Name: 형광 이미징을위한 절연 척추 Photoreceptor 세포를 생활 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 학습하세요 형광 이미징을 위한 단일 살아있는 광수용체 세포 분리법을 다양한 척추동물에서 적용하는 방법을. 이 기법은 세포 대사 및 신호전달의 실시간 변화를 관찰하여 신경과학 및 세포생물학 연구를 발전시킵니다.

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1. Sylgard 덮인 요리, 실험 챔버 및 면도날의 준비 <ol><li> Sylgard의 엘라스토머 코팅 35mm 팰컨 배양 접시가 하나의 photoreceptor 세포를 얻기 위해 외딴 망막의 적절한 자르고 필요합니다. 탄성체는 공급 업체의 지침과 소량이 계층과의 엉덩이를 커버하기 위해 각각의 그릇에 부어에 따라 준비가되어 있습니다. 요리는 코팅 후 커버 교체하고 그들을 저장합니다. 몇 일 시간에 탄성이 견고하고 요리를 준비하고 있습니다. </li><li> 그들이 이미징 실험 과정 동안 고정되도록 절연 photoreceptors은 실험 챔버의 바닥에 붙어해야합니다. 이것은 폴리 - L - 라이신 또는 폴리 - L - ornithine로 코팅하여 실의 바닥을 달성입니다. 챔버 당 하나의 하나의 0.01 % 용액 200 μL를 추가하고, 먼지에서 보호하기 위해 종이 타월로 챔버 스를 커버. 솔루션은 건조 후, 닫힌 상​​자에 증류수 및 저장과 실 씻으십시오. 이주 이내에 사용하십시오. </li><li> 실험의 끝에 회의소를 청소하려면, 석유 침지 렌즈와 세포 부스러기로부터 기름을 제거하기 위해 100 % 에탄올과 그들을 씻으십시오. 세포 파편을 제거하려면, 면화 - 스쳐 applicators을 사용하여 조심스럽게 챔버의 바닥을 씻어. 후, 증류수로 세척하고 다시 코팅하기 전에 챔버 스가 건조하게. </li><li> 금속 커터와 함께 작은 조각 (8 일 블레이드에서)에 양날 면도날 컷. </li></ol> 2. 솔루션의 준비 <ol><li> 솔루션의 구성은 종류에 따라 다릅니다. 양서류 들어, 링어가 (mmol / L)을 가지고 : 110 NaCl, 2.5 KCl, 1.6 MgCl 2, 1 CaCl 2, 5 HEPES, 산도 = 7.55 있습니다. 산도는 NaOH와 최종 값을 조정해야합니다. 포유류의 경우 링어가 (mmol / L)을 가지고 : 130 NaCl, 5 KCl, 0.5 MgCl 2, 2 CaCl 2, 25 hemisodium - HEPES, 산도 = 7.40 있습니다. 링어의 솔루션은 몇 달 동안 실온에서 잘 밀봉 보관하실 수 있습니다. </li><li> 박테리아 성장을 피하기 위해 -20 ° C에서 보관 주식 포도당 용액, 1 몰 / L,. </li><li> 실험 당일, 5 mmol / L.의 최종 농도 링어의 솔루션으로 포도당을 추가 하루의 끝에서, 링어의 그것이 박테리아를 성장 있기 때문에 포도당이 포함된 폐기하십시오. </li></ol> 3. 망막의 분리 <ol><li> 망막의 적절한 절단을 위해 그것은 동물이 희생되기 전에 최소한 2-3시간에 대한 어두운 적응하는 것이 중요합니다. 동물은 어두운 방에 적당한 통풍이 컨테이너에 어두운 적응해야합니다. </li><li> 절반 링어의 솔루션을 가진 두 개의 35mm 페트리 요리를 입력합니다. </li><li> 희미한 붉은 불빛 아래에있는 동물을 희생하고 눈을 제거합니다. 그 후, 모든 절차는 해부 현미경 또는 비디오 모니터와 카메라를 사용하여 적외선에 따라 수행됩니다. </li><li> 눈 바깥 표면으로부터 남은 조직을 제거합니다. 잘라 앞쪽에 부분을 제거한 후, 링어의 가득 배양 접시 중 하나에 세안 컵을 전송하기만하면됩니다. </li><li> 유리체를 제거하고 신중하게 떨어져 곤란이나 첨부 파일을 절단하여 세안 컵의 나머지 부분에서 망막을 분리. 부드럽게 망막을 채취해서 세안 컵에서 완전히 분리. </li><li> 플라스틱 전송 피펫 두 번째 페트리 접시에 망막을 전송합니다. 빛을 꽉 상자에서 망막을 포함하고있는 음식 보관하십시오. </li></ol> 4. 단일 photoreceptor 세포의 분리 <ol><li> 모든 절차는 적외선에 따라 수행됩니다. 망막의 작은 조각을 잘라 Sylgard 덮인 요리에 플라스틱 피펫으로 전송합니다. 망막의 조각을 포함하고있는 솔루션의 볼륨은 250 μL에 대해해야합니다. </li><li> 블레이드 홀더와 면도날의 작은 부분을 잡고 - 블레이드의 가장자리는 홀더에 약 45 °의 각도로해야합니다. Sylgard 계층에 대한 망막의 조각을 평평하게하고 Sylgard 계층에 붙어 유지하면서 날개가 잘게 망막의 조각을 잘라 사용합니다. </li><li> 실험 챔버에 세포를 포함하는 솔루션을 200 μL를 전송 - Sylgard 덮인 접시에 망막의 나머지 조각을 두십시오. 