체가 자신의 유일한 보편적으로 보존 epitopes 6-8을 인식 때문에 HA와 NA 항원 여기에 설명된 내용을 계량하는 간단 재현성과 빠른 슬롯 얼룩 방법은 모든 독감 바이러스는 HA와 NA 단백질에 적합합니다. 이 방법에 관심이 조사에 대한 유일한 어려움들은 사내에 그러한 보편 항체가 없다는 것을 수 있습니다. 그러나, 항원으로 펩티드를 사용하여 이러한 항체의 생성은 일상적인 절차입니다. 변종의 펩티드가 경쟁력 엘리사 6-8에 주어진 펩타이드에 바인딩을 위해 서로 동일하게 경쟁하기 때문에 관심있는 과학자들이 설명되어있는 절차에 따라 항체 자신을 만들 수 있지만, 그들은 또한되도록 HA와 N...

An author's affiliation was omitted from the publication of <a href="http://www.jove.com/video/2784">Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays</a>.

Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약이나 장비의 명칭 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 바이오도 SF의 Microfiltration 장치 </td><td> 바이오 래드 </td><td> 170-6542 </td><td></td></tr><tr><td> 바이오 점 SF 필터 용지 </td><td> 바이오 래드 </td><td> 162-0161 </td><td></td></tr><tr><td> Immobilon - FL 전송 멤브레인 (PVDF) </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td><td></td></tr><tr><td> 배기기 </td><td> Millipore </td><td> WP6111560 </td><td></td></tr><tr><td> Chemiluminescence BioMax 라이트 필름 </td><td> 코닥 </td><td> 178 8207 </td><td></td></tr><tr><td> FluorChem 젤 문서 시스템 </td><td> 알파 Innotech </td><td> 29-008 - 1896X </td><td></td></tr><tr><td> HA와 NA의 항원에 대한 범용 토끼 항체 </td><td></td><td> 유니 - 1 (HA) HCA - 2, HCA - 3 (NA) </td><td> 항체는 MTA를 통해 사용할 수 있거나 이전에 6,7를 설명한 절차에 따라 관심이 조사에 의해 생성하실 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 인플루엔자 예방 접종 참조 항원 </td><td> CBER / FDA 또는 NIBSC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 인플루엔자 백신 샘플 </td><td></td><td></td><td> 대부분의 국가에서 일반적으로 사용할 수 </td></tr><tr><td> 요소 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> U1250 </td><td></td></tr><tr><td> Zwittergent 3-14 세제 </td><td> Calbiochem </td><td> 693017 </td><td></td></tr><tr><td> 트윈 - 20 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> BP337 - 500 </td><td></td></tr><tr><td> 모래 바닥 학년 차단기가 아닌 지방 건조 우유 </td><td> 바이오 래드 </td><td> 170-6404 </td><td></td></tr><tr><td> ImmunoPure 염소 방지 토끼 IgG (H + L), 복합 퍼옥시데이즈 </td><td> 써모 과학 </td><td> 31,460 </td><td></td></tr><tr><td> SuperSignal 웨스트 두라는 기간 기판을 확장 </td><td> 써모 과학 </td><td> 34,075 </td><td></td></tr></tbody></table>

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 hemagglutinins 및 neuraminidases를 입력하십시오

