Name: Axonal 상해 다음 도설 루트 신경 조직에서 염색질의 Immunoprecipitation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 학습하세요 축삭 손상 후 도설 루트 신경절 조직에서 염색질 면역침전법을 이용하여 전사인자 결합 부위와 후성유전적 변형을 식별하는 방법. 이 기술은 말초 및 중추신경계 축삭 재생 연구에 활용됩니다.

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우리는 미세 조정 칩에 대한 조건에 자신의 기여에 대한 실험과 리코 린드너의 초기 칩 실험 설정에 대한 도움 안드레아 테데스키 감사하고 싶습니다. 이 작품은 Hertie 재단에 의해 지원되었다; 포춘 그랜트, Tuebingen 대학 및 DFG DI 1497/1-1 보조금 (모든 시몬 디 지오 바니 부여).

1. 좌골 &amp; 지느러미 열 신경 손상 <ol><li> 동물은 수술 수건에 위치하고 아래 thermopad 37에서 마우스의 체온을 유지 ° C. 절차 전반에 걸쳐 존재입니다 모든 동물은 지속적인 O / isoflurane이 관리와 수술 anesthetized 있습니다. 외과 용구는 절차 전에 autoclaved 있습니다. </li><li> 좌골 신경통의 부상, 두 엉덩이쪽에 신중하게 면도 있으며, 왁스는 사전 Betadyne 3 회 다음 알코올로 피부를 클렌징하는 일반 헤어 제거제와 함께 완료됩니다. </li><li> 좌골 신경은 4mm의 절개가 후부과 피부를 통해 중반 허벅지에있는 대퇴골을 병행함으로써 훌륭한 포셉과 팔뚝의 femoris의 간격 근육을 확산하여 노출됩니다. </li><li> 노출된 좌골 신경이 그 부상하고, 피부가 두 봉합 클립과 함께 닫힙니다. </li></ol> 참고 : 동일한 절개가 좌골 신경을 노출했다지만, 상처가 가짜 부상에 대한 신경은 그대로 둔 폐쇄 봉합합니다. <ol start="5"><li> 등의 열 손상의 경우 마우스의 뒷면을 세심하게 면도하고, 왁스는 이전에 알코올 스프레이 / 강타와 함께 피부를 클렌징하는 일반 헤어 제거제와 함께 완료됩니다. </li><li> 척수는 T7 약에서 T13에 2.5 cm의 절개하여 노출됩니다. 피부는 별개로 확산되고 결합 조직은 T9에서 T11로 척추를 따라 제거됩니다. </li><li> laminectomy는 T10 수준에서 수행됩니다 </li></ol> 참고 : 대부분의 실험은 laminectomy가 위장 부상으로 간주됩니다. <ol start="8"><li> Xylocain 몇 방울이 코드를 마취시키다하기 위해 조직에 추가되며, 두라 메이터는 척수를 만지지 않도록주의를 기울이고, 제거됩니다. </li><li> 지느러미 열은 부상되고 근육은 다시 척수를 만지지 않도록주의를 기울이고 닫기 봉합합니다. 마지막으로, 피부 봉합 클립과 함께 폐쇄 봉합합니다. Buprenorphine (0.1 밀리그램 / kg 체중)을 48 시간 또는 더 이상 필요하지 않은까지 매일 두 번 실시한다. </li></ol> 2. 교차 연결 <ol><li> euthanization 후 부상 생쥐에서 L4 및 L5 DRG를 해부하다. 얼음처럼 차가운 HBSS + 프로 테아제 억제제 칵테일 (2 4 동물의 총 각 동물의 부상과 2 사기 DRG)에 16 DRG 총를 수집합니다. </li><li> 간단히 DRG를 원심 후, 조심스럽게 37 HBSS를 제거하고 PBS + 프로 테아제 억제제 칵테일의 1 % 포름 알데히드 500 μl를 추가하고 30 분 샘플을 품어 ° C. </li></ol> 임계 단계. 신선한, 분자 생물학의 등급 포름 알데히드를 사용하십시오. <ol start="3"><li> 실온에서 5 분간 고정과 부화를 중지 글리신 125 MM을 추가합니다. </li><li> 간단히, 원심 분리기 버퍼를 대기음, 500 μl 얼음처럼 차가운 PBS + 프로 테아제 억제제 칵테일과 함께 두 번 조직을 씻으십시오. </li></ol> 3. 핵의 준비와 염색질의 전단 <ol><li> PBS를 대기음, SDS의 용해 버퍼 400 μl를 추가 미리 차게 microcentrifuge 관에 전송하고, micropestle로 약 30 스트로크와 조직을 방해. </li></ol> 임계 단계. 