교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

다음 실험의 전반적인 목표는 수지상 척추 형태 및 운동성에 대한 다양한 분자 및 약리학적 조작의 효과를 평가하는 것입니다. 이것은 신경 세포의 형태학을 개략적으로 설명하고 내인성 단백질 표정 및 기능을 조작하기 위하여 DNA 플라스미드의 외인성 발현의 유무에 관계없이, GFP를 가진 1차 배양된 피질 신경세포를 transection해서 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 세포를 약리학적으로 처리한 후 면역 염색에 고정하거나 타임 랩스 이미징을 준비할 수 있습니다.

그런 다음 약물 치료를 통해 수지상 가시를 시각화하고 수지상 척추 형태 및 운동성의 유도된 변화를 확인할 수 있습니다. Next Z 시리즈 고정 세포 이미지 또는 특정 시점에서 촬영한 살아 있는 세포의 이미지는 컨포칼 현미경을 사용하여 획득합니다. 수지상 척추 형태에 대한 자세한 측정은 Z 시리즈 이미지의 2D 투영에서 수행할 수 있습니다.

얻어진 결과는 수지상 척추 모양 또는 운동성의 정량적 형태학적 분석을 기반으로 수상돌기 척추 형태 또는 운동성에 대한 분자 또는 약리학적 조작의 효과를 보여줍니다. 이 방법은 시냅스 가소성이 어떻게 조절되는지와 같은 신경 과학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 흥분성 시냅스는 어떻게 발달합니까?

시냅스는 어떻게 유지되거나 제거됩니까? 신경 전달 물질이나 유전자와 같은 분자는 어떻게 시냅스 구조를 조절합니까? 이 방법은 시냅스 조절의 기초가 되는 기본 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 자폐증, 정신분열증 또는 알츠하이머병과 같은 많은 정신 및 신경 장애의 특징인 시냅스 구조를 변경하기 위해 질병 관련 유전자의 기여를 조사하는 것도 암시될 수 있습니다.

먼저, DMEM의 pH와 10밀리몰의 멸균 히피의 균형을 맞춰 H-D-M-E-M을 준비합니다. 섭씨 37도로 데우십시오. 다음으로 18mm 덮개는 세포와 함께 섭씨 37도의 예열 및 무항생제 매체 600마이크로리터로 이동합니다.

섭씨 37도에서 세포를 배양하고 30분 동안 5%의 이산화탄소를 보충합니다. 각 커버 슬립에 대해 50마이크로리터의 H-D-M-E-M에 지정된 양의 DNA를 추가하고 5분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 4마이크로리터의 lipo 2000을 다른 50마이크로리터의 H-D-M-E-M에 넣고 5분 동안 그대로 둡니다.

두 개의 튜브를 완전히 섞어 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에 보관하고 5%의 이산화탄소를 최소 20분 동안 보충합니다. 다음으로, 혼합물을 세포에 적가적으로 첨가하십시오. 동일한 조건에서 세포를 다시 4 시간 동안 계속 배양하고, 이전에 준비된 300 마이크로 리터의 공급 매체를 섭씨 37 도의 400 마이크로 리터에 혼합합니다.

신선한 공급 매체. 그런 다음 세포가 있는 덮개 슬립을 오래된 공급 매체와 신선한 공급 매체를 모두 포함하는 매체로 옮깁니다. 플라스미드의 발현이 2-3일 더 지속되도록 합니다.

200마이크로몰 D-L-A-P-V로 CSF를 준비합니다. 섭씨 37도로 데우고 다음 사전 배양합니다. 덮개는 900마이크로리터의 따뜻한 A CSF를 30-60분 동안 밀어 넣습니다.

용액을 A CSF로 희석하여 원액의 약리학적 제제를 10배의 작업 농도로 준비합니다. 세포에 제제를 1000 마이크로 리터의 최종 부피와 하나의 X 제제의 최종 농도로 조심스럽게 첨가하십시오. 800 마이크로 리터의 4 % 포름 알데히드, 4 % 자당 PBS의 뉴런을 실온에서 10 분 동안 고정합니다.

