Axonal 상해 다음 도설 루트 신경 조직에서 염색질의 Immunoprecipitation

우리는 axonal 부상 다음 지느러미 루트 신경 조직에서 염색질 immunoprecipitation을위한 방법을 제시한다. 접근 방식은 특정 전사 인자 바인딩 사이트와 주변 및 중추 신경계 모두에서 부상을 axons의 재생을위한 히스톤 및 DNA의 중요한 epigenetic 수정을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

이 절차의 전반적인 목표는 신경 손상 후 등쪽 뿌리 신경절 조직에서 면역 침전, 가교 결합 단백질 DNA, 복합체를 면역하는 것입니다. 이것은 먼저 좌골 또는 등쪽 기둥 손상을 유도함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 샘플을 가교하고 단백질 DNA 복합체를 가용화하는 것입니다.

절차의 세 번째 단계는 특정 단백질 DNA 복합체를 면역 침전시키는 것입니다. 마지막으로 DNA가 정제되고 회수됩니다. 궁극적으로, 단백질 또는 DNA 히스톤 변형과 관련된 DNA 단편의 농축을 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

이 방법은 축삭 재생을 촉진하는 데 중요한 유전자 조절에 필요한 DNA 결합 부위, 전사 인자 및 히스톤 변형과 같은 론날 재생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 마취된 동물을 수술대에 올려 놓습니다. 진행하기 전에 콧방울을 통한 지속적인 이소플루란 산소 투여를 통해 수술 내내 마취를 유지하십시오.

좌골 신경 손상에 대한 발가락 핀치 반사로 정확한 마취 깊이를 확인하십시오. 뒷다리를 조심스럽게 면도하고 제모제로 남아 있는 털을 제거하십시오. 털이 제거되면 알코올을 반복해서 바르고 베타딘을 바르며 피부를 닦는다.

대퇴골과 평행하게 피부 뒤쪽을 4mm 절개합니다. 허벅지 중간에서 가는 집게를 사용하여 근육을 벌리고 아래에 있는 흰색 좌골 신경을 노출시킵니다. 일단 분리되면, 신경은 절단되지 않은 채로 남아 가짜 외과적 통제 역할을 하거나 절단되어 부상을 유발할 수 있습니다.

마무리하려면 피부를 함께 당기고 등쪽 손상을 위해 두 개의 봉합 클립으로 닫습니다. 뒤쪽의 털을 제거하고 앞과 같이 절개 부위를 청소합니다. 척수 위 2.5cm를 T 7에서 T 13까지 절개합니다.

지방을 분리하면서 피부를 잡기 위해 가는 집게를 사용하십시오. 다음으로 두 개의 고리로 표재성 지방을 고정합니다. 지방이 뒤로 당겨지면 여섯 번째와 일곱 번째 척추 사이의 공간에서 혈관을 찾아 기준점으로 사용합니다.

8번째와 10번째 척추뼈 위로 근육을 양측으로 자르고 두 개의 고리를 삽입하여 열린 상태를 유지합니다. 작은 가위를 사용하여 가시 돌기를 유지하면서 T 8에서 T 10까지 라미네이트 위의 근육을 제거합니다. T 10에서 양쪽의 연결 뼈를 절단하여 후판 절제술을 수행합니다.

척추뼈의 위쪽 절반을 조심스럽게 들어 올려 아래에 있는 척수를 드러냅니다. 척수를 마취하기 위해 2% 자일로카인 몇 방울을 바르고 경막을 제거합니다. 척수를 만지지 않도록 주의하십시오.

이 시점에서 멈추는 것은 등기둥을 다치게 하는 가짜 수술 통제를 제공할 것입니다. 척수를 0.3-0.4mm 깊이로 자릅니다. 마지막으로 근육을 봉합하고 표재성 지방을 방출합니다.

피부를 함께 당기고 봉합사 클립으로 닫습니다. 동물을 가정용 케이지에 다시 넣고 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다. 부상 후 48시간이 지나면 동물을 안락사시키고 L 4 및 L 5 등뿌리 신경절 또는 DRG를 채취합니다.

첫 번째 단계는 복부 척추를 노출시키는 것입니다. 다음으로, 척추의 복부 절반을 T 12에서 L 6으로 제거합니다. 척수를 노출시키려면 척추뼈와 척수 측면 사이의 공간에 위치한 DRG를 식별합니다.

