암 세포에 의해 내피 세포 단층의 침략을 측정하는 실시간 전기 임피던스 기반 기술

이 영상에서는 실시간 전기 임피던스 기반 기술을 사용하여 암세포에 의한 혈관내피세포 단일층의 침습을 모니터링하는 방법을 설명합니다. 먼저, VE로 지칭되는 인간 제대정맥 내피세포를 웰 바닥에 금 전극이 코팅된 16-웰 EPL에 배양합니다. 합성 단일층을 형성하기 위해 암세포를 첨가하면, 암세포가 VE에 부착되어 혈관내피세포 단일층을 침습하고 내피세포 접합부를 파괴합니다. 이후 세포가 덮고 있는 웰 바닥의 총 면적에 따라 달라지는 임피던스 측정값을 획득합니다.

그 후 전기 임피던스의 변화를 기반으로 침습 정도를 결정할 수 있습니다. 이 기술 또는 보이드 챔버(void chamber) 및 METROGEL 분석과 같은 기존 방법의 주요 장점은 내피 세포와 종양 세포 간의 상호작용이 체내 전이 과정을 더 밀접하게 모방하며, 다른 방법들의 엔드포인트 분석과 달리 데이터를 실시간으로 얻을 수 있고 정량화가 더 쉽다는 점입니다. 이 방법은 암세포 침습에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이는 면역 체계 내의 세포 간 상호작용 조사와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 또한, UX 세포의 성장을 관찰하는 실험 초기 단계는 추가적인 침습 단계 없이도 모든 세포주의 세포 증식을 평가하는 데 사용할 수 있으며, 본 절차는 저희 실험실의 대학원생인 site Rahim이 시연할 것입니다. 본 프로토콜의 모든 단계는 조직 배양 후드 내에서 무균 조건하에 수행되어야 합니다.

본 실험에 사용된 Xcel 시스템은 첫 사용 시 해당 기기 전용으로 37 °C, 5% CO2 배양기에 상시 보관합니다. 기기가 새로운 온도 및 습도 환경에 평형을 이룰 수 있도록 배양기에 최소 16시간 동안 두어야 합니다. 그 다음, Thence EPL 16을 0.1% gelatin으로 37 °C에서 1시간 동안 코팅하여 준비합니다.

플레이트 코팅이 완료되면 PBS로 한 번 세척합니다. 그 다음, 블랭크 측정을 위해 재구성된 e gm two 배지를 100 µL 첨가합니다. 이는 세포가 없는 상태에서의 배경 임피던스를 측정하기 위함입니다.

컴퓨터의 Excel agent 시스템에 EPL을 장착하십시오. 소프트웨어 창의 바탕 화면에 있는 RTCA 소프트웨어 아이콘을 클릭하여 Excel agent 소프트웨어를 실행하십시오. 레이아웃 탭을 클릭하고 샘플이 포함된 웰을 선택하십시오.

실시간 데이터 수집 빈도를 설정하려면 [schedule] 탭을 클릭한 다음 [add a step] 아이콘을 클릭하십시오. sweeps는 측정 횟수를 나타내며 intervals는 측정 간의 시간 간격을 나타냅니다. 이 값들은 각각 1과 1.00 minute로 자동 설정되어 있습니다.

이 단계는 시스템이 배경 측정을 수행하도록 설정하는 과정입니다. '단계 추가(add a step)'를 클릭하고 '스윕(sweeps)' 상자에 300을, '간격(intervals)' 상자에 10분(10 minutes)을 입력하십시오. 이렇게 하면 장비가 최대 50시간 동안 임피던스 측정을 수행하도록 설정됩니다.

실험을 시작하려면 단계 시작 아이콘을 클릭하십시오. 배경 측정이 수행된 후 각 웰의 배경 임피던스가 측정됩니다. 창에 메시지가 표시됩니다.

다음 단계를 위해 클릭하십시오. 다음 단계로 시작합니다. 이제 세포를 추가하고 설명된 대로 단층 형성을 모니터링할 수 있습니다.

다음 섹션에서는, 여기에 사용된 인간 제대정맥 내피세포(HUVEC)를 성장 인자 보충제가 포함된 EGM-2 불렛 키트로 재구성한 EGM-2 배지와 5% FBS에서 배양합니다. 세포는 5% CO₂가 포함된 37 °C 인큐베이터에서 유지해야 합니다. 실험 당일, 현미경으로 HUVEC의 합류도(confluency)를 확인하십시오. 세포는 낮은 계代(passage number)여야 하며, 가급적 6회 이하이고 합류도가 75% 미만이어야 합니다. 단층 세포층을 생성하기 위해 트립신으로 세포를 회수하십시오. 세포가 플라스크에서 분리되면, 200 ×g에서 원심분리하여 트립신의 모든 흔적을 제거해야 합니다. 원심분리 후, PBS로 세포를 한 번 세척하십시오.