빛을 꽉 상자에서 분리된 세포와 챔버 보관하십시오. </li><li> 링어의로부터 2-3 ML를 추가 후, 해결하기 위해 세포를 10 분 기다립니다. 이 단계에서 분리된 세포는 염색 로딩 프로토콜에 따라 특정 형광 염료 (예 : Fura - 2)로 로드할 수 있습니다. </li><li> 세포는 현재 실험에 대한 현미경 스테이지로 이동하실 수 있습니다. </li></ol> 5. 형광 이미징 <ol><li> epifluorescence 현미경의 무대에 챔버를 전송합니다. 조정 솔루션 재관류, 온도 프로브, 적외선 조명 등 </li><li> 커튼을 닫고 실험을 시작합니다. 현미경 케이지 내부의 적외선 켜고, 실험 챔버의 하단에 초점을, 그리고 세포를 찾기 위해 무대를 이동합니다. </li></ol> 6. 대표 결과S : 그림. 1 도롱뇽 (Ambystoma tigrinum) 망막에서이 프로토콜을 취득한 건강한 고립로드 앤드 콘 photoreceptors의 형태를 보여줍니다. 샐러맨더 세포 때문에 그들의 큰 크기와 망막의 분리 후 몇 시간 동안 생존 능력의 단일 세포 형광 이미징 연구에 대한 광범위하게 사용되었습니다. 또한, 샐러맨더 망막에서 하나는 정기적으로 막대와 원뿔 photoreceptors 모두를 얻을 수 있습니다. 세포의 건강에 중요한 기준이 손상 타원체 (그림 1), mitochondria가 집중하고있는 세포의 일부의 존재입니다. 세포 DAPI 광학에 따라 볼 때, mitochondria의 농도는 NADH의 존재로 인해 강한 형광 신호 (그림 2) 제공합니다. 손상 타원체의 부족 실험. 그림 일반적으로 부적당 손상된 세포의 기호입니다. 3 부어 세포 기관과 응축 핵으로 손상된 샐러맨더로드 photoreceptor를 보여줍니다. 이러한 세포는 DAPI 광학에 따라 훨씬 낮은 형광 디스플레이지만, 타원체 영역 (산화 플라빈의 세포핵과 flavoproteins에서 발생)에 강력한 유행 신호를 보여 FITC 광학 아래의 조회. 격리된 photoreceptors의 건강을위한 또 다른 기준은 빛의 자극에 의해 즉시 자신의 외부 세그먼트에있는 모든 트랜스 레티놀을 (비타민 A) 생성하는 능력이 있습니다. 비타민 A의 생성은 그대로 대사 기계에 의존 NADPH의 상당한 양의 필요합니다. 그림 4와 5는 비타민 그대로 개구리와 마우스 막대의 photoreceptors 각각의 바깥쪽 세그먼트의 형성을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 건강한 하나의 막대와 원뿔 photoreceptors. 세포는 호랑이 샐러맨더 망막으로부터 격리되었다. Phototransduction은 외부 세그먼트에서 일어나는와 타원체는 밀도가 mitochondria들이 즐비합니다. 로즈는 희미한 빛 비전, 밝은 빛이 비전에 대한 콘 책임이 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 샐러맨더로드 및 원뿔형 생활의 형광. 이들은 각각 ellipsoids에 강한 NADH의 형광없이 중요한 비타민들은 바깥 세그먼트에서 형광을 보여주는, 어두운 조정 세포 수 있습니다. 형광 이미지의 촬영은 어두운 - 적응 기간 후 가시 광선에 처음으로 노출을 나타냅니다. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 손상된 샐러맨더로드 photoreceptor. 부어 세포 본체와 응축 핵이 손상을 나타내는 있습니다. 세포는 산화와 최소한의 NADH 신호 (DAPI 광학 장치)가있다지만, 훨씬 강력한 유행 신호 (FITC 광학)입니다. <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. NADH와 레티놀과 함께 개구리 막대. 이것은 타원체 지역에서 강력한 NADH의 형광을 보여주는 건강한 개구리 막대의 photoreceptor입니다. 빛의 노출 전에 바깥 부문 최소한의 형광이 있습니다. 빛의 노출에 따라, 때문에 비타민 A의 형성에 외부 세그먼트 형광의 상당한 증가가 <img src="/files/ftp_upload/2789/2789fig5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 레티놀과 마우스 막대. 이것은 마우스 막대의 photoreceptors의 타원체 영역 강한 형광 신호를 표시하지 비타민 A의 형성에 의한 빛의 노출 후 상당한 외부 세그먼트 형광을 보여주는 건강한 마우스 막대의 photoreceptor입니다.