가는 집게를 사용하여 L 4 및 L 5 DRG를 약간 들어 올리십시오. DRG 본체에 최대한 가깝게 자릅니다. 4마리의 동물에서 총 16개의 DRG를 수집하여 얼음처럼 차가운 HBSS에 넣습니다.

DRG를 간단히 원심분리하고 500마이크로리터의 1%포름알데히드를 첨가하고 샘플을 30분 동안 배양합니다. 섭씨 37도에서 125밀리몰의 글리신을 첨가하여 고정을 멈추고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 간단한 원심분리기 후 완충액을 흡인하고 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS와 프로테아제 억제제 칵테일로 조직을 두 번 세척합니다.

다음으로, PBS를 흡인하고 400마이크로리터의 SDS 용해, 완충액을 첨가하고 마이크로 유봉을 약 30회 스트로크하여 조직을 파괴합니다. 그런 다음 70 % 출력에서 8 개의 10 초 펄스로 염색질을 초음파 처리합니다. 약 200 - 1000 염기쌍 길이로 DNA 단편화를 확인하기 위해 샘플을 분석하는 것이 좋습니다.

전단된 염색질 샘플을 새 튜브에 균등하게 나눕니다. 수행할 각 면역침전 반응에 대해 칩 버퍼와 프로테아제 억제제 칵테일을 사용하여 각 튜브의 부피를 최대 500마이크로리터까지 가져옵니다. 다음으로, 희석된 샘플 5마이크로리터를 제거하고 새 튜브로 옮깁니다.

이것은 1% 입력 샘플이며 필요할 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관됩니다. 나중에. 각 튜브에 항체 또는 일반 IgG 대조군을 추가하고 밤새 교대로 섭씨 4도에서 배양합니다. 다음 날.

면역은 30마이크로리터의 단백질 G 마그네틱 비드를 첨가하고 섭씨 4도에서 회전하면서 2시간 동안 배양하여 복합체를 침전시킵니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 랙에 올려 놓고 결합된 염색질 비드 복합체를 아래로 당깁니다. 용액이 맑아지면 상등액을 조심스럽게 제거하고 1ml의 저염 완충액으로 비드를 3회 세척하고 섭씨 4도에서 3-5분 동안 배양하고 세척할 때마다 회전합니다.

다음으로 1ml의 고염 완충액으로 한 번 씻으십시오. 이 시점에서 영하 20도에서 1% 입력 샘플을 검색하고 150마이크로리터의 칩 용리 버퍼를 추가합니다. 나중에 사용할 수 있도록 튜브를 실온에 보관하십시오.

IP 샘플로 돌아가서 각 튜브에 150마이크로리터의 1 x 칩 용리 버퍼를 추가합니다. 섭씨 65도에서 30분 동안 부드러운 와류로 샘플을 배양하여 비드에서 염색질을 용리합니다. 마그네틱 랙의 비드를 아래로 당기고 용리 염색질을 새 튜브에 넣고 입력 샘플을 포함한 모든 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

프로테아제 K 반응당 200밀리몰의 염화나트륨과 40마이크로그램을 첨가하고 배양 후 2시간 동안 섭씨 65도에서 배양한 후 추가 분석을 위한 표준 절차를 사용하여 DNA를 회수합니다. 좌골 신경 병변에 따른 DRG 조직의 반정량적 PCR 결과가 표시됩니다. 레인 1과 2는 입력 샘플의 PCR 신호를 보여줍니다.

4번 열의 PCR 신호는 아세틸화된 P53이 좌골 신경이 손상된 후에만 갭 43 근위 프로모터 영역에 결합한다는 것을 보여줍니다. 3번 레인에서 볼 수 있듯이 동물이 가짜 부상을 입었을 때와 5번 및 6번 레인에 표시된 일반 IgG 혈청을 사용할 때 PCR 신호가 나타나지 않습니다. 동일한 DRG 조직으로부터의 대조군 PCR은 아세틸화된 P 53이 gap 43 유전자의 3-프라임 번역되지 않은 영역에 위치한 DNA의 대조 영역에 결합하지 않음을 보여줍니다.

이 절차를 시도하는 동안 성공을 위한 세 가지 중요한 단계를 기억하는 것이 중요합니다. 충분한 양의 조직으로 시작하여 DNA 단백질 복합체의 효율적인 단편화 및 가용화를 보장하고 관심 단백질에 적합한 면역침전 항체를 선택하십시오.