Name: 교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: 배우세요 원시 배양 대뇌피질 뉴런에서 GFP와 DNA 플라스미드를 이용한 돌기 스파인 형태 및 운동성 분석 방법입니다. 공초점 현미경을 활용한 시각화 기법으로 시냅스 가소성과 신경 질환 관련 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는주의 편집을 위해 켈리 존스 감사합니다. 미국 심장 협회 박사 과정 이수 원정대 (DPS),이 작품은 NIH 부여 R01MH 071316, 알츠하이머 협회, 정신 분열증과 우울증 (NARSAD)에 관한 연구에 대한 국가 연합, 그리고 자폐증 연구에 대한 국가 연합 (나르) (PP)에 의해 지원되었다 미국 심장 협회 Predoctoral 원정대 (KMW).

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developments in neuronal cell culture.</a> Nature. 336, 185-186 (1988).</li>
<li>Xie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kalirin-7+controls+activity-dependent+structural+and+functional+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines.</a> Neuron. 56, 640-656 (2007).</li>
<li>Spear, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+adolescent+development+and+alcohol+use+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Res+Health%22%5BJournal%5D)">Modeling adolescent development and alcohol use in animals.</a> Alcohol Res Health. 24, 115-123 (2000).</li>
<li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Liu, F., Brandon, N. J., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+ss+activity+modulates+synaptic+signaling+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor ss activity modulates synaptic signaling and structure.</a> J Neurosci. 30, 13454-13460 (2010).</li>
<li>Srivastava, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enhancement+of+two-step+wiring+plasticity+by+estrogen+and+NMDA+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid enhancement of two-step wiring plasticity by estrogen and NMDA receptor activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 14650-14655 (2008).</li>
<li>Woolfrey, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epac2+induces+synapse+remodeling+and+depression+and+its+disease-associated+forms+alter+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epac2 induces synapse remodeling and depression and its disease-associated forms alter spines.</a> Nat Neurosci. 12, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Allison, D. W., Gelfand, V. I., Spector, I., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+in+anchoring+postsynaptic+receptors+in+cultured+hippocampal+neurons%3A+differential+attachment+of+NMDA+versus+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of actin in anchoring postsynaptic receptors in cultured hippocampal neurons: differential attachment of NMDA versus AMPA receptors.</a> J Neurosci. 18, 2423-2436 (1998).</li>
<li>Harms, K. J., Tovar, K. R., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-specific+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+composition+by+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synapse-specific regulation of AMPA receptor subunit composition by activity.</a> J Neurosci. 25, 6379-6388 (2005).</li>
<li>Xie, Z., Huganir, R. L., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+spine+structural+plasticity+is+regulated+by+small+GTPase+Rap1+and+its+target+AF-6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic spine structural plasticity is regulated by small GTPase Rap1 and its target AF-6.</a> Neuron. 48, 605-618 (2005).</li>
<li>Jones, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modulation+of+spine+morphology+by+the+5-HT2A+serotonin+receptor+through+kalirin-7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Rapid modulation of spine morphology by the 5-HT2A serotonin receptor through kalirin-7 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 19575-19580 (1957).</li>
<li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 13438-13443 (1999).</li>
<li>Lichtman, J. W., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Nat Methods. 2, 910-919 (2005).</li>
<li>Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+spines+and+dendrites+distribute+dye+evenly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Do spines and dendrites distribute dye evenly.</a> Trends Neurosci. 27, 445-446 (2004).</li>
</ol>

이 작품은 제작이 MetaMorph (분자 디바이스 주식 회사)에 의해 지원되었다.

