Name: 활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 학습하세요 Tribolium castaneum 텔로머라제의 체외 재구성 및 활성 분석 방법을. 재조합 Tc TERT 단백질을 대장균에서 발현·정제하고, 딱정벌레 유충에서 추출한 총 RNA와 혼합하여 활성 효소를 재구성합니다. 이 방법은 텔로머라제 구조 및 기능 연구에 활용됩니다.

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연구는 건강의 펜실베니아학과 엘리슨 의료, V 및 에메랄드 기초에 의해 지원되었다 여기를 발표했다.

1. 재조합 TC TERT의 표현 <ol><li> TEV cleavable N - 터미널로 합성 TC TERT 플라스미드를 포함하는 (DE3) 로제타 변환 pLysS 세포 여섯 신선한 접시에서 2YT 미디어 6 패 (6 X 2 L은 각 2YT 국물 1 L를 포함 Erlenmeyer의 Flasks들을 당황하게)를 예방 hexahistidine - 태그. </li><li> 37 세포를 성장 ° C 0.5-0.6의 OD 600-220 rpm으로 흔들어 동안. </li><li> 1 ㎜의 IPTG를 추가하여 단​​백질 발현을 유도. </li><li> 30 온도를 감소 ° C, 150 RPM에 떨고 천천히, 그리고 세포가 4-5 H. 위해 단백질을 표현하는 수 </li><li> 4 원심 분리하여 세포를 수확 ° C 30 분 3,500 RPM. </li><li> 25 MM 트리스, 산도 7.5, 10 % 글리세롤, 0.5 M KCl, 15 MM 이미다졸, 5 MM의 β - 메르 캅 토 에탄올과 0.1 MM phenylmethyl sulphonyl 불화 (PMSF)와 benzamidine를 포함하는 버퍼의 20 ML 각 1 패 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 플래시 고정 천천히 각 드롭 액체 N 2 미치는 영향에 멈추도록 액체 질소로 가득 50 ML 플라스틱 원뿔 튜브에 세포를 흘리지하여 세포 혼합물을 resuspended. -80에서 냉동 세포를 보관 ° C 단백질 정화 준비까지. </li></ol> 2. TC TERT의 정화 <ol><li> 액체 일관성 때까지 실온에서 해동 세포에 도달 후 sonication을 위해 얼음 금속 비커로 이동합니다. </li><li> 30초 권력의 약 51 W에서 일시 중지 30 초 간격으로 2 분 얼음에 세포를 Sonicate. </li><li> 가용성과 불용성 단백질 분수를 별도 조심스럽게 니켈 친화성 크로마 토그래피를위한 뜨는을 제거 20 분 18,000 rpm으로 lysed 세포를 스핀 다운. </li><li> 니켈 - NTA (니켈 - nitrilotriacetic 산성) 25 MM 트리스, 산도 7.5, 10 % 글리세롤, 0.5 M KCl, 15 MM 이미다졸, 5 MM의 β - 메르 캅 토 에탄올과 0.1 MM PMSF 및 benzamidine를 포함하는 버퍼로 열을 평형. </li><li> 수지 위에 뜨는을로드하고를 통해 흐름을 수집합니다. </li><li> 모든 잔류 및 비 특별히 바운드 단백질을 제거하는 25 MM 트리스, 산도 7.5, 10 % 글리세롤, 500 MM KCl, 15 MM 이미다졸, 5 MM의 β - 메르 캅 토 에탄올과 0.1 MM PMSF를 포함하는 버퍼로 컬럼을 씻으십시오. </li><li> Elute TC 15 이미다졸 그라데이션을 사용하여 니켈 NTA 수지의 TERT - 300 MM 및 SDS 페이지 분석을위한 3 ML 분수를 수집합니다. </li><li> 어떤 분수가 TC TERT의 단백질을 포함하고 결정하고 Amicon 30 KDA (Millipore) 필터에 분수 집중 PAGE 분석을 사용합니다. </li><li> 볼륨 더 정화를 위해 미만 10 ML에 TC TERT의 분수를 집중. </li><li> TC TERT은 더욱 양이온 교환 컬럼 (HS poros, 응용 Biosystems) 25 MM 트리스, 산도 7.5, 10 % 글리세롤, 500 MM의 KCl, 1 MM의 DTT를 포함하는 버퍼로 사전 equilibrated을 통해 정화됩니다. </li><li> HS poros 칼럼에있는 단백질 믹스를로드하고 모든 단백질과 핵산의 오염 물질을 제거하기 위해 그것을 씻으십시오. </li><li> 남아있는 오염 물질을 제거하는 KCl 700 MM 500 MM 다음의 KCl을 포함하는 버퍼로 컬럼을 씻으십시오. </li><li> 1 M KCl 버퍼와 HS poros 칼럼에서 TC TERT의 단백질을 Elute. 이 시점에서 단백질 이상 99% 순수해야합니다. </li><li> Superdex - 200 크기 조정 칼럼 (크기 배제 크로마 토그래피 - GE 헬스케어) 위에 단백질을 통과하여 단백질 집계를 제거, 25 MM 트리스, 산도 7.5, 10 % 글리세롤, 500 MM KCl, 1 MM의 TCEP를 포함하는 버퍼로 사전 equilibrated. </li></ol> 3. Tribolium castaneum 비틀 문화 <ol><li> T. castaneum 처음 박사 S. 