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

적혈구응집소 (HA)과 neuraminidase (NA)는 바이러스 생활주기 및 보호 면역 반응의 1,2의 유도에 중요한 역할을한다고 알려져 있습니다 인플루엔자 바이러스의 두 표면 단백질입니다. 중화 항체의 주요 대상으로, HA는 현재 인플루엔자 백신 힘 마커로 사용되며 하나의 방사상 immunodiffusion (SRID) 3로 측정됩니다. 그러나, 해당 subtype 특정 antisera의 예약 상황에 SRID의 의존은 모든 새로운 백신의 출시를 2-3 개월 지연 최소됩니다. 또한, NA는 또한 보호 면역 4, 인플루엔자 백신의 NA의 양에 따라 적절한 시약이나 분석 방법 5 부족으로 아직 표준화되지를 유도 증거에도 불구하고. 따라서, HA와 NA 항원을 quantifying 수있는 간단한 대체 방법은 빠른 출시 및 인플루엔자 백신의 더 나은 품질 관리를 위해 바람직합니다. 사용 가능한 모든 인플루엔자 HA와 NA 시퀀스에서 보편적으로 보존 지역은 6-7 생물 정보학 분석에 의해 확인되었습니다. 이 보존 시퀀스가 neuraminidases 한 효소 활성화된 사이트를 가까이 (HCA - 2로 지정)와에서 확인된 동안 하나의 시퀀스 (유니 - 1로 지정), HA, 융합 펩타이드 6만이 보편적으로 보존 에피토프에서 확인되었다 N - 말단 다른 클로즈 (HCA - 3으로 지정) 7. 이러한 아미노산 시퀀스와 펩티드가 합성과 항체 생산에 대한 토끼 면역에 사용되었습니다. HA의 유니 - 1 에피토프에 대한 항체는 HCA - 2 및 NA의 HCA - 3 지역에 대한 항체가 모든 9 NA의 subtypes를 바인딩 수있는 동안 인플루엔자 HA (H1 - H13) 13 subtypes에 바인딩할 수있었습니다. 모든 항체는 allantoic 단백질에는 교차 반응이 발견되지 않은 것을 관찰에 의해 입증 바이러스 시퀀스에 대한 놀라운 특이성을 보여주었다. 이러한 보편적인 항체 그런 다음 특정 antisera 7,8없이 인플루엔자 백신의 HA와 NA를 정할 슬롯 얼룩 assays을 개발하는 데 사용되었습니다. 백신 샘플은 다양한 농도로 희석 참조 표준과 함께 슬롯 얼룩 장치를 사용하여 PVDF 막에 적용되었습니다. HA의 감지, 샘플 및 표준은 먼저 희석되었다 트리스 버퍼 NA의 측정을 위해 그들이 이러한 조건으로 Zwittergent 0.01 %를 포함하는 TBS의 희석 동안 4M 요소를 포함하는 호수 (TBS)이 크게 검출 감도를 향상되었습니다. 각각의 보편적인 항체와 immunoblotting하여 HA와 NA의 항원의 검출에 따라 신호 강도가 densitometry로 계량되었습니다. 백신의 HA와 NA의 금액은 다음 사용하는 참조의 다양한 농도의 신호 강도와 설립 표준 곡선을 사용하여 계산되었다. 이러한 항체가 HA 또는 NA에서 유니버설 epitopes에 바인딩되는 감안할 때, 관심이 조사는 슬롯 얼룩 이외 immunoassays 연구 도구로 그들을 사용할 수 있습니다.

간단한 슬롯 얼룩 방법은 생물 정보학 분석을 통해 확인된 그들의 가장 보존 시퀀스를 대상으로 보편적인 항체를 사용하여 인플루엔자 바이러스 적혈구응집소과 neuraminidase의 부량 위해 개발되었습니다. 이 혁신적인 접근 방식은 모든 바이러스 적혈구응집소과 neuraminidase의 양적 결정에 유용한 대안을 제공할 수 있습니다.