용해 및 조직의 혼란은 가교 염색질의 좋은 수율을 위해 매우 중요합니다. <ol start="2"><li> 8 펄스, 70 % 출력 (Bandelin, Sonoplus GM70) 각 10초와 샘플을 Sonicate. </li></ol> 주의. 염색질의 전단은 특정 sonication을 위해 최적화된되어야합니다 설정하고 염색질의 적절한 조각은 (섹션 3 참조) 실제 IP 실험을 실행하기 전에 확인하여야한다. 염색질의 참고. 파쇄도 micrococcal nuclease (MNase) 소화에 의해 수행 수 있습니다. MNase는 소화가 기본 조직 염색질의 immunoprecipitation을 위해 선호되는 동안 경험 원칙적으로, sonication에 의해 분열이 고정 조직이 선호됩니다. 교차 연결된, 가지각색 염색질은 최대 2 개월까지 -80 ° C에 보관하지만, 반복되는 동결 / 해동 사이클을 피할 수 있습니다. 4. 염색질 소화의 분석 (권장) <ol><li> 분석을위한 가지각색 염색질 샘플 10 μl를 제거합니다. 샘플에 NaCl 200 MM을 추가하고 2 시간을위한 65 ° C를 잠복기하여 상호 링크를 역방향. </li><li> DNA를 (8 항 참조) 정화하고 1 % 아가로 오스 겔을 실행합니다. DNA는 약 200-1000 BP (그림 1)의 길이로 조각난해야합니다. </li></ol> 불완전한 조각이 감소 해상도 및 증가 배경에 이끌면서 염색질의주의. 오버 - 조각이 감소 신호가 발생할 수 있습니다. 5. Immunoprecipitation <ol><li> immunoprecipitation 반응의 숫자를 (아래 참고 참조) 확인하고, 마찬가지로 새로운 튜브에 샘플을 나눕니다. 각각의 볼륨을 가지고최대 칩 버퍼 + 테아제 억제제 칵테일 500 μl 수 있습니다. </li><li> 당신의 희석 시료의 5 μl를 제거하고 새 튜브로 전송할 수 있습니다. 이것은 1 %의 입력 샘플이며 필요 때까지 그것은 (제 7) -20 ° C에 저장됩니다. </li><li> 각 immunoprecipitation 들어, 적절한 항체 또는 일반 IgG 컨트롤을 추가하고 회전 ° C 하루 4 알을 품다. </li></ol> 참고. immunoprecipitation의 번호, 긍정적인 컨트롤 (예 : 히스톤 H3 항체)과 대조군 (일반 IgG)를 결정할 때 고려되어야합니다. 각 IP에 사용되는 항체의 수량 항체 사이에 다양하고 경험적으로 결정되어야합니다. 그러나, 그것은 2-10의 범위 이내인가? G / immunoprecipitation. <ol start="4"><li> 귀하의 항체 / 단백질 / DNA 복잡한 immunoprecipitate하려면, 칩 학년 단백질 G 자성 비즈의 30 μl를 추가하고 4 2 H에 대한 품어 ° C를 회전. </li></ol> 6. 세탁 <ol><li> 풀다운 바운드 염색질 - 구슬 복잡한하려면 자기 랙에 튜브를 놓으십시오. 솔루션은 명확하고 신중하게 뜨는을 제거할 때까지 기다리십시오. </li><li> 비즈로 낮은 소금 세척 1 ML (칩 버퍼)을 추가하고 4 품어 ° C를 회전 3~5분에 대한 다음 구슬을 내리고 단계 6.1에서와 같이 세척을 대기음. 3 세척 총에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> 비즈 높은 소금 세척 버퍼 1 ML (칩 버퍼 + 350 MM NaCl)을 추가하고 구슬을 내리고 단계 6.1에서와 같이 세척을 대기음 다음, 회전 3~5분을위한 부화. </li></ol> 7. 용출 및 상호 연결의 반전 <ol><li> -20의 입력 샘플을 꺼내서 ° C는, 칩 용출 버퍼 150 μl를 추가하고 단계 7.5까지 실온에서 따로 설정할 수 있습니다. </li><li> 6.3 단계에서 각 IP 샘플 1X 칩 용출 버퍼 150 μl를 추가합니다. </li><li> thermomixer에 튜브를 삽입하고 ° C 부드러운 vortexing 30 분 65 샘플을 잠복기로 비즈에서 염색질을 elute. </li><li> 자기 선반에 구슬을 아래로 당겨, 조심스럽게 새로운 튜브로 eluted 염색질 (뜨는)를 전송합니다. </li><li> 귀하의 입력 샘플을 포함하여 모든 튜브에 2 시간 동안 NaCl 40 65 μg / Proteinase K와 부화의 반응 ° C의 200mM를 추가합니다. </li></ol> 참고. 