전체 산 현장에서 하이브리드

이 절차의 전반적인 목표는 전체 마우스 배아에서 유전자 발현 패턴을 정의하는 것입니다. 이는 먼저 관심 유전자에 대한 특정 ribo 프로브를 설계하고 생성함으로써 수행됩니다. 다음으로, 배아를 채취하여 교잡을 위해 처리합니다.

그런 다음 표지된 프로브가 배아에 혼성화됩니다. 마지막 단계는 면역조직화학적 검출을 통해 혼성화된 프로브를 시각화하는 것입니다. 궁극적으로, 전체 배아 또는 배아 절편에서 유전자 발현 패턴을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

스테레오, 해부 현미경 또는 일반 명시야 현미경으로 이미징한 후 일반적으로 연구소 혼성화 절차가 길고 기술적으로 까다롭기 때문에 이 방법을 처음 접하는 개인은 어려움을 겪을 것입니다. 먼저, 5개의 프라임 말단에 farge transcription promoter sequence로 설계된 유전자 특이적 PCR primer를 사용하여 관심 염기서열을 증폭하여 template DNA를 생성합니다. 그런 다음 PCR 산물을 정제하고 서면 프로토콜에 따라 proteinase K 분해 단계를 포함합니다.

그런 다음 체외 전사 반응과 인큐베이터를 2시간 동안 최적 온도로 설정합니다. DNA의 DNA 템플릿 분해 후 컬럼 정제를 사용하여 ribo 프로브를 정제하고 NanoDrop 또는 마이크로플레이트 흡수 리더를 사용하여 프로브 수율을 추정합니다. 그런 다음 예상 수율에 따라 프로브 농도를 마이크로리터당 100나노그램으로 조정합니다.

다음 쓰여진 의정서에서 약술된 것과 같이 변성 아크릴아미드 젤 전기 이동법에 의하여 조사의 질을 검사하고 RIBA 조사의 특정한 활동을 측정해서, 좋은 조사는 특정한 활동을 측정하기 위하여 최소 얼룩을 가진 젤에 단 하나 분리된 밴드를 열매를 산출해야 하고, 10에서 마이너스 2에서 10에 마이너스 5에 희석의 범위를 얻기 위하여 ribo 조사의 연속적인 희석을 실행한다. 그런 다음 각 희석액 1마이크로리터를 82mm 직경의 High Bond n plus 멤브레인 조각에 피펫으로 넣고, 1마이크로리터의 표지되지 않은 DNA 샘플을 대조군으로 사용합니다. 가교 후 125mjoules에서 UV 가교제에서 즉시 필터를 가교합니다.

1회 TN 완충액에 10ml의 1% 차단 시약을 첨가하고 차단이 완료된 후 30분 동안 실온에서 배양합니다. 차단액을 제거하고 멤브레인을 세척하는 동안 10ml의 TN 완충액으로 실온에서 15분 동안 필터를 세척합니다. 세척 후에 1 시간 TN 완충기의 10 밀리리터에 있는 FAB 파편에 있는 반대로 doxygen의 1개에서 5개, 000 희석을 준비하십시오.

이 용액에서 30 분 동안 멤브레인을 배양하십시오 배양 후 1 회 TN 완충액 10 밀리리터로 멤브레인을 각각 15 분 동안 두 번 세척하십시오. 최종 세척 후 페트리 접시에서 세척 용액을 흡인하고 5ml의 BM 보라색 기질로 교체합니다. 이 용액에서 멤브레인을 30분 동안 배양합니다.

30분이 경과한 후 10에서 마이너스 4 희석에 해당하는 지점에서 방출되는 가시 신호의 존재 여부를 멤브레인에 확인합니다. 신호가 보이면 매번 5분 동안 5배 TE 2회씩 세척하여 색상 반응을 중지합니다. 30분 후에도 신호가 보이지 않으면 프로브를 폐기해야 합니다.

얼음처럼 차가운 PBST에서 마우스 배아를 수집합니다. 그런 다음 유전자형에 따라 배아를 PBST를 포함하는 4밀리리터 나사 뚜껑이 있는 파일로 분류합니다. 달리 명시되지 않는 한 PBST에서 4%PARALDEHYDE로 배아를 고정합니다.

모든 배양 및 세척 단계는 약 4ml 용량인 바이알 넥의 낮은 수준까지 채워진 용액으로 수행됩니다. 고정 후 배아를 섭씨 4도에서 밤새 방치합니다. 유리 파스타 피펫으로 PBST의 4%파라알데히드를 흡입하고 PBST로 교체합니다.