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니데이스(NA)는 인플루엔자 바이러스의 두 가지 표면 단백질로, 바이러스의 생명 주기에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 보존된 에피토프를 표적으로 하는 항체를 사용하여 백신 내 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 함량을 정량적으로 결정하는 것입니다. 이는 먼저 보존된 에피토프를 식별함으로써 달성됩니다. 이 절차의 두 번째 단계는 검출 감도를 향상시키기 위해 표준 물질과 백신 샘플을 희석하는 것입니다.세 번째 단계는 슬롯 블롯 장치를 조립하고 슬롯에 시료를 로딩하는 것입니다. 절차의 네 번째 단계는 각각의 범용 항체를 사용하여 멤브레인 상의 HA 또는 NA를 검출하는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 밀도 측정을 통해 HA 또는 NA의 양을 정량화하는 것입니다.최종적으로, 각각의 참조 항원을 기준으로 정량화된 HA 또는 NA 결과값을 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 Sean Lee 박사님 연구실의 박사 과정 학생인 Anwar Hashem입니다.안녕하세요, 저는 캐나다 보건부 백신 평가 센터의 Sean Lee 박사님 연구실 기술자인 Caroline Grab입니다. 오늘은 인플루엔자 바이러스의 HA 및 NA 항원을 정량화하는 데 사용되는 슬롯 봇(slot bot) 절차를 시연하겠습니다. 단일 방사 면역 확산법(SRID)이나 물리 화학적 방법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, SRID와 달리 균주나 아형 특이적 항체가 필요하지 않으며 물리 화학적 방법과 같은 정교한 장비가 필요 없다는 점입니다.또한, 이 항체들은 RA의 유일하게 보편적으로 보존된 에피토프를 표적으로 하므로, 관심 있는 연구자들에게 기초 연구 도구로서 유용합니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 침전된 백신 샘플의 블로킹 어려움, 슬롯 간 샘플 누출, 블로팅 단계 중 진공 손실뿐만 아니라 면역 검출 후 관찰되는 확산 밴드의 높은 배경 신호와 같은 기술적 문제로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 하지만 몇 가지 핵심 단계에 주의를 기울이면 이러한 문제들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.오늘 이 절차를 시연해 드리겠습니다. 그럼 시작하겠습니다. 보존 영역을 식별하기 위해, NCBI에서 총 6,000개 이상의 인플루엔자 A HA 서열을 ClustalW 정렬로 분석하였으며, HA2 하위 단위의 N-말단이 매우 잘 보존된 영역임을 확인하였습니다.식별된 합의 서열의 각 아미노산 위치에 대한 섀넌 엔트로피(Shannon entropy)와 보존율을 계산하였습니다. 빨간색으로 표시된 UNI 1 에피토프는 슬롯 블롯 분석을 위한 HA 대상 범용 항체를 개발하기 위해 선정되었습니다. 유사한 접근 방식을 사용하여 모든 인플루엔자 A형 NA에서 보존된 두 개의 범용 서열을 식별하였는데, 하나는 효소 활성 부위에 가깝고 다른 하나는 말단 펩타이드에 위치하였습니다. 이러한 아미노산 서열을 가진 펩타이드들을 항원으로 사용하여 슬롯 블롯 분석을 위한 NA 대상 범용 항체를 생성하였습니다.슬롯 블롯 절차를 시작하기 전, 헤마글루티닌(hemagglutinin) 또는 HA 슬롯 블롯을 위한 TBS 내 4 M urea 용액 20 milliliters를 준비하거나, 뉴라미니다제(neuraminidase) 또는 NA 슬롯 블롯을 위한 TBS 내 0.01% ergen 용액 20 milliliters를 준비하십시오. 그 다음, TBS 용액을 최종 농도 0.1%가 되도록 20 to A 범위 내에서 추가하여 세척 완충액(washing buffer) 2 liters를 준비하십시오. 이어서, 탈지분유(skim milk powder)를 세척 완충액에 녹여 최종 농도가 5% w/v가 되도록 하여 블로킹 완충액(blocking buffer) 80 milliliters를 준비하십시오. PVDF 막을 메탄올로 15초 동안 활성화시킨 후, 2중 증류수로 2분간 헹굽니다. 막을 사용 전까지 TBS에 담가두고, T blot SF 여과지 3장을 사용 전까지 TBS로 미리 적셔두십시오. 