용출 단계도 상온에서 수행할 수 있지만, 그것으로 효율적이지 않습니다 수 있습니다. 8. DNA 복구 <ol><li> 30 초 동안 단계 7.5과 와동에서 샘플로 / 페놀 클로로포름 1 볼륨을 추가합니다. </li><li> 5 분 룸 온도에서 microcentrifuge의 최대 속도로 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 수성 (어퍼) 새로운 튜브로 위상, 수성 단계로 클로로포름 1 볼륨을 추가하고 30 초 동안 와동을 복구합니다. </li><li> 5 분 룸 온도에서 microcentrifuge의 최대 속도로 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 새로운 튜브로 수성 (어퍼) 단계를 복구 후, 얼음처럼 차가운 100 % 에탄올 20 μg / 글리코겐의 반응, 그리고 2.5 볼륨을 NaOAc의 300mM 추가할 수 있습니다. </li></ol> 주의. 같은 글리코겐으로 이동 통신사의 추가는 비교적 작은 크기의 DNA 조각의 강수량을 향상시키기 위해 필요합니다. <ol start="6"><li> ° C 2 시간 동안 침전의 DNA를 -80에서 알을 품다. </li></ol> 참고. 강수량 단계도 -20 ° C.에서 하룻밤을 수행할 수 있습니다 <ol start="7"><li> 4 20 분 microcentrifuge의 최대 속도로 샘플을 원심 ° C. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 제거하고 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올 300 μl와 시켰던 DNA의 알약을 씻으십시오. </li><li> 4 10 분 microcentrifuge의 최대 속도로 샘플을 원심 ° C. </li><li> 조심스럽게만큼 뜨는 가능한 제거하고 알약은 공기 건조하게. </li><li> 무균 H 2 O. 20 μl에 Resuspend 샘플 지금은 PCR을위한 준비, 또는 DNA는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol> 9. 대표 결과 좌골 신경통의 병변에 따라 DRGs의 칩 실험의 대표적인 결과는 (그림 1 및 2) 표시됩니다. 첫째, 우리는 약 200-1000 BP (그림 1)의 길이로 조각난 DNA를 보여줍니다. 둘째, 우리는 단백질 43 (GAP - 43) 전용시 좌골 신경 손상 (레인 4, 그림 2, 5 ') 관련된 성장의 근위 모터에서 PCR 신호 다음과 같은 칩을 보여줍니다. 없음 PCR 신호 동물은 가짜 상처를 받고 (레인 3) 때 존재하지 않으며 IP (레인 5와 6)에 대한 정상 혈청 IgG를 사용하는 경우. 항체의 특이성에 대한 테스트하려면, 우리는 같은 DNA 샘플을 분석,하지만 숙박이 예상되지 관심을 우리의 유전자의 3' - UTR에서 영역을 감지 제어 프라이머 세트를 사용했습니다. PCR 신호는 표준 PCR 컨트롤 같은 비 - IP DNA 샘플을 나타내는 입력 신호를 제외한 모든 차선 (차선 3-6 그림 2, 3 '), (레인 1-2, Figu에서 결석 아르다시 2). 회로도 (그림 3)에 요약로 칩 절차 중 좌골이나 척추 등의 부상 열 다음을 수행할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 조각 길이의 적절한 범위를 sonication으로 가지각색으로 잘리고 반대로 교차 연결된 DNA의 그림 1. 아가로 오스 겔. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. acetylated p53의는 GAP - 43 48 시간 좌골 신경 손상 후 근위 발기인 지역에 바인딩되는 보여주는 좌골 신경 병변 다음 DRG 조직에서 세미 양적 PCR 결과. 제어 PCR acetylated p53의는 GAP - 43 유전자 (S = 섐 전 = 부상자)의 3' - 번역되지 않은 지역 (UTR)에있는 DNA의 제어 영역에 바인딩하지 않는 것과 같은 DRG 조직 쇼에서. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 좌골 신경에 병변 사이트의 위치, 그리고 등의 열의를 보여주는 일반적인 다이어그램.