브라운, 생물 학부, 캔사스 주립 대학에서 선물로 제공 어디 딱정벌레. </li><li> 시작 T. 밀가루의 28.5 g, 말린 베이커의 효모 1.5 g과 컨테이너 백 성인 딱정벌레를 추가하여 castaneum 문화. </li><li> 상온에서와 3~4주에 대한 어두운, 습한 환경에서 저장 충 문화 재생산 및 성장 수 있도록. 습한 환경을 보장하기 위해 충 저장 영역에 물이 들어있는 비커를 놓습니다. </li><li> 로 RNA 분리에 필요한 충 유충을 수확. 나머지 애벌레 같은 문화에서 그들을 유지, 어른 성숙한 수 있습니다. </li><li> 매월, 그들의 식량 공급을 보충하기 위해 신선한 밀가루와 효모를 포함하는 새로운 플라스크에 가장 적극적으로 딱정벌레를 (더 이상 수백 이상) 전송. </li></ol> 4. T. castaneum 총 RNA 분리 <ol><li> 성인 딱정벌레와 밀가루 / 효모 문화를 분리하여 문화에서 수확 20 충 유충 (각 문화가 500-1000 애벌레 사이에 포함되어야합니다). 밀가루하거나 분쇄하기 전에 딱정벌레에 연결된 효모 입자를 제거합니다. </li><li> 벤치 지역, 박격포 및 딱정벌레를 분쇄하기 전에 ribonucleases의 모든 흔적을 제거하는 RNaseZap (앰비온 주식 회사)이 절차에 사용된 유봉을 (물론 장갑을 치료 고려) 소독. </li><li> 절구와 유봉과 T를 사용하여 미세 분말로 액체 N 2에 애벌레를 갈다추출 버퍼가 추가 때까지 가루가 냉동 유지하도록 액체 N 2를 유지하면서 50 ML의 원심 분리기 튜브에 분말 ransfer. </li><li> 초과 액체 N 2 분말에서 증발 수 있습니다. 액체 N 2 증발 후, 25 MM 트리스 - HCL, 5 MM의 β - 메르 캅 토 에탄올, 1 MM EGTA, 0.1 당연 benzamidine 200 MM KCl, 10를 포함하는 추출 버퍼 200 μl의 충 분말 (20 충 유충 당) 균질 %의 글리세롤, 30 분 얼음 RNasin, 산도 7.5과 부화 10 MM 이미다졸 및 20U. </li><li> 4 20 분 동안 15,000 rpm으로 homogenate를 원심 ° C는 뜨는와 플래시를 수집하는 액체 N 2의 샘플을 동결. 필요한 경우, 샘플은 -80 ° C 하룻밤에 저장할 수 있습니다. </li><li> RNeasy 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 추출합니다. </li></ol> Tribolium의 castaneum의 telomerase 5.에서는 체외의 reconstitution <ol><li> T. 50 μl와 재조합 그의 - TC 태그 TERT 20 μg 믹스 25 MM 트리스 - HCL, 200 MM KCl, 10 % 글리세롤, 5 MM의 β - 메르 캅 토 에탄올, 10 MM 이미다졸, 산도 7.5를 포함하는 바인딩 버퍼에 castaneum 총 RNA. </li><li> 22 두 시간 동안 총 RNA 혼합물 ° T.에 C - TC TERT을 품어 RNA 저하를 방지하기 위해 RNasin 억제제의 존재에 castaneum의 lysate. </li><li> lysate 불순물 및 과도한 RNA를 제거하는 니켈 - NTA 칼럼을 통해 복잡한 정화. </li></ol> 6. Telomerase의 반복 증폭 프로토콜 (트랩)는 assays <ol><li> 니켈 - NTA 정화 T. 4 μg를 섞어 50 μl 신장 버퍼에 castaneum의 telomerase 20 MM를 포함 트리스 - HCL (산도 - 8.3), 7.5 MM MgCl 2, 63 MM KCl, 0.05 % 트윈 20, 1 ㎜ EGTA, 0.01 % BSA, 0.5 MM의 dNTPs, 1 μm의 Tcas - TS DNA 프라이머 (5' - AAGCCGTCGAGCAGAGTC - 3 '), 그리고 60 분 ° C의 재구성 T.하여 Tcas - TS의 DNA 프라이머의 연신율을 허용하는 30 혼합물을 품어 castaneum의 telomerase. </li><li> 반응 혼합물을 페놀 클로로포름의 동일한 볼륨을 추가하여 길쭉한 단일 좌초된 DNA (ssDNA)을 추출합니다. 유제가 균질는 부드럽게 될 때까지 섞은 쉐이크. </li><li> 4 5 분 동안 12,000 rpm으로 샘플을 원심 ° C는 오염 물질의 ssDNA 분리 수 있습니다. </li><li> 1.5 ML eppendorf 튜브에 샘플의 정상 수성 층을 전송, 10 MM NaOAc (산도 5.0)의 최종 농도, MgCl 2 1 ㎜와 66.4 % EtOH 후 -20에서 하룻밤을 촉진하기 위해 샘플을 허용을 추가 ° C. </li><li> 4 삼십분을 위해 15,000 RPM에서 샘플을 스핀 ° C를 펠렛 시켰던 ssDNA 수 있습니다. pipettor를 사용하여 솔루션을 가만히 따르다 다음 예제에서 남은 NaOAc 및 MgCl 2 씻어 샘플을 70 % EtOH 200 μl를 추가합니다. 