테스트할 백신 균주에 상응하며 HA 함량이 미리 결정된 인플루엔자 백신 표준물질을 준비하십시오.미국 생물학적 제제 평가 연구 센터(Center for Biologics Evaluation and Research) 또는 영국 국립 생물학적 표준 및 관리 연구소(National Institute for Biological Standard and Control)에서 입수하였으며, HA 표준 항원 및 시험 백신 샘플의 슬롯 블롯을 이용한 HA 또는 NA 정량 분석에 사용되었습니다. 기재된 농도로 4 M urea TBS에 희석된 HA 표준 항원 스톡액 650 µL를 준비합니다. 그다음, NA 표준 항원 및 시험 백신 샘플의 샘플 농도가 표준 곡선 범위 내에 들어오도록 10x, 20x, 40x와 같이 2배 차이를 두는 세 가지 서로 다른 희석 배율로 4 M urea TBS에 시험 백신 샘플 650 µL를 준비합니다.명시된 농도의 0.01%sugen TBS로 NA 항원 표준 스톡을 각각 650 µL씩 준비하십시오. 항원 표준품은 SDS-PAGE와 밀도 분석법(dense cytometry analyses)을 병행하여 자체 제작하였습니다. 그런 다음, 2배 차이를 구현하고 시료 농도가 표준 곡선 범위 내에 들어오도록 10배, 20배, 40배의 세 가지 다른 희석 배율로 0.01%sugen TBS 내의 테스트 백신 시료를 650 µL씩 준비하십시오. 이전에 세척 및 건조된 bio SF 미세여과 장치를 조립하기 위해 가스켓 지지 플레이트를 진공 매니폴드에 배치하고 그 위에 천장 가스켓을 올리십시오.BIO SF 여과지 3장을 적신 후 가스켓 위에 배치합니다. 그 다음, 미리 적셔둔 PVDF membrane을 올립니다. membrane 위에 샘플 템플릿을 배치하고, membrane 표면에 압력이 균일하게 가해지도록 네 개의 나사를 대각선 방향으로 교차하며 손으로 조입니다. 장치를 연결하기 전에 3방향 밸브가 진공 매니폴드를 진공원에 노출시키는 상태로 설정되어 있는지 확인하십시오.펌프를 켜고 bio dot 장치를 연결하십시오. 다음 단계에서 샘플이 빠르고 적절하게 배출될 수 있도록 유량 밸브가 샘플 웰보다 낮은 위치에 있는지 확인하십시오. 대각선 교차 패턴을 사용하여 나사 조이기 단계를 반복하십시오.진공 상태에서 나사를 조이면 밀봉이 더 확실해지며 웰 사이의 교차 오염을 방지할 수 있습니다. 그 다음, 유량 밸브를 조절하여 진공 매니폴드를 공기에 노출시키고 펌프를 끕니다. 이어서, 멀티채널 피펫을 사용하여 모든 웰에 100 µL의 TBS를 가해 멤브레인을 재수화합니다.슬롯을 고르게 덮을 수 있도록 웰의 중앙 바닥 부분에 최대한 가깝게 용액을 주입하십시오. 깨끗한 피펫 팁을 사용하여 생성된 기포를 제거하십시오. 흐름 밸브를 변경하여 매니폴드를 공기와 진공 모두에 노출시키십시오.펌프를 켜고, 공기에 노출된 구멍 위에 손가락을 올려 진공 정도를 조절하며 웰에서 버퍼를 천천히 배출합니다. 그 다음, 유량 밸브를 변경하여 매니폴드를 공기에 노출시킵니다. 모든 웰에서 버퍼가 완전히 배출될 때까지 이 과정을 수행합니다.펌프를 끄거나 진공 상태를 해제하십시오. 각 웰에 표준물질 또는 백신 시료 희석액을 200 µL씩 분주합니다. 시료를 하나씩 각 웰의 중심부, 가급적 바닥면에 가깝게 피펫팅하십시오.기포가 생기지 않도록 주의하고 제거하십시오. 사용하지 않는 웰에 200 µL의 시료 희석 버퍼를 넣어 사용 중인 웰에 적절한 진공 상태가 유지되도록 합니다. 유량 밸브를 조절하여 매니폴드가 공기와 진공 상태에 모두 노출되도록 하십시오.진공 펌프를 켜고, 공기에 노출된 구멍을 손가락 하나로 가려 진공 정도를 조절함으로써 웰에서 샘플이 완전히 배출되도록 천천히 유도합니다. 포트에서 손가락을 떼어 진공을 해제합니다. 모든 샘플이 배출되는 즉시 바로 진행하십시오.각 웰에 200 µL의 TBS를 넣습니다. 멀티채널 피펫을 사용하고, 공기에 노출된 포트를 손가락 하나로 눌러 진공 강도를 조절함으로써 웰을 부드럽게 흡입하여 세척합니다. 웰의 액체가 완전히 배수되는 즉시 세척 단계를 한 번 더 반복하고, 과도하게 건조되는 것을 방지하기 위해 샘플 템플릿의 나사를 풀고 진공을 끕니다.웰에서 즉시 멤브레인을 제거하여 블로킹 버퍼에 넣습니다. 멤브레인을 완전히 덮을 수 있도록 충분한 양의 버퍼를 사용하십시오. 4°C에서 완만하게 흔들어주며 밤새 배양합니다.하룻밤 동안의 배양과 블로킹 버퍼 처리 후, 명시된 대로 막을 두 번 세척하고, 모든 세척 및 배양 과정에서는 로킹(rocking) 방식을 사용하십시오. 