<ol><li>Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Counting+Photons%3A+Trials+and+Trends+in+Vertebrate+Visual+Transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction.</a> Neuron. 48, 387-401 (2005).</li>
<li>Ebrey, T., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Vertebrate Photoreceptors.</a> Prog Retin Eye Res. 20, 49-94 (2001).</li>
<li>Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+in+Vertebrate+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Adaptation in Vertebrate Photoreceptors.</a> Physiol Rev. 81, 117-151 (2001).</li>
<li>Palczewski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+Protein-Coupled+Receptor+Rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">G Protein-Coupled Receptor Rhodopsin.</a> Annu Rev Biochem. 75, 743-767 (2006).</li>
<li>Saari, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+Visual+Pigment+Regeneration%3A+The+Friedenwald+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).</li>
<li>Lamb, T. D., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dark+Adaptation+and+the+Retinoid+Cycle+of+Vision%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision.</a> Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).</li>
<li>Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Photon+Microscopy%3A+Shedding+Light+on+the+Chemistry+of+Vision%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision.</a> Biochemistry. 46, 9674-9684 (2007).</li>
<li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleached+Pigment+Produces+a+Maintained+Decrease+in+Outer+Segment+Ca2%2B+in+Salamander+Rods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods.</a> J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).</li>
<li>Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Dependent+Changes+in+Outer+Segment+Free-Ca2%2B+Concentration+in+Salamander+Cone+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).</li>
<li>Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+the+Rods+of+Wild-Type+and+Transducin+Knock-out+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice.</a> J Physiol. 542, 843-854 (2002).</li>
<li>Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Measurement+of+Current+and+Calcium+in+the+Ultraviolet-Sensitive+Cones+of+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish.</a> J Physiol. 579, 15-27 (2007).</li>
<li>Matthews, H. R., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Spot+Confocal+Technique+to+Measure+Cytoplasmic+Calcium+Concentration+in+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors.</a> Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).</li>
<li>Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+Calcium+Stores+Regulates+Calcium+Influx+and+Signal+Transmission+in+Rod+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors.</a> J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).</li>
<li>Krizaj, D., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+Calcium+Extrusion+Mechanisms+in+the+Outer+and+Inner+Segments+of+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors.</a> Neuron. 21, 249-256 (1998).</li>
<li>Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+Magnesium+Concentration+in+Salamander+Photoreceptor+Outer+Segments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments.</a> J Physiol. 553, 125-135 (2003).</li>
<li>Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Behavior+of+Rod+Photoreceptor+Disks%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks.</a> Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).</li>
<li>Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+Microfluorometric+Studies+of+Reduction+and+Clearance+of+Retinal+in+Bleached+Rod+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors.</a> J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).</li>
<li>Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Cycle%3A+Dependence+of+Retinol+Production+and+Removal+on+Photoproduct+Decay+and+Cell+Morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology.</a> J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).</li>
<li>Koutalos, Y., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluorometric+Measurement+of+the+Formation+of+All-Trans-Retinol+in+the+Outer+Segments+of+Single+Isolated+Vertebrate+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors.</a> Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).</li>
<li>Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphotoreceptor+Retinoid-Binding+Protein+Is+the+Physiologically+Relevant+Carrier+That+Removes+Retinol+from+Rod+Photoreceptor+Outer+Segments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments.</a> Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).</li>
<li>Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Cycle+and+Its+Metabolic+Support+in+Gecko+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors.</a> Vision Res. 47, 363-374 (2007).</li>
<li>Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+All-Trans+Retinol+after+Visual+Pigment+Bleaching+in+Mouse+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