기술 neuropathologies에 기여할 수있다 포스트 시냅스 메커니즘의 영향을 이해에 초점을 아르 돌기 척추 형태, 중 고정 또는 라이브 주요 대뇌 피질의 뉴런의 선형 밀도와 운동성의 상세한 정량 분석​​을 위해 위에서 설명한. 비슷한 접근 방식은 hippocampal 피라미드, Purkinje, 또는 중간 가시의 뉴런 포함하여 가시의 신경 세포에서 척추의 형태 또는 운동성을 계량하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서 설명한 프로토콜은 시냅스 단백질 및 / 또는 돌기 쪽이에 대한 약리 치료의 효과의 기본 속성을보고 적용할 수 있습니다. 또한, 그것은 수용체를 조미료로 비계 단백질에서부터 내생 시냅스 단백질의 지방화의 변화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 그것은 시냅스 단백질이나 돌기 척추 운동성에 대한 약리 치료의 효과 측정 또한 고정 쪽이 자세한 morphometric 분석뿐만 아니라 수 있지만. 이러한 시간 경과 영상 기법은 또한 또는 동시에 돌기 척추 형...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 18mm 라운드 커버 유리 번호 1.5 </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> 64-0714 (CS - 18R15) </td><td></td></tr><tr><td> 22mm 사각 커버 글라스 번호 1.5 </td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> 64-0721 (CS - 22S15) </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 - D - 라이신 </td><td> 시그마 </td><td> P - 0899 </td><td> MW 70 ~ 150 KDA </td></tr><tr><td> Neurobasal 미디어 </td><td> Invitrogen </td><td> 21103049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td> 글루타민 </td><td> Invitrogen </td><td> 21051024 </td><td></td></tr><tr><td> 페니실린 - 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15140148 </td><td></td></tr><tr><td> D, L - APV (AP - 5) </td><td> 아센트 과학 </td><td> ASC - 004 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> MediaTech Cellgro </td><td> 25-060 - C 1 </td><td> 1M, 산도 7 </td></tr><tr><td> 포름 알데히드 용액 </td><td> EMD 화학 </td><td> FX0415 - 5 </td><td> 36%, 조직학 학년 </td></tr><tr><td> 정상 염소 혈청 </td><td> VWR </td><td> 100188-514 </td><td> 잭슨 Immunoresearch 실험실 </td></tr><tr><td> 트리톤 X - 100 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> AC21568 - 2500 </td><td> Acros의 생명체 </td></tr><tr><td> 알렉사 플루어 높은 488 염소 안티 - 마우스 IgG (H + L) 교차 adsorbed </td><td> Invitrogen </td><td> A - 11029 </td><td></td></tr><tr><td> 알렉사 플루어 488 염소 안티 - 토끼 IgG (H + L) * 높은 상호 adsorbed * </td><td> Invitrogen </td><td> A - 11034 </td><td></td></tr><tr><td> 골드 antifade 시약을 연장 </td><td> Invitrogen </td><td> P36934 </td><td> 특별 포장 </td></tr><tr><td> 동봉된 이미징 단계 챔버 </td><td> 워너 </td><td> RC - 30HV </td><td></td></tr><tr><td> 온도 컨트롤러 유닛 </td><td> 워너 </td><td> TC - 344B </td><td></td></tr><tr><td> MetaMorph </td><td> 범용 이미징 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

교양 cns의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

돌기 쪽이은 뇌 내에서 흥분성의 연결의 대부분의 사이트이며, 시냅스의 포스트 시냅스 칸막이를 형성하고 있습니다. 이러한 구조는 굴지 풍부하고 매우 동적으로 표시되었습니다. 고전 헵의 소성뿐만 아니라 neuromodulatory 신호에 대응하여, 돌기 쪽이은 모양과 신경 회로의 상세 및 뇌 내의 정보의 처리 및 저장을위한 중요한 것으로 생각됩니다 번호를 변경할 수 있습니다. 돌기 쪽이 내에서 단백질의 복잡한 네트워크 돌기 척추의 형태 및 숫자의 제어를위한 허용 굴지의 cyctoskeleton와 세포외 신호를 연결합니다. Neuropathological 연구는 정신 분열증 자폐증 스펙트럼 장애에 이르기까지 질병 상태의 숫자가, 비정상적인 척추 돌기 형태 또는 숫자를 표시 증명하고있다. 또한, 최근 유전자 연구는 이러한 단백질이 부분이 장애의 pathophysiology을 기초 탈선 척추 소성에 기여할 수있는 제안을 선도, 시냅스 단백질을 인코딩 다수의 유전자에 돌연변이가 확인되었습니다. 돌기 척추 morphologies / 번호를 제어에서이 단백질의 잠재적인 역할을 연구하기 위해, 교양 대뇌 피질의 뉴런의 사용은 몇 가지 장점을 제공합니다. 첫째,이 시스템은 고정된 세포의 돌기 쪽이의 고해상도 영상뿐만 아니라 라이브 세포의 시간 경과 이미징을 허용합니다. 둘째, 체외 시스템에서이 돌연변이 단백질, shRNA 구성 요소로 분해, 또는 약리 치료의 표현에 의해 단백질 기능의 쉬운 조작을 허용합니다. 이러한 기법은 연구자들이 질병 관련 단백질의 역할을 해부하다하고이 단백질의 변이가 생체내에서 작동할 수 방법을 예측하기 시작 수 있습니다.