다시 펠렛 샘플에 동일한 속도와 온도에서 5 분 동안 샘플을 원심 분리기. </li><li> pipettor를 사용하여 EtOH 솔루션을 가만히 따르다하여 eppendorf 튜브 세 분 상온에서 열 부화함으로써 에탄올의 남은 흔적을 제거합니다. 예제에서 에탄올 선물 것은 PCR의 증폭 단계에 방해가됩니다. </li><li> 10 MM 트리스 - HCL (산도 8), 50 MM KCl, 2 MM MgCl 2, 100 μm의 dNTPs를 (dATP, 포함하는 PCR 반응 버퍼의 50 μl의 ssDNA 펠렛을 (telomerase 길쭉한 제품과 Tcas - TS의 프라이머를 포함) Resuspend dGTP 및 dTTP), 10 μm의 [32 P] dCTP, 1 μm의 Tcas - CX 프라이머 (5' - GTGTGACCTGACCTGACC - 3 ')와 1.25 U DNA 형성 촉매의 DNA 중합 효소. </li><li> PCR들은 12 % polyacrylamide 젤에서 볼 수 있도록 telomerase의 연신율 제품 (94 ° 30 초 동안 C, 50 ° 30 초 동안 C, 72 ° C에 대한 일분의 29 사이클)을 증폭. </li><li> 트리스 - Borate - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (TBE)이 44.5 MM 트리스, 44.5 MM 붕산, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 서른 분 산도 8 전에 PCR 샘플을 실행하기를 포함하는 버퍼를 실행과 함께 12 % 젤을 미리 실행합니다. 사전 실행 및 PCR 반응으로 젤로드 후, 섭씨 또는 얼음에 4 명이에서 1.5-2 시간 동안 185 볼트에서 젤을 실행합니다. </li><li> 젤 건조하고 활동을 시각화하기 위해 형광체 이미징 플레이트를 사용합니다. </li></ol> 7. 대표 결과 : 크기 배제 크로마 토그래피 후 정화 TC TERT의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 정제 후 농축 단백질은 12% SDS - polyacrylamide 젤에서 실행되며 순수 이상 99% (그림 2A)로 표시됩니다. 크기는 제외 (S200) 크로마토 그램은 또한 순수와 정화 단백질 샘플에서 집계 부족을 설명하기 (그림 2B) 제공됩니다. 최종 생산량은 달라질 수 있지만 완료된 모든 정화 단계 후 5 MG 단백질의 수율은 보통 얻어진다. 재구성 T.에 대한 대표적인 함정 분석 이전 미첼 외 의해 보고된로 castaneum의 telomerase는 그림 3에 표시됩니다. 12. telomerase 제품의 단계 현명한 사다리는하지만, 레인 1에서 볼 수있다그들은 차선이 각각 3 RNase 취급 telomerase 및 TERT 활성 사이트에 돌연변이 (D251A) 샘플 모두에 결석하고 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2799/2799fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 재조합 TC TERT의 reconstitution에 관련된 단계 플로우 차트. 첫째, 재조합 TC TERT는 E. 언덕에 표시됩니다 대장균. 단백질은 다음 니켈, 양이온 교환 및 크기 배제 크로마 토그래피에 의해 정화됩니다. T. castaneum 딱정벌레는 집안에 교양하고 그들의 애벌레는 총 RNA를 분리하는 데 사용됩니다. 정화 TC TERT와 총 RNA는 다음 reconstitute telomerase의 RNP 단지를 혼합하고 있으며, 후속 트랩 분석이 RNP 복합을 확인하는 데 사용되는 것은 활성 telomerase입니다. <img src="/files/ftp_upload/2799/2799fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. TC TERT 단백질의 크기 제외 크로마토 그램 및 SDS 페이지 분석. 크기 배제 크로마 토그래피 후 TC TERT 단백질의 (A) 12% SDS - polyacrylamide 젤. 그것이 높은 isoelectric 포인트 (PI - 9.8)를 가지고 있기 때문에 TC TERT 단백질 (70 KDA)는 SDS 페이지 젤에 신속하게 마이 그 레이션합니다. TC TERT의 단백질 (B) 사이즈 제외 크로마토 그램 (Superdex S200). <img src="/files/ftp_upload/2799/2799fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 체외에의 트랩 assays는 Tribolium castaneum의 telomerase가 미첼 외에서 맞게 재구성. 12. 레인 1 : 야생 타입 TC TERT와 총 RNA는 벌레의 유충으로부터 격리. 레인 2 : 야생 유형 TC TERT와 RNase는 애벌레의 총 RNA와 세포 추출물을 처리. 레인 3 : 활성화된 사이트의 돌연변이 TC TERT (D251A)와 벌레의 유충의 총 애벌레의 RNA.

