암 세포에 의해 내피 세포 단층의 침략을 측정하는 실시간 전기 임피던스 기반 기술

본 영상은 실시간 전기임피던스 기반 기법을 이용하여 암세포의 내피세포 단층(endothelial cell monolayer)의 침입을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 첫째, VE라고 하는 인간 제대 정맥 내피 세포는 웰 바닥에 금 전극으로 코팅된 16개의 웰 EPL에 앉아 있습니다. 융합을 생성하기 위해 VE에 부착되어 HVAC 단층을 침입하여 내피 세포 접합을 방해하는 단층 암세포가 추가되며, 세포로 덮인 웰 바닥의 전체 면적에 따라 달라지는 임피던스 판독값이 획득됩니다.

그런 다음 전기 임피던스의 변화에 따라 침입 범위를 결정할 수 있습니다. 이 기법 또는 보이드 챔버 및 METROGEL 분석과 같은 기존 방법의 주요 장점은 내피 세포 종양 세포 상호 작용이 생체 내 전이 과정을 더 밀접하게 모방하고 데이터를 실시간으로 얻을 수 있으며 다른 방법의 종말점 분석과 달리 더 쉽게 정량화할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 암세포 침입에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

또한 면역 체계에서 세포 세포 상호 작용을 조사하는 것과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 또한, UX 세포의 성장을 관찰하는 실험의 초기 단계는 추가 침입 단계 없이 모든 세포주의 세포 증식을 평가하는 데 사용할 수 있으며, 이는 제 연구실의 Rahim 대학원생이 현장을 운영할 것임을 보여줍니다. 이 프로토콜의 모든 단계는 조직 배양 후드에서 멸균 상태에서 수행해야 합니다.

이 실험에 사용된 Xcel 시스템은 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에 영구적으로 보관되며, 처음 사용할 때 이 기기 전용으로 사용됩니다. 기기는 새로운 온도 및 습도 환경에 적응하기 위해 최소 16시간 동안 인큐베이터에 그대로 두어야 합니다. 다음으로, 섭씨 37도에서 1시간 동안 0.1% 젤라틴으로 코팅하여 EPL 16을 준비합니다.

플레이트가 코팅되면 PBS로 한 번 세척하십시오. 그런 다음 100마이크로리터의 재구성된 e gm 2 매체를 추가하여 빈 판독을 수행합니다. 세포가 없는 상태에서 배경 임피던스를 측정합니다.

EPL을 컴퓨터의 Excel 에이전트 시스템에 배치합니다. 소프트웨어 창의 바탕 화면에 있는 RTCA 소프트웨어 아이콘을 클릭하여 Excel 에이전트 소프트웨어를 엽니다. 레이아웃 탭을 클릭하고 샘플이 포함된 웰을 선택합니다.

실시간 데이터 수집 빈도를 프로그래밍합니다. 일정 탭을 클릭한 다음 단계 추가 아이콘을 클릭하면 스윕이 판독 횟수를 나타내고 간격은 판독 사이의 시간 간격을 나타냅니다. 이들은 각각 1분과 1.00분으로 자동 설정됩니다.

이렇게 하면 시스템이 백그라운드 판독을 수행하도록 프로그래밍됩니다. 단계 추가를 클릭하고 스윕 상자에 300을 입력하고 간격 상자에 10분을 입력합니다. 이렇게 하면 최대 50시간 동안 임피던스 측정을 수행하도록 기기가 프로그래밍됩니다.

실험을 시작하려면 단계 시작 아이콘을 클릭합니다. 각 웰의 백그라운드 임피던스는 백그라운드 측정이 수행된 후에 측정됩니다. 창에 메시지가 표시됩니다.

다음 단계를 위한 준비가 되었으면 클릭하십시오. 시작할 다음 단계입니다. 이때, 세포를 첨가할 수 있고, 단층의 형성을 전술한 바와 같이 모니터링할 수 있다.

다음 섹션에서는 여기에 사용된 인간 제대 정맥, 내피 세포 또는 VE를 EGM 2개의 배지에서 배양하고 EGM 2개의 총알 키트로 재구성한 성장 인자 보충제 및 5% FBS 세포는 5% 이산화탄소가 존재하는 상태에서 섭씨 37도의 인큐베이터에서 유지해야 합니다. 실험 당일, 현미경으로 HUB E의 공동 유창성을 확인하십시오.세포는 계대 수가 낮아야 하며, 바람직하게는 6 이상 75% 미만이어야 하며, 트립신에 의해 세포를 단층으로 수확하는 색조를 생성하기 위해 유창해야 합니다. 세포가 플라스크에서 분리되면 트립신의 모든 흔적은 200G에서 원심분리로 제거해야 합니다. 스핀 후 PBS로 세포를 한 번 세척합니다.