<ol><li>Beirowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+analysis+of+Wallerian+degeneration+using+restricted+axonal+labelling+in+YFP-H+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).</li>
<li>Carey, M. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarey%2C+MF+%22Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%22">Chromatin immunoprecipitation (ChIP)</a>. , Cold Spring Harb. Protocol. (2009).</li>
<li>Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+%28%26mu%3BChIP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (&mu;ChIP.</a> Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).</li>
<li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation%3A+optimization%2C+quantitative+analysis+and+data+normalization.+Plant+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods.</a> 11, 3-11 (2007).</li>
<li>Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li>
<li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li>
<li>Makwana, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+in+successful+peripheral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+J%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration.</a> Febs J. 272, 2628-2638 (2005).</li>
<li>Tedeschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+p53-CBP%2Fp300+transcription+module+is+required+for+GAP-43+expression%2C+axon+outgrowth%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).</li>
<li>Teng, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regeneration+in+adult+CNS+neurons--signaling+molecules+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways.</a> J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 직접 axonal 부상 다음과 같은 성인 신경계의 axonal 중생 중에 염색질 환경에 대해 문의하는 방법을 제공합니다. 그것은 PNS 또는 CNS를 하나에 부상 이후 transcriptional 및 epigenetic 환경을 탐사하기 위해 염색질 immunoprecipitation와 DRG 상해 모델을 포함합니다. 그것은 자신이 좋아하는 전사 인자에 대한 putative 구속력이 사이트를 특성화하고 싶습니다,이 사이트의 수용 인원은 부상에 대한 응답으로 발생 여부를 확인하는 조사에 특히 유용합니다. 해당 사이트에서 histones과 DNA의 Epigenetic 변경도 동시에 모니터링할 수 있습니다. 우리가 이전에 (테데스키 외., 2009)보고와 유사한 프로토콜은 얼굴 신경 핵이 brainstem의 해부와 칩으로 처리할 수 안면 신경 병변, 다음을 수행할 수 있습니다. 염색질의 immunoprecipitation의 assays에 관해서는 전형적...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 10X 칩 버퍼 </td><td> 세포 신호 </td><td> 7008 </td></tr><tr><td> 2X 칩 용출 버퍼 </td><td> 세포 신호 </td><td> 7009 </td></tr><tr><td> 칩 학년 단백질 G 자성 비즈 </td><td> 세포 신호 </td><td> 9006 </td></tr><tr><td> 마그나 그립 랙 (물론 8) </td><td> Millipore </td><td> 20-400 </td></tr><tr><td> 클로로포름 </td><td> 머크 </td><td> UN 1888 </td></tr><tr><td> 37 % 포름 알데히드 </td><td> 로스 </td><td> CP10.1 </td></tr><tr><td> 10X 글리신 솔루션 </td><td> 세포 신호 </td><td> 7005 </td></tr><tr><td> 글리코겐 </td><td> 시그마 </td><td> G1767 </td></tr><tr><td> 10X HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14,185 </td></tr><tr><td> 히스톤 H3 항체 (토끼) </td><td> 세포 신호 </td><td> 2650 </td></tr><tr><td> 일반 래빗 IgG </td><td> 세포 신호 </td><td> 2729 </td></tr><tr><td> 페놀 / 클로로포름 / Isoamyl 알코올 </td><td> 로스 </td><td> A156.1 </td></tr><tr><td> 프로 테아제 억제제 칵테일 정제 </td><td> 로체 </td><td> 04 693 116 001 </td></tr><tr><td> Proteinase K (20 MG / ML) </td><td> 세포 신호 </td><td> 10,012 </td></tr><tr><td> SDS 용해 버퍼 </td><td> 북부 </td><td> 20-163 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> 장비 필요 </th></tr><tr><td> Sonicator </td></tr><tr><td> Micropestle </td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td></tr><tr><td> Thermomixer </td></tr></tbody></table>