<ol><li>Gillis, A. J., Schuller, A. P., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Tribolium+castaneum+telomerase+catalytic+subunit+TERT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Tribolium castaneum telomerase catalytic subunit TERT.</a> Nature. 455, 633-637 (2008).</li>
<li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+specific+telomere+terminal+transferase+activity+in+Tetrahymena+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.</a> Cell. 43, 405-413 (1985).</li>
<li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345, 458-460 (1990).</li>
<li>Hayflick, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Limited+in+vitro+Lifetime+of+Human+Diploid+Cell+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The Limited in vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains.</a> Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).</li>
<li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres%3A+no+end+in+sight%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomeres: no end in sight.</a> Cell. 77, 621-623 (1994).</li>
<li>Kim, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+association+of+human+telomerase+activity+with+immortal+cells+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.</a> Science. 266, 2011-2015 (1994).</li>
<li>Bodnar, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+life-span+by+introduction+of+telomerase+into+normal+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells.</a> Science. 279, 349-352 (1998).</li>
<li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+telomere+terminal+transferase+of+Tetrahymena+is+a+ribonucleoprotein+enzyme+with+two+kinds+of+primer+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity.</a> Cell. 51, 887-898 (1987).</li>
<li>Greider, C. W., Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+telomeric+sequence+in+the+RNA+of+Tetrahymena+telomerase+required+for+telomere+repeat+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis.</a> Nature. 337, 331-337 (1989).</li>
<li>Jacobs, S. A., Podell, E. R., Cech, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+essential+N-terminal+domain+of+telomerase+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the essential N-terminal domain of telomerase reverse transcriptase.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 218-225 (2006).</li>
<li>Rouda, S., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+RNA-binding+domain+of+telomerase%3A+implications+for+RNA+recognition+and+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structure of the RNA-binding domain of telomerase: implications for RNA recognition and binding.</a> Structure. 15, 1403-1412 (2007).</li>
<li>Mitchell, M., Gillis, A., Futahashi, M., Fujiwara, H., Skordalakes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+telomerase+catalytic+subunit+TERT+binding+to+RNA+template+and+telomeric+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for telomerase catalytic subunit TERT binding to RNA template and telomeric DNA.</a> Nat Struct Mol Biol. 17, 513-518 (2010).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기서 제시하는 방법은 T.의 촉매 subunit의 대량 생산을 허용 구조적 및 생화 학적 연구에 대한 가용성, 적극적인 형태로 castaneum의 telomerase의 TERT. TC TERT 통해 표현의 방법은 위에서 언급한 이들의 온도 또는 셀 밀도에 미묘한 변화에 민감하고 극적으로 단백질 표현의 수준에 영향을 줄 수 있습니다. 특히, 우리는 광학 밀도가 600 나노미터에서 0.5에 도달하기 전에 단백질 발현을위한 세포를 유도하거나, 30의 온도를 낮추면 ° C 유도 전에 단백질 수율에 상당한 감소에 이르게 것으로 나타났습니다. 정화의 측면에서, TC TERT 단백질은 기본 isoelectric 포인트 (PI - 9.8)을 보유하고 있으므로 양이온 교환 컬럼에 긴밀하게 바인딩하는 기능은 높은 소금으로 샘플을 로딩하고 씻는하여 순수한 단백질 시료를 얻을 수로 악용될 수 농도. 관심 단백질이 프로토콜은 음이온 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 로제타 (DE3) plysS 셀 </td><td> Novagen </td><td> 70,956 </td></tr><tr><td> 2YT 맛을 </td><td> Teknova </td><td> Y0215 </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> 골드 생명 공학 </td><td> I2481C </td></tr><tr><td> MISONIX Sonicator 3000 </td><td> Qsonica, LLC. </td><td></td></tr><tr><td> 악타 정수기 FPLC </td><td> GE 생명 과학 </td><td></td></tr><tr><td> NI - NTA의 Superflow 수지 </td><td> Qiagen </td><td> 30,410 </td></tr><tr><td> Amicon 울트라 - 15 원심 필터 장치 </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> 포장 POROS 50 HS 강한 양이온 교환 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 1-3359-06 </td></tr><tr><td> 포장 POROS 50 HQ 강한 양이온 교환 </td><td> 응용 Biosystems </td><td> 1-2559-06 </td></tr><tr><td> Superdex 200 3백분의 10 사이즈 - 제외 칼럼 </td><td> GE 생명 과학 </td><td> 17-5175-01 </td></tr><tr><td> 페놀 : 클로로포름 : 10mM 트리스, 산도 8, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 Isoamyl 25:24:1 </td><td> 시그마 </td><td> P3803 - 100mL </td></tr><tr><td> RNaseZap </td><td> 앰비온 </td><td> AM9780 </td></tr><tr><td> 재조합 Rnasin의 Ribonuclease 억제제 </td><td> Promega </td><td> N251B </td></tr><tr><td> RNeasy 미니 키트 </td><td> Qiagen </td><td> 74,104 </td></tr><tr><td> 의 DNA oligonucleotides </td><td> 통합 DNA 기술 </td><td></td></tr></tbody></table>