건강 분리된 세포가 얻은 정보가 아닌 경우, 문제는 망막의 분리 또는 건강 또는 그 돼지와도 자리잡고 있습니다. 일반적으로, 눈 및 유리체의 전면을 제거 후, ​​망막이 쉽게 안료 상피를 리프트. 그렇지 않으면, 세안 컵의 주변부터 해제로 껍질보십시오. 아직 분리하기 어려운 경우에는 가능성이 가능성이 동물은 시간의 적절한 기간 동안 어두운 적응되지 않았음을, 또는 빨간 불빛이 너무 밝은 있습니다. 동물에 대한 적절한 어두운 적응하고, 희미한 붉은 불빛을 보장합니다. 망막에있는 막대의 photoreceptors의 존재는 고립 망막의 색상을 선택하여 쉽게 ascertained 수 있습니다 망막의 작은 조각을 잘라 다음 방 불빛 아래에서 볼 수있는 별도의 페트리 접시에 그것을 전송할 수 있습니다. 망막 포함 막대의 photoreceptors의 조각 신속하게 밝은 붉은 색 (rhodopsin로 인해)은 페이드 있습니다. 무색 조각이 rhodopsin의 부재를 나타내는하고, 따라서 막대의 photoreceptors의 것입니다. 이 중 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 어두운 방 (100-150피트 2) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 레드 불 19 </td><td></td><td></td><td> 온라인 상점 </td></tr><tr><td> 적외선 광원 및 적외선 이미지 뷰어 </td><td> FJW 광학 시스템, 주식 회사 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 현미경 19 해부 </td><td></td><td></td><td> 적외선 시청자와 함께 복 </td></tr><tr><td> Epifluorescence 현미경은 빛을 꽉 케이지 19 동봉된 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 해부 도구 (가위, 집게, 블레이드 홀더) </td><td> Roboz 또는 파인 과학 도구 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sylgard의 엘라스토머 </td><td> 에식스 (샬럿, NC) </td><td> Sylgard 184 엘라스토머 키트 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 - L - ornithine (0.01 %) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 - L - 라이신 (0.1 %) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P8920 </td><td> 0.01 %로 희석 </td></tr><tr><td> 실험 챔버 </td><td> 워너 인 스트 루먼트 (햄든, CT) </td><td> D3512P </td><td></td></tr><tr><td> 배양 접시, 플라스틱 pipettes </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