많은 최근의 연구는 뇌 pathologies와 관련된 시냅스 단백질에 돌연변이가 확인되었습니다. 기본 교양 피질 뉴런이 돌기 척추의 형태와 운동성에서 이러한 질병 관련 단백질의 영향을 조사 큰 유연성을 제공합니다.

교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

수지상 돌기(Dendritic spines)는 뇌 내 대부분의 흥분성 연결이 이루어지는 부위이며, 시냅스의 시냅스 후 구획을 형성합니다. 이러한...

다음 실험의 전반적인 목적은 다양한 분자적 및 약리학적 조작이 수지상 돌기 가시(dendritic spine)의 형태와 운동성에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이는 GFP가 발현된 일차 배양 피질 뉴런을 절단하여 수행하며, 뉴런의 형태를 시각화하고 내인성 단백질의 발현과 기능을 조작하기 위해 DNA 플라스미드를 외생적으로 발현시키거나 발현시키지 않은 상태로 진행합니다. 두 번째 단계에서는 세포를 약리학적으로 처리한 후, 면역 염색을 위해 고정하거나 타임랩스 이미징(time-lapse imaging)을 위해 준비할 수 있습니다.그 다음으로 약물 치료를 통해 수지상 돌기 가시(dendritic spine)를 시각화하고, 수지상 돌기 가시의 형태 및 운동성에서 유도된 변화를 관찰합니다. 이어서 공초점 현미경을 사용하여 고정된 세포의 Z-시리즈 이미지 또는 특정 시점에서 촬영한 살아있는 세포의 이미지를 획득합니다. Z-시리즈 이미지의 2D 투영물을 통해 수지상 돌기 가시 형태에 대한 상세한 측정이 가능합니다.얻어진 결과는 수지상 돌기 가시의 형태 또는 운동성에 대한 정량적 형태 분석을 바탕으로, 분자적 또는 약리학적 조작이 수지상 돌기 가시의 형태나 운동성에 미치는 영향을 보여줍니다. 이 방법은 시냅스 가소성이 어떻게 조절되는가? 흥분성 시냅스는 어떻게 발달하는가?와 같은 신경과학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.시냅스는 어떻게 유지되거나 제거될까요? 신경전달물질이나 유전자와 같은 분자들이 시냅스 구조를 어떻게 조절할까요? 이 방법은 시냅스 조절의 기초 기전에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 자폐증, 조현병 또는 알츠하이머병과 같은 여러 정신질환 및 신경계 질환의 특징인 시냅스 구조 변화에 질병 관련 유전자가 어떻게 기여하는지 조사하는 데 활용될 수 있습니다.먼저, 10 mM 멸균 HEPES로 DMEM의 pH를 조절하여 H-D-M-E-M을 준비합니다. 이를 37 °C로 가온합니다. 그다음, 세포가 부착된 18 mm 커버스립을 37 °C로 예열된 항생제 없는 배지 600 µL로 옮깁니다.세포를 37 °C에서 배양하고 5% 이산화탄소를 공급하며 30분 동안 유지합니다. 각 커버슬립에 대해, 50 µL의 H-D-M-E-M에 정해진 양의 DNA를 첨가하고 5분 동안 방치합니다. 그런 다음, 다른 50 µL의 H-D-M-E-M에 4 µL의 lipo 2000을 첨가하고 마찬가지로 5분 동안 방치합니다.두 튜

analysis-of-dendritic-spine-morphology-in-cultured-cns-neurons

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Pekarek, B. T., et. al., CLARITY 조직 투명화를 통한 온전한 신경 수상돌기의 이미징 및 정량화. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오에서는 컨포칼 현미경 및 3D 재구성 기술을 사용하여 수지상 가지, 척추 형태 및 신경 분포를 조사하기 위해 제거된 마우스 뇌의 준비, 이미징 및 분석을 보여줍니다.