활성 t.의 체외의 reconstitution에서 castaneum의 telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

telomerase의 촉매 subunit을 분리하기 위해 노력 TERT은 구조적 연구를위한 충분한 수량에 10 년 이상 제한된 성공을 만나왔다. 여기, 우리는 재조합 Tribolium castaneum TERT (TC TERT)의 분리 및 활성 T.의 reconstitution에 대한 방법을 제시 체외에서 castaneum의 telomerase의 ribonucleoprotein (RNP) 복잡한. Telomerase는 엔드 - 투 - 엔드의 융합과 파괴로부터 그들을 보호하기 위해 제공 선형 염색체 2의 3 &#39;끝에 telomeres라는 짧은 DNA의 반복을, 추가 전문 역방향 transcriptase 1입니다. DNA 복제에 따라, 짧은 세그먼트는 염색체 3의 끝에와 telomerase없이 손실, 세포는 결국 자신의 헤이 플릭 한계 4에 도달하기 전까지 나누어 진행합니다. 또한, telomerase는 성인에서 가장 체세포 5 휴면이지만, 그것이 세포 영생에게 7 증진 암세포 6 활성화됩니다. 효소의 촉매 subunit와 템플릿 TERT가 telomeres 8,9를 합성하는 데 사용하는 포함하는 필수적인 RNA 구성 요소 (터)를 구성되어 단백질 subunit (TERT) : 최소한의 telomerase 효소는 두 핵심 구성 요소로 구성되어 있습니다. 이전 2008 개별 telomerase 도메인에 대해서만 구조는 10,11을 해결했다. 이 분야에 주요 돌파구는 활성 12 결정 구조의 결정, T.의 촉매 subunit에서 온 castaneum의 telomerase, TC TERT 1. 여기서는 구조적 및 생화 학적 연구에 대한 적극적인, 용해 TC의 TERT, 그리고 telomerase 활동 assays에 대한 체외에서 telomerase의 RNP 복합 reconstitution의 대량 생산을위한 방법을 제시한다. 사용된 실험 방법의 개요는 그림 1에 표시됩니다.