막이 용액에 완전히 잠겼는지 확인하십시오.다음으로, HA에 대한 uni one 범용 토끼 항체 또는 NA에 대한 범용 항체 HCA-2 또는 HCA-3를 세척 완충액 내 5% (w/v) BSA에 희석하여 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 이 항체들의 경우 토끼 항혈청을 1:4,000으로 희석했을 때 최적의 결과가 나타났습니다. 그 후, 멤브레인을 실온에서 부드럽게 흔들어주며 15분씩 총 3회 세척합니다. 이어서 1:50,000으로 희석한 염소 anti-IgG, IgG peroxidase 접합 항체와 블로킹 완충액을 사용하여 멤브레인을 실온에서 30분 동안 부드럽게 흔들어주며 배양합니다. 배양 후, 세척 완충액을 사용하여 실온에서 15분씩 3회 흔들어 세척합니다.그 후, 멤브레인 표면에서 잔류 tween 20 세제를 제거하기 위해 TBS로 5분 동안 부드럽게 흔들어 세척합니다. 다음으로, super signal West Dura extended duration substrate kit의 각 시약을 3mL씩 사용하여 발색 기질을 준비하고 혼합합니다. 멤브레인을 마른 티슈 페이퍼 위에 올려 과량의 TBS 버퍼를 부드럽게 제거한 뒤, 마른 용기로 옮겨 기질을 처리합니다. 실온에서 5분 동안 부드럽게 흔들어 반응시킨 후, 블로팅을 통해 과량의 기질을 제거합니다.완료 후, 멤브레인을 화학 발광 필름에 노출시킵니다. 신호 포화를 방지하기 위해 노출 시간을 최적화해야 하며, 일반적으로 10초에서 10분 사이입니다. 현상된 필름에 대한 밀도 측정 분석은 제조사의 지침에 따라 flora chem gel 문서화 시스템을 사용하여 수행되었습니다.각 참조 항원 반복군과 시험 백신 샘플 세트에 대해 밀도 값의 평균을 구합니다. 유의성 검정과 실험 오차 평가를 위해 3중 키트(triple kits)가 필요합니다. 평균 밀도 값을 각 슬롯의 HA 또는 NA 항원 양에 대해 도식화합니다.참조 표준에서 추출되었습니다. 여기에는 참조 백신 농도와 밀도를 사용하여, 가변 기울기 비선형 회귀 곡선 적합법을 통해 테스트 샘플 백신의 밀도로부터 샘플 농도를 외삽하는 면역 분석용 4개 매개변수 로지스틱 모델이 제시되어 있습니다. Graph PRISM을 사용하여 표준 곡선을 그리고, 여기에 표시된 바와 같이 얻어진 밀도 데이터로부터 농도를 산출합니다.HA 범용 항체 UNI one은 바이러스 서열에 대해 매우 뛰어난 특이성을 보였으며, 13가지의 서로 다른 인플루엔자 아형에 결합할 수 있습니다. HA는 바이러스에 감염된 유정란의 ENT 체액에서 추출되었습니다. NP 단백질은 로딩 컨트롤입니다.음성 대조군은 감염되지 않은 계란의 Allantoic fluid이며, 양성 대조군은 NIBSC의 H1 표준 참조물질입니다. HA 단백질의 이동성에서 관찰된 차이는 단백질의 크기 또는 가공 단계의 차이로 인해 발생한 것으로 보입니다. 여기서 보여주듯, NA의 두 가지 보존된 epitope에 대한 항체 HCA-2 및 HCA-3는 NA의 9가지 모든 서브타입에 결합할 수 있었으며, Allantoic 또는 세포 단백질에 대해 매우 낮은 교차 반응성을 보였습니다. P 단백질 대조군은 패널 C에 나타나 있습니다. 양성 대조군은 A/New Caledonia/20/99의 RNA1을 첨가한 Allantoic fluid를 해당 항혈청으로 탐지한 것입니다. NP 단백질 대조군은 하단에 표시되어 있습니다.이 이미지는 인플루엔자 백신 표준 물질 및 백신 샘플 내 NA 항원의 정량 분석 결과이며, 이는 HA의 결과와 유사합니다. 밀도 분석 결과, 슬롯 블롯(slot blot)을 통해 백신 표준 물질의 다양한 희석액에서 NA 항원을 검출하여 얻은 신호 강도는 NA 농도에 비례하는 것으로 나타났습니다. 이 절차를 수행할 때, 침전물을 용해하고 슬롯에서 적절한 배수가 이루어지도록 백신 샘플을 전처리하는 것이 중요합니다.웰 간의 샘플 누출을 방지하기 위해 세심한 주의를 기울여야 합니다. 새로운 항체를 사용하여 검출할 때, 배경 신호를 최소화하면서 이상적인 강도의 선명한 신호를 얻기 위해서는 항체 희석 배수와 배양 시간의 최적화가 필요할 수 있습니다. 이 기술은 인플루엔자 백신 연구 분야의 과학자들에게 새로운 길을 열어주었습니다.HA 및 NA 항원의 향후 추가 정량 분석. 이 영상을 시청한 후에는 균주 특이적 항체를 사용하지 않고 간단한 분석법을 통해 인플루엔자 바이러스의 주요 표면 단백질을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