axonal 상해 다음 도설 루트 신경 조직에서 염색질의 immunoprecipitation

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

주변 신경계 (PNS)에 그가 부상 후 제한된 범위 (탱 외., 2006)으로 재생을하는 동안 중추 신경계 (CNS)에 Axons이 재생되지 않습니다. 이것은 neurite 및 axonal 가지 필수 transcriptional 프로그램 PNS (Makwana 외., 2005)의 부상에 따라 활성화되는 인식됩니다. 그러나 생체내로의 연결을 유전자 규제를 분석에 사용할 수있는 도구가 제한되어 종종 도전하고 있습니다. CNS와 PNS 모두 같은 소마에서 발생하는 bifurcated 축삭에 의해 innervated 때문에 지느러미 루트 신경 (DRG)는 훌륭한 상해 모델 시스템을 제공합니다. 신경은 모든 transcriptional 이벤트가 발생 세포 기관의 이산 컬렉션을 대표하고, 따라서 쉽게 reproducibly 동물에서 제거할 수 있습니다 transcriptional 활동의 명확하게 정의된 영역을 제공합니다. axonal 중생이 발생 PNS (예 : 좌골 신경)에서 신경 섬유의 부상은 재생이 장소 (예 : 척수을하지 않습니다 어디 CNS에서 비슷한 부상에 대응 사람에서 구분되는 transcriptional 프로그램의 집합을 공개합니다 ). 히스톤, 바인딩 전사 인자와 부상에서 PNS 또는 CNS 중 하나에 발생 DNA 조작을위한 사이트는 염색질 immunoprecipitation을 (칩)을 사용하여 특징하실 수 있습니다. 여기, 우리는 axonal 부상을 다음과 고정 마우스 DRG 조직을 사용하여 칩 프로토콜을 설명합니다. 이 강력한 결합은 axonal 재생을 촉진하는 데 필요한 프로 재생 염색질 환경을 특성화를위한 수단을 제공합니다.