telomerase의 촉매 subunit을 분리하기 위해 노력 TERT은 구조적 연구를위한 충분한 수량에 10 년 이상 제한된 성공을 만나왔다. 여기, 우리는 재조합 Tribolium castaneum TERT의 절연 (대한 방법을 제시<em&gt; TC</em&gt; TERT)와 활성의 reconstitution<em&gt; T. castaneum</em&gt; telomerase의 ribonucleoprotein (RNP) 복잡한<em&gt; 체외에서</em&gt;.

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

구조 연구에 충분한 양의 텔로머라제 촉매 소단위체인 TERT를 분리하려는 노력은 그동안 제한적인 성과만을 거두었으며...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 Trium Castine 텔로머라제를 인비트로(in vitro)에서 재구성하고 그 활성을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 recombinant his tag, Trillium Castine turt 또는 TC turt 단백질을 e coli에서 발현시킵니다. 발현된 TC turt 단백질은 이후 다양한 크로마토그래피 단계를 통해 정제됩니다.다음 절차 단계는 가루좀(trium Castine beetles)을 배양하고 가루좀 유충으로부터 총 RNA를 분리하는 것입니다. 그 다음, 재조합 TC turt와 추출된 총 RNA를 혼합하여 체외(in vitro)에서 텔로머라제 효소를 재구성합니다. 최종적으로, 재조합 단백질과 총 RNA로 체외에서 재구성된 텔로머라제가 TRAP 어세이에서 시각화되는 바와 같이 텔로머라제 효소 활성을 나타낸다는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 trium KE telomerase에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 단백질-핵산 복합체와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자는 어려움을 겪을 수 있는데, 이는 딱정벌레의 total RNA 분리가 RNA 분해에 매우 민감하여 적절한 재구성을 보장하기 위해 각별한 주의가 필요하기 때문입니다. 본 프로토콜은 서면 프로토콜에 기술된 대로, tobacco etch virus protease 절단 가능 N-terminal HEXA histamine tag가 포함된 recombinant TC TURP를 형질전환된 Rosetta DE3 pLysS 세포에서 발현시키는 것으로 시작합니다. 세포를 수확한 후, 약 51 watts의 출력으로 32초 간격의 작동과 32초의 휴지기를 반복하며 얼음 위에서 2분 동안 세포를 초음파 처리합니다.용해된 세포를 18,000 RPM에서 20분 동안 원심 분리하여 수용성 단백질 분획과 불용성 단백질 분획을 분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 작성된 프로토콜에 따라 니켈 친화성 크로마토그래피를 사용하여 상층액을 정제합니다. imidazole 구배를 사용하여 니켈 NTA 레진에서 TC turt를 용출시키고 3 mL씩 분획을 수집합니다.SDS-PAGE 분석을 위해, 페이지 분석을 수행하여 어떤 분획에 TC turt 단백질이 포함되어 있는지 확인하십시오. 해당 분획들을 AmCon 30 kilodalton Millipore 필터를 사용하여 10

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은의 합성 tRNA 기판의 준비에 대해...