포름알데히드 폐기물을 처리할 때 주의하여 PBS에서 두 번 세척하십시오. 그런 다음 섭씨 4도의 미리 채워진 메탄올 800마이크로리터로 얼음 블록에 10분 동안 뉴런을 고정합니다. 800마이크로리터의 PBS에 10분 동안 커버 슬립을 두 번 세탁합니다.

다음으로, 2%의 정상 염소 혈청과 800마이크로리터의 0.1% 트리톤 X 100을 1시간 동안 함유한 PBS에서 투과성 눈과 블록 세포를 동시에 투과합니다. 실온에서 GFP 및 에피토프 태그 또는 내인성 단백질에 대해 생성된 1차 항체를 2%의 정상 염소 혈청을 함유한 PBS에 추가합니다. 그런 다음 15cm 접시를 가져 와서 사각형으로 나눕니다.

그들에게 번호를 매기고 파라폼으로 덮으십시오. 80마이크로리터의 항체를 추가하고 혼합물을 제곱당당 1방울로 파라폼에 차단합니다. 커버 슬립을 항체에 놓고 세포가 아래를 향하도록 혼합물을 차단합니다.

이제 파라마크로 접시를 밀봉하고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. PB S3의 커버 슬립을 매번 15분 동안 세탁하십시오. 2%의 정상 염소 혈청을 함유한 PBS에 희석된 Alexa 접합 2차 항체.

2차 항체를 실온에서 1시간 동안 배양하고 그 이후에는 빛으로부터 보호합니다. PB S3에서 15분 동안 매번 세포를 다시 세척합니다. 마지막으로, 개구수가 1.4인 63 x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 연장된 Antifa 시약을 사용하여 커버 슬립을 표준 현미경 슬라이드에 장착합니다.

일련의 이미지를 미리 결정된 증분으로 Z 시리즈로 획득합니다. 예를 들어 0.37마이크로미터입니다. 적절한 레이저 라인으로 형광 이미지를 획득합니다.

예를 들어, 488나노미터에서 아르곤 레이저 라인 엑시를 사용하고 505-530나노미터에서 대역 통과 필터를 사용합니다. 척추와 배경의 형광 신호 사이에 선명한 대비를 만들기 위해 검출기 게인과 오프셋을 조정합니다. 동일한 실험 내의 모든 스캔에 대해 획득 매개변수를 동일하게 유지합니다.

분자 장치의 변형 소프트웨어는 이미지 분석에 사용되어 수지상 가시의 형태를 검사하고, 최대 투영 재구성 및 배경 빼기 이미지로 Z 시리즈 이미지를 축소합니다. 다음으로, 총 100마이크로미터의 수상돌기가 두 개 이상 있는 뉴런을 선택하고 필요한 거리를 보정합니다. 그런 다음 임계값이 가시의 윤곽선과 정확히 일치하는 방식으로 모든 척추를 포함하도록 이미지 임계값을 조정하여 뉴런의 이진 이미지를 만듭니다.

변동성을 줄이기 위해 2차 및 3차 수상돌기에서만 가시를 측정합니다. 분기 점 사이의 세그먼트를 측정합니다. 닫힌 매개변수를 형성하기 위해 각 척추의 윤곽을 수동으로 지정합니다.

변형을 통해 척추 길이, 척추, 호흡, 단면적 및 수지상 척추 선형 밀도를 포함한 척추 매개변수를 측정합니다. 그런 다음 정량화 및 통계 분석을 위해 수지상 척추 형태 측정 매개변수를 Excel로 내보냅니다. 22 x 22 밀리미터 커버 슬립에서 자란 뉴런을 1.5 밀리리터의 A CSF에서 30-60 분 동안 사전 배양합니다.

섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5%의 이산화탄소가 보충됩니다. 그런 다음 세포를 섭씨 37도의 밀폐된 이미징 스테이지 챔버로 옮겨 척추 운동성을 검사하고, GFPM 체리 또는 형광 단백질을 발현하는 투과 형태를 가진 건강한 뉴런을 선택하여 광 손상을 최소화합니다. 레이저 출력을 0.5에서 1%로 줄인 다음 63 x 대물렌즈와 1.4 개구수를 사용하여 10분마다 2개의 x 평균으로 이미지를 획득합니다.

1시간 동안 뉴런을 이미지화합니다. 그런 다음 연동 펌프 이미지를 사용하여 약물 또는 차량을 이미징 챔버로 관류합니다. 또 한 시간 동안 뉴런.