바이알을 얼음 위에 5분 동안 올려 씻습니다. 이 과정을 반복하여 두 번째로 조직을 씻습니다. 다음으로, PBST를 흡인하고 PBST 시리즈의 메탄올을 통해 배아를 100% 메탄올로 단계적으로 탈수합니다.

원하는 경우 배아의 손상을 방지하기 위해 피펫 팁을 바이알의 반대쪽에 보관하며, 배아는 섭씨 영하 20도의 100% 메탄올에서 최대 8개월 동안 보관할 수 있으며 사용할 때까지 더 오래 보관할 수 있습니다. 배아를 접시에 옮기고, 배아가 아직 메탄올에 있는 동안 미세 해부 칼로 E 10.5 이상 배아의 심장과 머리에 구멍을 뚫습니다. 이를 통해 세척액이 뇌실과 심실로 들어갈 수 있고 배경 염색을 줄일 수 있습니다.

그런 다음 PBST 시리즈의 메탄올에서 연속적인 세척으로 배아를 재수화합니다. 100% PBST로 각각 5분씩 두 번 세척하여 PBST와 30%과산화수소 1부의 용액을 준비하고 이 용액에서 배아를 얼음에서 1시간 동안 배양합니다. 배양하는 동안 갓 준비한 교잡 완충액을 섭씨 65도에 놓고 예열합니다.

PBST로 배아를 각각 5분씩 두 번 세척합니다. 최종 세척 중에 DEPC 물로 밀리리터당 20mg의 proteinase K 스톡을 만듭니다. 그런 다음 스톡을 연속적으로 희석하여 밀리리터당 10마이크로그램을 만듭니다.

PBST의 Proteinase K는 최종 세척 용액을 흡입하고 10 microgram per milliliter proteinase K 용액 1ml로 교체합니다. 바이알을 섭씨 25도에서 섭씨 25도의 수조에 있는 튜브 랙에 수직으로 놓고 배아의 크기에 따라 10-30분 동안 배양합니다. 시작 시간을 최적이고 복제 가능한 시간으로 기록해 둡니다.

배양 시간은 배아의 과도한 소화 없이 리보 프로브의 침투를 가능하게 하는 데 매우 중요합니다. 프로테아제 K 분해를 중지하려면 배양 시간이 경과하기 30초 전에 proteinase K 용액을 흡인합니다. 그런 다음 배양 시간이 경과하면 갓 만든 글리신당 밀리리터 2mg을 PBST에 첨가합니다.

실온에서 5분 동안 방치합시다. 그런 다음 글리신 세척을 5분 더 반복합니다. 그런 다음 PBST에서 각각 5분씩 두 번 씻습니다.

다음으로, 0.2%글루타르알데히드가 보충된 PBST의 4%파르알데히드에 배아를 20분 동안 침지하여 단백질분해효소 K 처리된 배아를 다시 고정합니다. 그런 다음 PBST에서 배아를 각각 5분씩 3회 세척합니다. 마지막 세척 후 PBST를 흡입하고 1ml의 예열 혼성화 완충액으로 교체합니다.

배아가 정착되면 교잡 완충액을 흡인하고 1ml의 새로운 예열 교잡으로 교체합니다. 완충기. 바이알을 섭씨 65도의 오븐에서 진탕 플랫폼이 있는 곳에서 1시간 동안 수직으로 배양합니다. 라벨링된 리보의 밀리리터당 0.5마이크로그램을 포함하는 혼성화 완충액을 준비합니다.

최대 E 8.5의 배아에 대한 프로브 또는 E 8.5 이후의 배아에 대한 프로브의 밀리리터당 0.1-1 마이크로그램. 배양 후 사전 혼성화 용액을 이 용액 0.4ml로 교체하고 섭씨 65도에서 밤새 혼성화합니다. 다음날, 배아의 질을 확인하십시오.

배아가 proteinase K로 과다 처리된 경우, 배아가 바이알의 크기를 유지하거나 매우 투명하게 보이거나 떨어져 나갈 수 있습니다. 이런 식으로 나타나는 배아는 더 이상 처리하면 해석 가능한 데이터가 생성되지 않으므로 폐기해야 합니다. 혼성화 버퍼를 4ml의 용액으로 교체합니다.

하나는 섭씨 70도입니다. 이 온도를 유지하고 E 8.5 배아의 경우 각각 30분 동안 두 번 또는 세척당 30분 동안 세 번 수행합니다. E 9.5 및 이전 배아의 경우 마지막 세척 중 50% 용액 4ml, 각 바이알에 대해 50% 용액 1개, 50% 용액 2개를 준비하고 마지막 세척 후 섭씨 70도로 예열합니다.