Entamoeba histolytica DNA와 tRNA Methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) 효소를 체외 tRNA의 Methylation 분석에서

정확하고, 짧은 정교하고 저렴한 방법은 여러 조직과 QRT-PCR을 사용하여 종 텔로미어 길이를 평가하는 것을 설명합니다. 또한, 우리는 텔로미어 길이 보완 백본 시험으로 telomerase의 활동을 평가하는 간단한 분석을 설명합니다.

텔로미어의 길이와 텔로 머라 제 활성을 세포 노화의 음과 양

텔로머라제는 신생아 뇌와 성인 뇌의 뚜렷한 영역에서 발현됩니다. 우리는 마우스 뇌의 다양한 영역에서 텔로머라제 활성을 분석하고 남성과 여성 마우스 뇌 간의 텔로머라제 활성의 차이를 감지하기 위한 무독성 시간 절약 TRAP 분석을 제시합니다.

마우스 뇌의 다양한 지역에서 텔로 머라 제 활동 : 비 방사성 텔로 머라 제는 증폭 프로토콜을 반복 (TRAP) 분석

이 프로토콜은 근육 또는 피부 조직에서 근육 및 섬유아세포 세포주의 살아있는 세포를 분리하고 1차 배양하는 기술을 설명합니다.  이러한 세포주를 불멸화하는 기술도 설명됩니다.  전체적으로 이러한 프로토콜은 다운스트림 애플리케이션을 위해 환자 유래 세포를 생성하고 보존할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.

질병 모델링을위한 근육 조직 검사에서 환자 유래 세포주의 분리 및 멸화

텔로미어와 텔로머라제는 노화와 종양 형성에 필수적인 역할을 합니다. 이 프로토콜의 목표는 두 개의 쥐 유도성 텔로머라제 넉인 대립유전자를 생성하는 방법과 조직 퇴행/재생 및 암 연구에 이를 활용하는 방법을 보여주는 것입니다.

조직의 변성 / 재생 및 암의 연구에서 설치류 유도 성 텔로 머라 대립 유전자를 활용

이 작업에서는 활성 인핸서를 식별하고 실험적으로 검증하는 방법에 대한 실험적 워크플로를 제공합니다.

예측 및 유전자 규제 요소의 검증은 레티노 산 유도 배아 동안 활성화 된 세포 분화 줄기

단백질은 종종 다른 세포 기능을 발휘할 수있는 여러 도메인을 포함한다. 유전자 녹아웃 (KO)이 기능의 다양성을 고려하지 않는다. 여기, 우리는 다양한 기능 영역 또는 단백질의 변이의 분자 해부를 허용 KO 배아 줄기 세포에서 재조합 중재 카세트 교환 (RMCE) 기반 구조 - 기능 접근 방식을보고합니다.

재조합 효소 매개 카세트 교환을 사용하여 마우스 배아 줄기 세포의 구조 - 기능 연구

인간의 telomerase 역전사 (TERT) telomeric DNA 뿐만 아니라 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동을 통해 이중 가닥 RNA 합성. 여기, 내 생 TERT의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동을 검출 하기 위하여 새로 설립된 된 분석 결과 설명 합니다.

인간의 Telomerase 역전사 단백질의 RNA 의존 RNA 중 합 효소 활동의 반 정량적 검출

여기, 우리 남부 럽 그리고/또한 PCR를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 발생 하는 동종 재결합 이벤트를 식별 하는 데 자세한 프로토콜 제시. 이 메서드는 nonmuscle myosin II 유전자 대체 마우스 모델 기술을 사용 하 여 전통적인 배아 줄기 세포 기반 동종 재결합 중재 대상의 세대에 의해 exemplified입니다.

마우스 배아 줄기 세포 사용 하 여 남부 럽 연쇄 반응에서에서 동종 재결합 이벤트의 식별

분자 마커로 γH2AX 형성을 사용하여 DNA 이중 스트랜드 줄무늬의 부량 방사선 생물학에서 매우 중요한 도구가되었습니다. 여기 우리는 방사선에 노출 후 세포의 γH2AX foci의 부량위한 immunofluorescence 분석의 사용을 보여줍니다.

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

학습하세요 Tribolium castaneum 텔로머라제의 체외 재구성 및 활성 분석 방법을. 재조합 Tc TERT 단백질을 대장균에서 발현·정제하고, 딱정벌레 유충에서 추출한 총 RNA와 혼합하여 활성 효소를 재구성합니다. 이 방법은 텔로머라제 구조 및 기능 연구에 활용됩니다.

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

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