각 이미징 세션이 끝날 때 각 시점에서 Z 시리즈 이미지를 수집하고, 전체 뉴런의 10 x 이미지를 얻어 광 손상 수준을 확인하고 정량화에서 고통의 징후를 보이는 뉴런을 생략합니다.다음 붕괴, 각 시점의 Z 시리즈 이미지를 변성에서 최대 투영 재구성으로 사용합니다. 이미지 품질 및 transfection 수준에 따라 분석을 위한 선명한 이미지를 생성하기 위해 중앙값 통과 필터 또는 배경 빼기를 적용하여 분석을 위한 선명한 이미지를 생성하고, 변형에서 100분 이미지 세션의 시작, 중간 및 끝에서 촬영한 이미지를 오버레이하고, 셀당 최소 100마이크로미터의 수상돌기를 분석합니다. 총 척추 운동성 비율은 운동성 이벤트의 총 수로 정의됩니다. 예를 들어, 확장 후퇴, 머리 변형 또는 척추 수로 정규화된 돌출 운동성.

이 방법은 이벤트의 규모를 고려하지 않고 이벤트의 빈도를 측정하며 전체 운동성의 일반적인 추정치입니다. 돌출 사건은 척추 머리 또는 수지상 샤프트에서 새로운 일시적인 돌출부의 출현으로 정의되었습니다. 수축 사건은 척추 머리 또는 수지상 샤프트에 위치한 기존 또는 일시적인 돌출부가 사라지는 것으로 정의되었습니다.

돌출 및 확장 이벤트의 합은 약물 치료에 대한 반응으로 개별 척추 형태의 변화를 평가하기 위해 정량화된 수상돌기 영역의 총 척추 수로 나뉩니다. 이미징 세션 시작 시 수지상 가시의 단면적 또는 수지상 척추 선형 밀도를 측정한 다음 관류 치료 직전과 직후의 각 시점에서 각 시점을 치료 시점 1시간 전으로 정규화합니다. 그런 다음 정량화 및 통계 분석을 위해 수지상 척추 형태 측정 매개변수를 Excel로 내보냅니다.

다음은 0.52 μm 및 1.0 μm의 형광 마이크로 스피어의 면적을 각각 0.21 마이크로 미터 제곱 및 0.78 마이크로 미터 제곱으로 0.2 마이크로 미터 마이크로 스피어에 대해서도 정확하게 측정되는 것을 보여주는 예입니다. 측정값은 실제 치수에 상당히 가깝습니다. 여기에 표시된 것은 63 x 대물렌즈와 1.4 개구수를 가진 컨포칼 현미경을 사용하여 GFP로 transfection된 피질 뉴런의 대표적인 이미지입니다.

다음은 수상돌기 가시의 상세한 고해상도 이미지입니다. 활동 의존적 자극의 잘 특징화된 효과는 수지상 척추 크기의 증가입니다. 다음은 활동 의존적 자극 전후 30분 동안 이미지화된 EGFP를 발현하는 DIV 24 피질 뉴런의 수지상 척추의 대표적인 타임랩스 이미지입니다.

이 타임랩스 실험은 덴드레시스 척추 크기의 증가가 활동 의존적 자극에 의한 것임을 확인합니다.기저 척추를 검사하기 위해 0.0분, 50분 및 100분에 운동성 이미지를 획득합니다. 척추 확장, 수축, 돌출, 운동성 및 머리 변형은 별도로 측정되고 총 운동성으로 결합됩니다. 이 수치는 기저 조건에서도 피질 뉴런의 수지상 가시가 이 절차에 따라 어느 정도의 운동성을 나타낸다는 것을 확인합니다.

수용체와 다른 시냅스 단백질의 공동 국소화, 시냅스에 대한 단백질의 국소화 및 전기 생리학적 조사와 같은 다른 방법은 수지상 척추 형태의 조절 및 시냅스 기능 쇼와의 조정에 관한 추가 질문에 답하기 위해 수행할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 시냅스 구조에 대한 다양한 분자 및 약리학적 조작의 영향을 평가하기 위해 수지상 척추 형태 및 운동성에 대한 자세한 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.