이 용액에서 배아를 10분 동안 배양한 다음 4ml의 용액으로 세척할 때마다 5분씩 3회 세척합니다. 세탁 후 흔들리며 실온에서 2 개. 용액을 새 용액으로 교체하십시오.

밀리리터 당 100마이크로그램 RNA A와 밀리리터 RNA T당 100단위를 포함하는 2개는 섭씨 37도에서 세척당 30분 동안 두 번 배양합니다. 다음으로 섭씨 65도에서 3 회 세척 용액을 30 분 동안 두 번 흔들어 E 8.5의 경우 각 세탁, E 9.5 및 이전 버전의 경우 30 분 동안 3 회 세척합니다. 마지막으로, TBST를 한 번 씻을 때마다 5분 동안 세 번 세탁합니다.

그런 다음 항체 검출을 진행합니다. 바이알에서 최종 TBST 세척을 흡인하고 TBST의 1회 0.5ml와 10% 열처리된 양 혈청으로 교체합니다. 바이알을 실온의 플랫폼 셰이커에 수직으로 놓고 최소 2시간 30분 동안 흔들면서 배양하여 비특이적 항체 결합 부위를 차단합니다.

외피 시간이 경과한 후에, 막는 해결책을 흡인하고 2000년에서 1개에서 5, 뺀 알칼리성 phosphatase, 활용된 양 항원 및 FAB 파편 항체의 000 희석을 포함하는 10%serum를 플러스 신선한 1 시간 TBST로 대체하고 4 섭씨 온도에 밤새 배양하십시오. TBST를 한 번씩 5분씩 세 번 씻습니다. 그런 다음 1시간 동안 5-6회 실온에서 도달하고 마지막으로 하룻밤 동안 섭씨 4도에서 과도한 항체를 제거합니다.

다음 날. 갓 만든 알칼리성 인산가수분해효소 완충액으로 세척할 때마다 20분 동안 배아를 두 번 세척합니다. 이것은 배경을 줄이기 위한 중요한 절차입니다.

마지막 세척을 1ml의 예열 BM 보라색 AP 기판으로 교체하십시오. 빛으로부터 보호되는 동안 실온에서 배양하고 해부 현미경 신호를 통해 주기적으로 신호를 관찰하십시오. 풍부한 메신저를 위해.

RNA는 15분 이내에 볼 수 있어야 합니다. 신호가 명확하게 보이거나 배경 염색이 문제가 되기 시작하는 경우, 전체 산 배아의 염색 패턴을 문서화하기 위해 PBST와 5밀리몰 EDTA 캡처 이미지를 1회 사용하여 세척당 5분씩 두 번 세척하여 반응을 중지합니다. 이 작업이 완료되면 배아를 BM 보라색 기질의 바이알에 다시 넣고 배아의 외부 표면이 짙은 파란색이 되어 염색이 배아 전체에 침투할 수 있도록 할 때까지 실온에서 16-24시간 동안 배양합니다.

그런 다음 배아를 PBST의 4% 파르말 가죽으로 옮겨 몇 시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 다시 고정합니다. 이 최종 고정 단계는 염색 패턴의 장기 보존에 매우 중요합니다. 마지막으로, 파라핀을 진행하여 이 염색을 밝히기 위해 서면 프로토콜에 설명된 절차에 따라 포매 및 절단합니다.

이 이미지는 gata three specific ribo probe를 사용하여 E 10.5 배아의 C 2 혼성화에 성공적인 홀 마운트를 보여줍니다. 다음은 Fox G one specific ribo probe로 성공적으로 표지된 E 11.5 배아를 보여주는 이미지입니다. 이 이미지는 부분적으로 저하된 gata three 프로브와 함께 실패한 C two hybridization의 높은 배경 및 약한 신호를 보여주며, 고품질 결과를 보장하기 위해 프로브의 신중한 품질 관리를 수행하는 것이 중요함을 보여줍니다.

다음은 실패한 또 다른 절차의 이미지입니다. 이 경우, 머리에 구멍을 뚫지 않고 시술이 수행되어 화살촉에서 알 수 있듯이 심실에 높은 수준의 배경 염색이 발생했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 공간 세부 사항 및 시간 또는 유전자형 비교를 위해 마우스 배아의 유전자 발현 패턴을 정의하기 위해 고품질 Institute hybridization을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.