형광 이미징을위한 절연 척추 photoreceptor 세포를 생활 준비

Preparation of Living Isolated Vertebrate Photoreceptor Cells for Fluorescence Imaging

척추 망막에서 phototransduction, 전기 신호에 빛의 변환,로드 앤드 원추 photoreceptor 세포 1-4에 의해 수행됩니다. 로드의 photoreceptors는 희미한 빛, 밝은 빛에서 원뿔의 비전에 대한 책임이 있습니다. Phototransduction는 photoreceptor 세포, 영상 안료, 기본 조명 감지기의 높은 농도를 포함하는 전문 구역의 바깥 부분에서 이루어진다. 망막 CIS, 단백질, 옵신에 첨부된 - 시각 색소는 발색단, 11로 구성되어 있습니다. 시각 색소에 흡수 광자는 11 발색단을 isomerizes - CIS를 모든 트랜스 있습니다. 이 photoisomerization는 막 잠재력에 변화 culminating, 그리고 전기 신호에 빛의 자극의 전달에 대한 데리고 반응의 폭포를 시작 시각 색소의 conformational 변화를 제공합니다. 빛의 자극에서 세포의 복구 빛으로 활성 중간체의 비활성화 및 멤브레인 잠재력의 회복을 포함한다. CA 2 +는 phototransduction에 관련된 효소의 몇 가지의 활동을 modulates, 그 농도가 빛의 자극에 따라 줄어 듭니다. 이러한 방법으로, CA 2 + 배경 빛으로 자극하고 적응에서 세포의 회복에 중요한 역할을합니다. 모든 트랜스 5-7로 CIS 발색단 - 복구 프로세스의 또 다른 필수적인 부분은 11 photoisomerization로 빛을 감지하는 동안 파괴되고있는 시각 색소의 재생이다. 이 중생은 APO - 단백질 옵신 뒤에두고, photoactivated 안료의 모든 트랜스 망막의 릴리스와 함께 시작됩니다. 출시된 모든 트랜스 망막이 빠르게 모든 트랜스 레티놀과 옵신에 NADPH를 이용한 반응 감소 것은 신선한 11 결합 - CIS 망막은 시각 색소를 개혁하기 위해 외부 세그먼트에 왔어요. 모든 트랜스 레티놀은 다음 전문 캐리어 Interphotoreceptor의 Retinoid 바인딩 단백질 (IRBP)에 의해 외부 세그먼트와 인접 세포 밖으로 전송됩니다. 단일 photoreceptor 세포의 형광 이미지들은 생리 및 세포 생물학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. CA 2 +에 민감한 형광 염료 8-12뿐만 아니라 내부 세그먼트 칼슘 2의 역할 칼슘 2 + 점포 조명에 자세히 외부 세그먼트 칼슘 2 + 변화와 응답 사이의 상호 작용을 검사하는 데 사용할 수있는 + 항상성 13,14 . 형광 염료는 MG 2 측정에 사용할 수 있습니다 + 농도 15, 산도, 그리고 수성 및 멤브레인 구획 16 추적기로. 마지막으로, 모든 트랜스 레티놀 (비타민 A)의 본질적인 형광은 단일 photoreceptor 세포 17-19 년에 형성 및 제거의 속도론을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.