그런 다음 세포와 재구성된 e GM two 배지를 2.5 × 10⁵ cells/mL 농도로 재현탁합니다. 세포 현탁이 완료되면, EXOGEN 시스템에서 백그라운드 보정된 EPL을 제거하고, 플레이트에 이미 들어 있는 100 µL의 E GM two 배지에 HX 현탁액 100 µL를 추가합니다. 즉시 EPL을 Excel 시스템 세포 분석기에 넣습니다.

소프트웨어 창의 시작 단계 버튼을 클릭하여 임피던스 측정값을 얻기 시작하십시오. 혈관 내피 세포가 성장하도록 둡니다. 시스템은 10분마다 지속적으로 임피던스 측정값을 기록합니다.

Uve 세포는 파종 후 4~6시간 후에 세포 지수(cell index)가 일시적으로 평탄해지는 특성을 보이며, 이후 16~18시간 후에 다시 안정화됩니다. 따라서 세포가 최소 18시간 동안 합성 단층(confluent monolayer)을 형성하도록 하는 것이 중요합니다. 단층이 형성되면, 침습 분석(invasion assay) 준비를 위해 침습 세포를 추가할 차례입니다.

침습성 종양 세포를 준비합니다. 여기서는 골육종 세포가 사용되었습니다. 먼저 트립신을 사용하여 세포를 회수합니다.

세포를 200 G에서 원심분리하고 PPS로 한 번 세척하여 트립신의 모든 흔적을 제거합니다. 세척 후, 종양 세포 배양에 사용된 RPMI 또는 10% FBS가 포함된 DMEA 배지와 같은 배지에서 최종 밀도가 1×10⁵ cells/mL가 되도록 세포를 현탁합니다. 소프트웨어 창의 일시 정지 단계 아이콘을 클릭하여 실험을 잠시 멈춥니다.

EPL을 제거하고 vac 단층에서 EGM two 배지를 흡입하여 제거합니다. 1×10⁴ cells를 포함하는 종양 세포 현탁액 100 µL를 첨가합니다. 일반적으로 이 분석에는 종양 세포와 내피 세포의 비율이 1:2.5일 때 가장 결과가 좋습니다.

하지만, 이 비율은 개별 세포주에 맞춰 최적화할 수 있습니다. EPL을 인큐베이터 내의 Excel agent 시스템에 다시 넣으십시오. 계속하기(continue) 단계를 클릭하여 10분 간격으로 임피던스 측정을 계속 진행합니다.

향후 6~12시간 동안 침습 과정을 실시간으로 모니터링하십시오. 내피 세포 접합부의 수축과 침습 종양 세포의 침투로 인해 세포 지수(cell index)가 감소하게 됩니다. 실험이 완료되면 exergen 소프트웨어를 사용하여 침습 종양 세포를 첨가한 시점을 기준으로 결과를 정규화하십시오.

exergen 소프트웨어를 사용하면 이 비디오에서 보여주는 것과 같이 VEX가 exergen 시스템에서 배양된 모든 시점으로 정규화할 수 있으며, 단층이 형성된 후 K seven M two 세포 또는 K 12 세포를 추가하였습니다. 여기서 보는 바와 같이, K seven M two 세포를 도입한 후 몇 시간 이내에 세포 지수(cell index)가 급격히 감소합니다. K seven M two는 전이성이 매우 높은 골육종 세포주입니다.

이 세포들은 세포골격 연결 단백질인 ene를 높게 발현하며, 이는 해당 세포주의 침습적 특성의 원인이 됩니다. 반면, K 12 세포는 전이 능력이 더 낮으며 K seven M two 세포만큼 효율적으로 내피 단일층을 통과하지 못합니다. 이는 여기에서 보여지는 바와 같이 세포 지수의 감소 폭이 더 적은 것으로 나타납니다.

여기에 제시된 대조군은 uve 단층의 임피던스를 나타냅니다. 암세포가 없는 상태에서 실험은 3회 반복 수행되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 내피세포 단층을 형성하고 암세포로 해당 단층을 자극함으로써 침습을 실시간으로 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

HU XL 단층 형성을 포함하는 실험의 초기 단계는 임피던스를 통해 세포 증식을 평가하는 데 사용될 수 있습니다. 두 번째.