Poliovirus 식별을위한 입자 응집 방법

다음 절차의 전반적인 목표는 간단한 프로토콜을 사용하여 소아마비 바이러스를 신속하게 식별하는 것이다. 이 분석을 위해 우리는 IgG two fc에 연결된 인간 폴리오바이러스 수용체의 세포외 도메인을 포함하는 키메라 분자로 코팅된 감작된 젤라틴 입자를 사용합니다. 이러한 입자는 폴리오바이러스 분리물의 모든 혈청형에 대해 균일한 친화력을 갖기 때문에 인간 폴리오바이러스를 함유한 샘플과 함께 배양할 때 입자의 응집이 발생한다.

그러나 검체를 분리하는 특정 바이러스를 인식할 수 있는 항체가 존재하고, 중화가 일어나 응집을 방지할 수 있는 경우, 이 실험 시스템을 사용하여 폴리오바이러스 분리물을 1단계 반응으로 신속하게 식별할 수 있다. 기존 선박의 이 기술의 주요 장점은 기존의 중화 테스트와 마찬가지로 절차 및 해석의 SIM 단순성으로, 필요한 노동력을 줄이고 신속하게 처리하며 결과 시간을 단축하는 것을 목표로 합니다. 항 PV 1, PV 2 및 PV 3 항체를 재구성하려면 각 바이알에 0.5ml의 물을 추가합니다.

그런 다음 각 항체 용액을 4.5ml의 유지 매체가 들어 있는 별도의 튜브로 옮깁니다. 일부 로트의 안티 PV 항체는 이러한 많은 안티 PV 항체를 위해 재구성 된 형태로 제공됩니다. 재구성을 위해 물을 추가할 필요는 없습니다.

다음으로, 새로 표지된 튜브에서 최종 부피 3.6ml와 결합된 항체 용액의 일대일 혼합물을 준비합니다. 예를 들어, 1.8밀리리터의 안티 PV 1과 1.8밀리리터의 안티 PV 2를 혼합합니다. 항 PV 1 플러스 PV 2 조합을 준비하려면 가능한 모든 쌍별 조합에 대해 이 작업을 반복하고 각 항혈청 1.2ml를 함께 혼합하여 세 가지 유형의 항체를 모두 포함하는 용액을 준비합니다.

일단 4개의 혼합물이 각 항체 용액에 대해 720마이크로리터의 FCS로 만들어졌습니다. 이는 분석 중 항체에 의한 젤라틴 입자의 비특이적 응집을 줄이는 데 도움이 됩니다. 항체 풀은 응집 분석에 사용될 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다.

이 분석에서는 인간 소아마비 바이러스 수용체의 세포 외 도메인과 IgG two a mouse FC 도메인으로 코팅된 동결건조된 젤라틴 입자를 사용합니다. 응집 이미지의 일관성을 보장하기 위해 한 번의 실험에서 다른 로트가 아닌 단일 로트의 입자를 사용하여 각 바이알에 대해 1.5ml의 재구성 완충액으로 입자를 재구성해야 합니다. 잘 섞이려면 부드럽게 두드리십시오.

재구성된 입자는 섭씨 4도에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다. 먼저, 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 실험을 설계합니다. 각 샘플에 대해 1번 웰에는 바이러스만 포함되어 있습니다.

2번부터 5번까지의 웰에는 바이러스와 4개의 혼합 항체 용액 중 하나가 포함되어 있습니다. 바이러스나 항체가 없는 매체만 포함된 음성 대조군을 위해 하나의 웰을 저장해야 합니다. 플레이트가 설정되면 12마이크로리터의 올바른 항체 용액을 2열에서 5열까지 각 웰과 12마이크로리터의 성장에 추가합니다.

바이러스 단독, 1 행의 웰, 6 행의 음성 대조군 웰에 매체. 다음으로, 처음 5개 행에 12마이크로리터의 바이러스 샘플을 추가하고 6번째 행에 있는 음성 대조군 웰에 12마이크로리터의 성장 배지를 추가합니다. 항체와 바이러스가 플레이트화되면 재구성된 젤라틴 입자를 부드럽게 두드려 부유시키고 즉시 모든 웰에 웰당 25마이크로리터의 입자를 추가합니다.

각각에서 동일한 양의 입자를 얻기 위해 입자를 플레이트로 옮기기 전에 입자가 가라앉지 않도록 하는 것이 중요합니다. 분석 플레이트를 플레이트 믹서에 놓고 30초 동안 혼합합니다. 그런 다음 흰 종이 위에 플레이트를 놓고 응집이 일어나도록 실온에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다.

형성된 응집이 불안정하므로 배양 중이나 배양 후에 플레이트를 움직이지 않는 것이 중요합니다. 반응이 일어나면 각 웰의 응집 품질을 평가할 수 있는 플레이트의 사진을 여러 장 찍습니다. 응집이 발생하지 않은 우물에서는 왼쪽에서 볼 수 있듯이 유색 젤라틴 입자가 응집이 발생한 우물의 우물 바닥에서 침전됩니다.

바이러스와 pvr, IgG 두 개의 A 코팅된 젤라틴 입자 사이의 상호 작용으로 인해 중앙에서 볼 수 있듯이 확산 색상 패턴이 보입니다. 이 실험에서 우리는 바이러스 용액 인 PV 1, 2 및 3이 항체의 존재 하에서 glu를 유도하는 능력을 테스트했습니다. 여기에 나타난 바와 같이 표시된 조합은 바이러스 또는 항체가 없는 경우, 응집이 발생하지 않고 젤라틴 입자가 대조적으로 침전하여 바이러스를 잘 함유하고 있지만 항체는 없습니다.

응집은 바이러스의 상호 작용으로 인해 발생했습니다. PVR IgG가 실험용 웰에 있는 두 개의 A로 덮인 젤라틴 입자를 사용하면 해당 바이러스를 특이적으로 중화하는 항체를 포함하는 모든 웰에서 바이러스의 공급 과잉 상태가 방지됩니다. 예를 들어, 폴리오바이러스 1형의 과잉 국가는 항 PV 1 항체가 함유된 웰에서는 예방할 수 있지만, 항 PV 2 항체와 항 PV 3 항체만 함유된 웰에서는 예방할 수 없다.

소아마비 바이러스 2형과 3형도 마찬가지이다. 마스터 과정에서는 이 기법을 제대로 수행하기만 하면 3시간 이내에 완료할 수 있습니다.