방법은 형광 이미징에 대해 서로 다른 척추 동물에서 하나의 생활 photoreceptor 세포의 준비를 위해 설명되어 있습니다. 방법은 이미지와 같은 NADH이나 비타민 A와 같은 내생 fluorophores의 형광을 위해 사용하거나, CA에 민감한 exogenously 추가 형광 염료의 수<sup&gt; 2 +</sup&gt; 또는 기타 요인.

형광 이미징을위한 절연 척추 Photoreceptor 세포를 생활 준비

척추동물의 망막에서 빛을 전기 신호로 변환하는 과정인 광전달(phototransduction)은 간상 및 원추 광수용체 세포에 의해 수행됩니다1-4. ...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 형광 이미징을 위해 살아있는 단일 광수용기 세포를 준비하는 것입니다. 이는 먼저 암적응된 망막을 분리함으로써 수행됩니다. 절차의 두 번째 단계는 살아있는 단일 광수용기 세포를 분리하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 세포를 실험 챔버로 옮기는 것입니다. 네 번째 단계는 챔버를 현미경 스테이지 위에 놓는 것입니다. 절차의 마지막 단계는 건강한 세포를 선택하는 것입니다. 형광 이미징을 통해 최종적으로 세포 형광 이미징을 통한 세포 대사, 신호 전달, 세포 내 수송 또는 산화의 실시간 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 독성 부산물의 제거와 빛의 감지 등 척추동물 광수용체 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 질환 마우스 모델의 광수용체 세포 연구에 활용될 수 있으므로, 망막 질환 치료로 그 응용 범위가 확장됩니다. 프로토콜을 시작하기 전에 다양한 재료를 미리 준비해야 합니다.먼저, 엘라스토머가 경화될 수 있도록 며칠 전에 디쉬를 코팅할 정도의 적당량의 cigar 엘라스토머를 도포한 35 millimeter Falcon 페트리 디쉬를 준비해야 합니다. 실험 챔버는 직경 12 millimeter의 유리 바닥이 있는 변형된 35 millimeter 페트리 디쉬입니다. 실험 챔버는 세포가 부착될 수 있어야 하므로, 0.01% poly L lysine 또는 poly L ornithine 200 microliters를 챔버 바닥에 처리하여 세포를 고정시킵니다.그 다음 키친 타월로 덮어 몇 시간 동안 건조시킵니다. 챔버가 건조되면 증류수로 세척하여 밀폐 용기에 보관합니다. 실험 후에는 100% ethanol로 세척하고 면봉을 사용하여 찌꺼기를 조심스럽게 닦아내어 챔버를 세척합니다.그 후, 챔버를 증류수로 세척하십시오. 챔버를 건조시킨 다음 다시 코팅하십시오. 다음으로, 금속 커터를 사용하여 양날 면도날을 각각 8개의 작은 날로 잘라 준비하십시오.마지막으로, 광수용체 세포를 추출할 종에 적합한 생리식염수를 준비하되 포도당을 첨가하지 마십시오. 이 생리식염수는 밀폐된 병에 넣어 몇 달 동안 보관할 수 있습니다. 실험 당일에는 마우스를 희생시키기 전에 암적응을 시켜야 합니다. 암실에서 적응시키는 것이 가장 좋습니다.동물을 암실에서 하룻밤 동안 적응시킨 후 야간 주기 끝에 희생시킵니다. 다만, 대기하는 동안 동물을 최소 2시간 동안 어둠 속에 두는 것으로도

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

이 비디오에서는 여러 가지 빛깔의 공촛점 시간 저속 이미징 및 타겟 세포 절제에 대한 기술이 제공됩니다. 시간 저속 영상은 관심의 여러 세포 유형의 동작을 모니터하는 데...