Confocal Microscopy Imaging of intact dendritic arbors and spine morphology in a cleared mouse brain(투명화된 쥐 뇌에서 온전한 수지상 가지와 척추 형태에 대한 컨포칼 현미경 이미징)

출처: Gouder, et. al. 인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생된 피라미드 뉴런의 수지상 가시의 3차원 정량화. J. Vis. 경험. (2015).이 비디오는 공초점 현미경을 사용하여 형질도입된 면역 표지 피라미드 뉴런에서 수지상 가시의 이미징 및 분석을 보여줍니다. 배경 소음이 감소하고 수상돌기가 직경과 길이를 추정하여 추적됩니다. 자동화된 척추 분할에는 수상돌기 및 척추 치수에 대한 매개변수 설정과 척추 분류가 포함됩니다. 3D 모델이 생성되고 분석을 위해 내보내집니다.

공초점 현미경 이미징을 사용한 수지상 가시의 정량화

이 문서는 구조적 조명 현미경 (SIM)을 사용하여 체외에서 해마 신경 세포에서 이미지 돌기 쪽을 작동 프로토콜을 설명합니다. SIM을 사용하여 초 고해상도 현미경 개선 된 세부 사항과 함께 개별 돌기 쪽의 영상을 허용, 크게 세 가지 차원 공간에서 빛의 회절 한계를 넘어 이미지 해상도를 제공합니다.

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

우리는 마우스 모델의 해마에서 수지상 수목화의 시각화 및 정량화를 위한 두 가지 방법, 즉 실시간 이미징과 확장된 피사계 심도 이미징에 대해 설명합니다. 전자의 방법은 정교한 지형 추적과 분기 정도의 정량화를 가능하게 하는 반면, 후자는 수지상 나무를 빠르게 시각화할 수 있습니다.

쥐의 해마 영역의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 수지상 Arborization의 평가

피라미드 신경 세포의 돌기 쪽은 포유류의 뇌 피질에있는 대부분의 흥분성 시냅스의 사이트입니다. 이 방법은 유도 된 다 능성 줄기 세포로부터 유래 된 인간 피질 피라미드 글루타메이트 성 뉴런의 척추 모폴로지의 3D 정량 분석​​을 설명한다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

여기서 우리는 Golgi-Cox 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 신뢰할 수있는 조직 얼룩 방법은 최소한의 문제 해결과 함께 해마 및 전체 뇌에 걸쳐 cytoarchitecture의 높은 품질 평가를 허용합니다.

골지 - 콕스 방법을 이용한 고령의 해마 상피 세포의 수지상 돌기 복잡성 평가

우리는 신경 화학적 및 행동 적 이상을 뒷받침 할 수있는 뉴런과 수지상 척추의 잠재적 인 형태 학적 변화를 평가하는 데 중요한 피라미드 뉴런에 라벨을 지정하고 분석하는 프로토콜을 제시합니다.

뇌 슬라이스와 기본 세포 배양에서 피라미드 뉴런의 탄도 라벨링

수지상 등뼈는 신경계의 중요한 세포 특징입니다. 여기에서는 C. elegans에서 수지상 가시의 구조와 기능을 평가하기위한 라이브 이미징 방법이 설명됩니다. 이러한 접근법은 수지상 척추 모양 또는 기능을 정의하는 유전자에 대한 돌연변이 스크린의 개발을 지원합니다.

Caenorhabditis elegans의 수지상 가시 이미징

이 프로토콜은 쥐의 해마 및 내측 전두엽 피질에서 뉴런을 염색하기 위해 신경계의 모든 부분에 적응할 수있는 신속한 골지 방법의 변형을 기술합니다.

해마와 전두엽 피질의 Dendritic Spine Visualization을위한 빠른 골지 얼룩

수지상 가시는 대부분의 흥분성 시냅스의 시냅스 후 구획입니다. 수지상 척추 형태의 변화는 신경 발달, 노화, 학습 및 많은 신경 및 정신 장애 중에 발생하며, 이는 신뢰할 수 있는 수지상 척추 분석의 중요성을 강조합니다. 이 프로토콜은 자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용하여 수상돌기 척추 형태를 정확하고 재현성 있게 정량화하는 방법을 설명합니다.

자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용한 수지상 척추 정량화

배우세요 원시 배양 대뇌피질 뉴런에서 GFP와 DNA 플라스미드를 이용한 돌기 스파인 형태 및 운동성 분석 방법입니다. 공초점 현미경을 활용한 시각화 기법으로 시냅스 가소성과 신경 질환 관련 연구에 활용할 수 있습니다.

교양 CNS의 뉴런의 돌기 스파인 형태론 분석

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