quantitative-analyses-all-influenza-type-viral-hemagglutinins

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 &lt;10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

이 비디오는 중화 인플루엔자 바이러스 단클론 항체의 탈출 변종을 생성하는 기술을 보여줍니다. 항체 중화 바이러스 현탁액을 배아 계란에 주입하여 탈출 변이체를 선택적으로 증식시킵니다. 그 결과 주로 탈출 변이체의 바이러스 집단이 발생하며, 이는 Hemagglutination 분석을 통해 확인되었습니다.

중화 항체에 대한 인플루엔자 바이러스 탈출 변이의 생성

이 동영상은 혈청 샘플에서 인플루엔자 뉴라미니다아제(NA) 억제 항체 역가를 측정하는 분석을 보여줍니다. NA에 대한 항체를 포함하는 혈청 샘플을 페투인(fetuin)으로 코팅된 마이크로웰 플레이트에 첨가합니다. 바이러스를 추가하면 항체가 바이러스 NA가 fetuin을 쪼개고 갈락토오스 부분을 노출시키는 것을 방지합니다. 그런 다음 과산화효소(peroxidase-conjugated lectin)가 첨가되어 노출된 갈락토스에 결합합니다. NA 억제 항체 역가는 비색 테스트를 사용하여 측정되며, 여기서 과산화효소 기질은 고정된 렉틴 접합 과산화효소에 의해 절단되어 색상을 생성합니다.

인플루엔자 뉴라미니다아제 억제 항체 역가를 측정하기 위한 분석

인쇄된 글라이칸 마이크로어레이 전략을 사용하여 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 열성 및 시알산 함유 수용체에 대한 특이성을 분석하기 위해 기존의 96웰 플레이트 분석을 소형화했습니다.