우리는 axonal 부상 다음 지느러미 루트 신경 조직에서 염색질 immunoprecipitation을위한 방법을 제시한다. 접근 방식은 특정 전사 인자 바인딩 사이트와 주변 및 중추 신경계 모두에서 부상을 axons의 재생을위한 히스톤 및 DNA의 중요한 epigenetic 수정을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

Axonal 상해 다음 도설 루트 신경 조직에서 염색질의 Immunoprecipitation

중추신경계(CNS)의 축삭은 재생되지 않는 반면, 말초신경계(PNS)의 축삭은 ... 이후 제한적인 범위 내에서 재생됩니다.

이 실험 과정의 전반적인 목표는 신경 손상 후 후근신경절 조직에서 가교 결합된 단백질-DNA 복합체를 면역 침전시키는 것입니다. 이는 먼저 좌골 신경 또는 후주 손상을 유도함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 시료를 가교 결합하고 단백질-DNA 복합체를 가용화하는 것입니다.절차의 세 번째 단계는 특정 단백질-DNA 복합체를 면역 침전시키는 것입니다. 마지막으로, DNA를 정제하고 회수합니다. 결과적으로, 단백질 또는 DNA 히스톤 수정과 관련된 DNA 단편의 농축을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.이 방법은 축삭 재생을 촉진하는 데 중요한 유전자의 조절에 어떤 DNA 결합 부위, 전사 인자 및 히스톤 수정이 필요한지와 같은 신경 재생 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시작하려면 마취된 동물을 수술대 위에 놓으십시오. 다음 단계로 진행하기 전, 코콘을 통해 이소플루레인 산소를 지속적으로 투여하여 수술 전 과정 동안 마취 상태를 유지하십시오.좌골 신경 손상을 위해 발가락 꼬집기 반사(toe pinch reflex)로 마취 깊이가 적절한지 확인합니다. 뒷다리 부위를 조심스럽게 제모하고, 제모제로 남은 털을 제거합니다. 제모가 완료되면 알코올로 여러 번 닦아낸 후 베타딘(Betadine)으로 피부를 소독합니다.대퇴골의 후방 및 평행한 방향으로 피부를 4 mm 절개합니다. 허벅지 중간 지점에서 미세 핀셋을 사용하여 근육을 벌리고 그 아래에 있는 흰색 좌골 신경을 노출시킵니다. 신경이 분리되면, 위가 수술 대조군으로 사용하기 위해 절단하지 않은 상태로 두거나, 손상을 유도하기 위해 절단할 수 있습니다.마지막으로, 피부를 모아 두 개의 봉합 클립으로 닫아 배측 기둥 손상을 마무리합니다. 이전 단계에서 보여준 것과 같이 등 부분의 털을 제거하고 절개 부위를 세척합니다. T7에서 T13 부근까지 척수 상단에 2.5 centimeter 절개를 가합니다.미세 핀셋을 사용하여 피부를 잡고 지방을 분리합니다. 다음으로, 두 개의 훅을 사용하여 표층 지방을 고정합니다. 지방을 젖힌 후, 기준점으로 삼기 위해 제6경추와 제7경추 사이 공간에 있는 혈관의 위치를 확인합니다.제8 및 제10 흉추 상단의 근육을 양측으로 절개하고, 두 개의 후크를 삽입하여 절개 부위를 개방 상태로 유지합니다. 가시돌기를 잡은 상태에서 작은 가위로 T8에서 T10까지 척추판 상단의 근육을 제거합니다. 양측의 연결 골조직을 절단하여 T10 부위의 척추판 절제술을 수행합니다.척추의 상단 절반을 조심스럽게 들어 올려 아래에 있는 척수를 노출시킵니다. 2%Xylocaine을 몇 방울 떨어뜨려 척수를 마취한 다음, 척수를 건드리지 않도록 주의하며 경막을 제거합니다.이 지점에서 중단하면 배측 기둥(dorsal column) 손상을 위한 가짜 수술 대조군(sham surgical control)이 됩니다. 척수를 가로질러 0.3에서 0.4 밀리미터 깊이로 절개하십시오. 마지막으로, 근육을 봉합하여 닫고 표면 지방을 풀어줍니다.피부를 당겨 모은 뒤 봉합 클립으로 닫습니다. 동물을 홈 케이지로 돌려보내고 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다. 손상 48시간 후, 동물을 안락사시키고 L4 및 L5 후근신경절(DRG)을 수집합니다.첫 번째 단계는 복측 척주를 노출시키는 것입니다. 다음으로, T 12에서 L 6까지 척추의 복측 절반을 제거합니다. 척수를 노출시키기 위해, 척수 측면의 척추 사이 공간에 위치한 DRG를 확인합니다.