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

이 문서는 해부하다와 마우스에서 분리된 망막 준비에서 기록하는 방법에 대한 설명을 제공합니다. 특히, 우리는 찬란 표시 신경절 세포 인구의 빛을 반응을 기록하고 이후 식별하고 그 형태를 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

유전적으로 망막 신경절 라벨 셀에서 라이트 응답을 기록하기 위해 절연 망막 준비

이 문서는 그대로 마우스 망막에서 찬란 태그의 연결 인구에서 각각의 세포의 녹음을 묘사. 두 광자 여기 적외선을 사용하여 transgenetically 라벨이 세포들은 빛의 반응, 수용 필드 속성 및 형태학을 연구하기 위해 패치 - 클램프 녹음 대상으로했다.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

실시간 이미징 배아 조직은 오랜 기간 동안 도전합니다. 여기에서 우리는 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 오랜 기간 동안 여자가 척수의 세포와 하위 세포 변화를 감시하기위한 분석을 제시. 이 기술은 신경계와 개발 배아의 다른 지역에 맞게 조정 할 수 있습니다.

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

손상된 망막막 무결성 시각화를 위한 AAV 매개 유전자 전달

출처: Laboissonniere, et. al입니다. 망막 신경절 세포의 정의된 부분 집합의 단일 세포 RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).   이 비디오는 형질전환 마우스 망막에서 망막 신경절 세포(RGC) 아형을 식별하는 형광 추적 기술을 보여줍니다. 이 프로세스에는 기록 챔버에 분리된 망막을 고정하고, 산소 관류로 세포 생존력을 유지하고, 추적자가 있는 피펫을 사용하여 형광 표지된 망막 신경절 세포를 표적으로 하는 것이 포함됩니다. 이 방법은 수지상 형태 및 성층화를 분석함으로써 별개의 망막 신경절 세포 아형을 분류할 수 있습니다.

Identification of Mouse Retinal Ganglion cell subtypes via fluorescent tracing (형광 추적을 통한 마우스 망막 신경절 세포 아형의 식별)

여기에서, 우리는 단클론 성 전 사체의 단리 및 후속 특성 규명을 위해 연결 세포 유형을 분류하기위한 조합 접근법을 제시한다. 이 프로토콜은 성공적인 RNA 시퀀싱 (RNA-Seq)을위한 샘플 준비를 최적화하고 세포 다양성의 강화 된 이해를 위해 특별히 고안된 방법을 설명합니다.

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

제브라 망막 재생이 거의 고정 된 망막을 이용하여 연구되었다. 그러나, interkinetic 핵 마이그레이션 동적 프로세스는 재생 반응 중에 발생 및 기본 메커니즘을 조사하기 위해 라이브 세포 이미징을 필요로한다. 여기, 우리는 광자 현미경을 사용하여 Interkinetic 핵 마이그레이션 (INM) 실시간을 모니터링하는 문화 및 이미징 조건을 설명합니다.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

망막 조직을 이미징 전통적인 생 화 확 적인 방법에서 수집 될 수 없는 단일 셀 정보를 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜 confocal 영상에 대 한 제 브라에서 망막 조각의 준비를 설명합니다. 형광 유전자 센서를 인코딩 또는 표시기 염료 별개 망막 세포 유형에 수많은 생물 학적 과정의 시각화를 허용.

Ex Vivo 실험 이미징에 대 한 성인 제 브라에서 준비 신선한 망막 조각

이 프로토콜은 신경계 발달 중H2 O2의생리적 신호 역할을 평가하기 위한 배양 된 제브라피시 뉴런 및 애벌레에서 유전으로 인코딩 된 과산화수소 (H2O2)-바이오센서의 사용을 설명합니다. 그것은 다른 세포 유형에 적용 하 고 일반적인 개발에 반응성 산소 종 (ROS)를 공부 하는 실험 치료와 함께 수정 될 수 있습니다.

신경 발달 도중 ROS 살아있는 세포 화상 진찰

학습하세요 형광 이미징을 위한 단일 살아있는 광수용체 세포 분리법을 다양한 척추동물에서 적용하는 방법을. 이 기법은 세포 대사 및 신호전달의 실시간 변화를 관찰하여 신경과학 및 세포생물학 연구를 발전시킵니다.

형광 이미징을위한 절연 척추 Photoreceptor 세포를 생활 준비

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