인플루엔자 바이러스 Hemagglutinins의 결합력 및 특이도를 평가하기위한 소형화 글리 칸 마이크로 어레이 분석

혈청에서 인플루엔자 뉴라미니다아제(NA) 억제 항체 역가를 측정하기 위한 효소 결합 렉틴 분석법(ELLA)을 설명합니다. 이 분석은 땅콩 응집소를 사용하여 NA가 fetuin으로 코팅된 96웰 플레이트에서 시알산을 제거할 때 접근할 수 있는 갈락토오스 잔류물을 정량화합니다.

효소 결합 렉틴 분석에 의해 인플루엔자 뉴 라미니다 아제 억제 항체가를 측정

이 연구는 설명   영상 기반의 마이크로 중화 분석은 바이러스의 항원 성 관계를 분석합니다. 이 프로토콜은 평판 스캐너를 사용하고 적정, 적정 정량, 중화, 중화 정량 등 4 단계가있다. 분석은 현재 순환 인플루엔자 A (H1N1) pdm09, A (H3N2)와 B 바이러스와 함께 잘 작동합니다.

정량적 마이크로 중화 분석의 최적화

우리는 항 바이러스의 뉴 라미니다 제 억제제 클래스 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 감수성을 평가하는 표현형 형광 계 뉴 라미 억제 분석의 사용을 설명한다.

형광 기반의 뉴 라미니다 아제 억제 분석은 항 바이러스제의 뉴 라미니다 아제 억제제 클래스에 인플루엔자 바이러스의 감수성을 평가하기 위해

제시 프로토콜 인플루엔자 백신 받는 사람 혈 청 샘플에서 인플루엔자-특정 항 체 titers 척도를 hemagglutination 억제 시험을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 첫 번째 분석 결과 hemagglutination에 의해 최적의 바이러스 성 항 원 농도를 결정합니다. 두 번째 분석 결과 hemagglutination 저해 하 여 인플루엔자-특정 항 체 titers 단정.

인플루엔자-특정 항 체 Titers 계량에 최적화 된 Hemagglutination 억제 (HI) 분석 결과

우리는 우리가 대상으로 인플루엔자 A 바이러스의 바이러스 성 조류 인간 또는 murine 단일 클론 항 체의 바인딩을에 필요한 중요 한 잔류물을 식별 하는 방법을 설명 합니다. 프로토콜은 다른 바이러스 표면 glycoproteins 그리고 그들의 해당 중화 항 체에 적용할 수 있습니다.

인플루엔자 바이러스 단일 클론 항 체를 중화의 탈출 변종의 생성

인플루엔자 중화 항 체는 인플루엔자 감염의 보호와 연관. Microneutralization 분석 실험 인간 혈 청의 중화 항 체를 측정 하 고 자주 독감 인간의 혈 청 학에 대 한 사용 됩니다. 인플루엔자 예방 접종 또는 감염 다음 현대 3C.2a 및 3C.3a A(H3N2) 바이러스 중화 항 체 titers 측정 MDCK-SIAT1 세포를 사용 하 여 microneutralization 분석 결과 설명 합니다.

사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 Microneutralization에 의해 인간의 세라에 A(H3N2) 바이러스를 중화

우리는 다른 바이러스 긴장에서 250개 이상의 항원에 대하여 다중 항체 이소타입을 위한 혈청을 동시에 조사하기 위하여 니트로셀룰로오스 코팅된 슬라이드에 인플루엔자 항원을 인쇄해서 건설된 단백질 마이크로어레이를 이용하기 위한 프로토콜을 제시합니다, 이렇게 바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭의 측정을 허용.

바이러스 특수형에 걸쳐 혈청 항체의 폭을 측정하기 위해 인플루엔자 항원 마이크로어레이의 사용

학습하세요 슬롯 블롯 기법을 활용한 보편 항체를 이용한 인플루엔자 바이러스 HA와 NA의 정량 분석 방법을. 이 기술은 백신 개발 및 바이러스 연구에 필수적인 단백질 정량화에 활용됩니다.

모든 독감의 양적 분석 간단한 슬롯 얼룩 Assays에서 유니버설 항체를 사용하는 바이러스성 Hemagglutinins 및 Neuraminidases를 입력하십시오

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