미세 핀셋을 사용하여 L4 및 L5 DRG를 살짝 들어 올립니다. DRG 본체에 최대한 가깝게 절단하십시오. 동물 4마리로부터 총 16개의 DRG를 수집하여 얼음처럼 차가운 HBSS에 넣습니다.DRG를 짧게 원심분리한 후 1% formaldehyde 500 µL를 첨가하고 샘플을 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 고정을 중단시키기 위해 125 mM glycine을 첨가하고 상온에서 5분 동안 배양합니다. 짧게 원심분리한 후 버퍼를 흡입하여 제거하고, 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitors cocktail)이 포함된 얼음처럼 차가운 PBS 500 µL로 조직을 두 번 세척합니다.다음으로, PBS를 흡입하여 제거하고 400 µL의 SDS 용해 버퍼를 추가한 후, 마이크로 페스틀로 약 30회 문질러 조직을 파쇄합니다. 그다음 70% 출력으로 10초씩 8회 펄스로 크로마틴을 초음파 처리합니다. DNA가 약 200에서 1000 base pairs 길이로 단편화되었는지 확인하기 위해 샘플을 분석하는 것이 좋습니다.전단된 크로마틴 샘플을 새 튜브에 동일하게 나누어 담습니다. 수행할 각 면역침전 반응에 대해, protease inhibitors cocktail이 포함된 chip buffer를 사용하여 각 튜브의 부피를 500 microliters로 맞춥니다. 그다음, 희석된 샘플 5 microliters를 취해 새 튜브로 옮깁니다.이것은 1% input 샘플이며, 필요할 때까지 -20 °C에서 보관합니다. 이후, 각 튜브에 항체 또는 normal IgG 대조군을 추가하고 4 °C에서 회전시키며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날.Protein G 자성 비드 30 µL를 첨가하고 4 °C에서 2시간 동안 회전시키며 배양하여 복합체를 면역 침전시킵니다. 다음으로 튜브를 자성 랙에 놓아 결합된 크로마틴 비드 복합체를 침전시킵니다. 용액이 투명해지면 상층액을 조심스럽게 제거하고, 1 mL의 저염 버퍼로 비드를 3회 세척하며, 각 세척 단계마다 4 °C에서 3~5분 동안 회전시키며 배양합니다.다음으로 high salt buffer 1 mL로 한 번 세척합니다. 이 시점에서 -20 °C에 보관했던 1%input 샘플을 꺼내어 chip elution buffer 150 µL를 추가합니다. 해당 튜브는 나중에 사용할 수 있도록 상온에 둡니다.IP 샘플로 돌아가서, 각 튜브에 1x chip elution buffer 150 µL를 첨가합니다. 비드에서 크로마틴을 용출시키기 위해 샘플을 65 °C에서 30분 동안 부드럽게 vortexing하며 배양합니다. 마그네틱 랙을 사용하여 비드를 가라앉히고, input 샘플을 포함한 모든 튜브의 용출된 크로마틴을 새로운 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.200 millimolar의 sodium chloride와 반응당 40 micrograms의 protease K를 첨가하고 65 °C에서 2시간 동안 배양하십시오. 배양 후, 표준 절차를 사용하여 DNA를 회수하여 추가 분석을 수행하십시오. 좌골 신경 손상 후 DRG 조직의 semi-quantitative PCR 결과가 나타나 있습니다. 레인 1과 2는 input 샘플의 PCR 신호를 보여줍니다.4번 레인의 PCR 신호는 아세틸화된 P 53이 좌골 신경 손상 후에만 gap 43 근위 프로모터 영역에 결합함을 보여줍니다. 3번 레인에서 보이는 것과 같이 동물이 가짜 손상(sham injury)을 입었을 때와 5, 6번 레인에 표시된 일반 IgG 혈청을 사용했을 때는 PCR 신호가 나타나지 않습니다. 동일한 DRG 조직을 이용한 대조군 PCR 결과, 아세틸화된 P 53은 gap 43 유전자의 3-프라이머 비번역 영역에 위치한 DNA 대조 영역에는 결합하지 않는 것으로 나타났습니다.이 절차를 수행할 때, 성공을 위해 기억해야 할 세 가지 중요한 단계가 있습니다. 우선 충분한 양의 조직으로 시작하고, DNA-단백질 복합체의 효율적인 단편화 및 가용화를 보장하며, 관심 단백질에 적합한 면역침전 항체를 선택하십시오.