그런 다음 세포를 다시 현탁시키고 e GM 2 매체를 2.5 배 10의 농도로 5 밀리리터 당 5 번째 세포로 재구성했습니다. 세포가 재현탁되면 EXOGEN 시스템에서 백그라운드 보정된 EPL을 제거하고 플레이트에 이미 있는 100마이크로리터의 E GM 2개 배지에 100마이크로리터의 HX 현탁액을 추가합니다. 즉시 EPL을 Excel 시스템 셀 분석기에 넣습니다.

소프트웨어 창에서 시작 단계 버튼을 클릭하여 임피던스 판독값을 수집하기 시작합니다. 내피 세포가 자라도록 합니다. 시스템은 10분마다 임피던스 판독값을 계속 가져옵니다.

Uve는 파종 후 4-6시간 후에 세포 지수의 특징적인 일시적인 평탄화를 보인 후 16-18시간 후에 또 다른 안정화를 보입니다. 따라서 세포가 최소 18시간 동안 합류 단층을 형성하도록 하는 것이 중요합니다. 단층이 형성되면 침입 분석을 준비하기 위해 침입 세포를 추가할 때입니다.

침입하는 종양 세포를 준비합니다. 여기에는 골육종 세포가 사용됩니다. 트립신으로 세포를 수확하는 것으로 시작합니다.

200G에서 세포를 회전시키고 PPS로 한 번 세척하여 트립신의 모든 흔적을 제거합니다. 세척 reus 후, 10%FBS를 함유하는 RPMI 또는 DMEA 배지와 같은 종양 세포를 성장시키는 데 사용되는 배지에서 10의 최종 밀도에서 밀리리터당 5번째 세포의 최종 밀도가 1배인 동안 세포를 현탁시킵니다. 소프트웨어 창에서 일시 중지 단계 아이콘을 클릭하여 실험을 일시 중지합니다.

EPL을 제거하고 vac 단층에서 EGM 2 매체를 흡인합니다. 네 번째 세포에 1 곱하기 10을 포함하는 종양 세포 현탁액 100마이크로리터를 추가합니다. 일반적으로 내피 세포에 대한 1-2.5개의 종양 세포의 비율이 분석에 가장 적합합니다.

그러나 이 비율은 개별 세포주에 맞게 최적화할 수 있습니다. EPL을 인큐베이터의 Excel 에이전트 시스템에 다시 배치합니다. 계속 단계를 클릭하여 10분 간격으로 임피던스 판독값을 계속 수행합니다.

향후 6시간에서 12시간 동안 실시간으로 침공을 모니터링합니다. 세포 지수의 감소는 내피 접합부의 수축과 종양 세포의 침입에 의한 침투로 인해 발생합니다. 실험이 완료되면 엑세르겐 소프트웨어를 사용하여 침입하는 종양 세포가 추가된 시점으로 결과를 정규화합니다.

엑세르겐 소프트웨어는 이 비디오에서 볼 수 있듯이 엑세르겐 시스템에서 VEX를 배양하고 단층을 형성한 후 K 7 M 2 세포 또는 K 12 세포를 첨가하여 언제든지 정규화할 수 있도록 합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 세포 지수의 가파른 감소는 K 7 M 2 세포의 도입 후 몇 시간 이내에 발생합니다. K 7 M 2는 전이성이 높은 골육종 세포주입니다.

이 세포는 세포주의 침습적 특성을 설명하는 세포골격 링커 단백질 ene의 높은 수준을 발현합니다. 반면에 K 12 세포는 전이성이 적고 K 7 M 2 세포만큼 효율적으로 내피 단층을 통과할 수 없습니다. 이것은 여기에 표시된 것처럼 세포 지수의 덜 깊은 감소로 표시됩니다.

여기에 표시된 컨트롤은 uve 단층의 임피던스를 나타냅니다. 암세포가 없는 상태에서 실험은 세 번으로 수행되었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 내피 세포 단층을 생성하고 암세포로 단층을 도전하여 실시간으로 침입을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

HU XL 단층 형성과 관련된 실험의 초기 단계는 임피던스에 의한 세포 증식을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 2.