chromatin-immunoprecipitation-from-dorsal-root-ganglia-tissue

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 myelin를 공개하고 나머지 축삭 - 풍부한 자료의 추출 다음 비 axonal 구조를 lyse에 hypotonic 매체 신경 fascicles과 부화 해부에 따라 성인 쥐의 좌골 신경에서 axoplasm 절연을위한 프로토콜을 보여줍니다.

쥐 좌골 신경에서 Axoplasm 격리

Rhizotomy 후 도설 루트 Axons의 라이브 영상

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

출처: Li, Q., et al. 포유류 축삭 재생 조사: 성체 마우스 후근 신경절의 생체 내 전기천공. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 압착 부상 후 마우스 좌골 신경의 축삭 재생 과정을 보여줍니다. 분리된 신경은 축삭 성장을 시각화하기 위해 뉴런에서 발현되는 형광 단백질과 함께 이미징을 위해 고정되고 준비됩니다. 낙산화형광 현미경을 사용하여 손상 부위에서 축삭 재생을 추적하여 재성장 정도를 평가합니다.

압착 부상 후 마우스의 좌골 신경의 축삭 재생

출처: Li, Q. et al. 포유류 축삭 재생 조사: 성체 마우스 후근 신경절의 생체 내 전기천공. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 축삭 재생을 연구하기 위해 마우스 DRG 뉴런의 전기천공 매개 형질감염을 보여줍니다. DRG 뉴런에 핵산 구조물을 전달하고, 좌골 신경 손상을 유도하고, 축삭 재생을 평가하는 단계를 간략하게 설명합니다.

감각 축삭 재생을 촉진하기 위한 마우스 등근 신경절의 전기천공 매개 형질감염

중추 신경계 재생 및 수리를 조사 Drosophila 애벌레의 복부 신경 코드를 사용하여 부상 패러다임이 설명되어 있습니다. 의도적으로 개발 한 소프트웨어 및 유전학과 정량 분석​​과 함께 시간 경과 및 고정 표본에서 공 촛점 현미경을 스캔 레이저, 다음 찌른 곳은 CNS 재생 및 수리의 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용됩니다.

에 중추 신경 시스템 복구를 조사하기 위해 상해 패러다임<em&gt; Drosophila</em

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성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

여기에 제시된 것은 고품질의 등뿌리 신경절 냉동 유지 장치 절편을 지속적으로 획득하기 위한 개발입니다.

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Axonal 상해 다음 도설 루트 신경 조직에서 염색질의 Immunoprecipitation

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