Name: 알츠하이머 질병 마우스 모델에서 Neuritic Plaques의 감지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: 학습하세요 알츠하이머 질병 마우스 모델에서 뉴라이틱 플라크를 검출하는 면역조직화학적 및 형광 염색법을. 4G8 항체와 티오플라빈 S를 사용하여 아밀로이드 베타 단백질을 특이적으로 시각화하고 병리학적 변화를 정밀 분석하는 효과적인 기술입니다.

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이 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소 (CIHR), 타운센드 가족, 잭 브라운 가정 알츠하이머 연구 재단 (WAS)를 지원했습니다. WAS는 알츠하이머 병에있는 캐나다 연구 의자의 소유자입니다. PTTL는 자연 과학 및 공학 연구 상담 및 건강 연구 장학금에 대한 마이클 스미스 재단에서 지원됩니다.

1. 마우스 두뇌의 고정 및 cryosectioning <ol><li> 유전자 변형 생쥐는 잘린 및 추출 두뇌 뒤에 이산화탄소 가스를 사용하여 희생하고 있습니다. </li><li> 두뇌는 중앙에 길이 방향 해부하는 것입니다. 두뇌의 절반은 생화 학적 분석을위한 드라이 아이스에 냉동 플래시됩니다. 다른 4 적어도 48 시간 동안 4 % paraformaldehyde (PFA)에 빠져들 것이다 ° C. </li><li> 최소한 48 시간 4% PFA에 고정 후, 헤미의 두뇌는 30 % 자당 용액에 직접 전송하고 4 배치 ° C. 시점에서, 헤미의 두뇌는 자당 솔루션에 떠 있어야합니다. 헤미의 두뇌는 보통 48시간에 대한 요구, 아래로 침몰하면 cryosectioning 위해 OCT에 포함된 될 준비가 된 것입니다. </li><li> cryosectioning 전에 손잡이에서 OCT의 얇은 레이어를 탑재하고 -20 ° C.에서 프리즈 수 냉동 OCT의 레이어에 헤미의 두뇌와 장소의 나머지에서 소뇌를 제거합니다. 즉시 OCT와 헤미 두뇌를 커버 천천히 -20 ° C.에서 프리즈 수 두뇌가 불투명 켜져있는 OCT의 포함되면, 그것은 sectioned 될 준비가 된 것입니다. </li><li> 30 μm의 각 부분의 두께를 설정합니다. D' Olomos 솔루션과 용기에 각각의 슬라이스를 수집합니다. </li></ol> 2. neuritic plaques에 대한 Immunohistochemistry 절차 (무료 부동 섹션) <ol><li> 15 분 동안 88% 개미 산성의 각 섹션을 처리합니다. 개미 산성 치료 후 섹션은 일시적으로 불투명 설정하고, 주름에 나타날 수 있습니다. </li><li> 부드러운 잡고 5 분 X 3 TX - PBS (0.3 % 트리톤 PBS에서 X - 100)와 접시와 세척에 각 섹션을 제거합니다. </li><li> 블록 내생 과산화수소는 0.5 % TX - PBS, RT에서 H 2 O 2 부드러운 잡고 30 분 차단. </li><li> 부드러운 잡고 10 분 X 3 TX - PBS로 섹션을 씻으십시오. </li><li> 부드러운 잡고 1 시간 동안 실온에서 TX - PBS에 용해 5% 아닌 지방 탈지 우유와 함께 블록 섹션을 참조하십시오. </li><li> TX - PBS는 4에서 5 %의 우유를 포함하는으로 희석 주 항체의 섹션 (4G8을 Biotinylated, 1:500-1:2000, 인장) ° C 부드러운 잡고 하룻밤. 품어 </li><li> 부드러운 잡고 10 분 X 3 TX - PBS로 섹션을 씻으십시오. </li><li> ABC 솔루션 다음과 같은 제조 업체의 프로토콜 (엘리트 ABC, 벡터 연구소를) 준비. 부드러운 잡고 30 분 ABC 혼합물의 섹션을 품어. </li><li> 부드러운 잡고 10 분 X 3 TX - PBS로 섹션을 씻으십시오. </li><li> 3,3 '- diaminobenzidine의 tetrahydrochloride (DAB) (벡터 연구소) 다음과 같은 제조 업체의 프로토콜을 준비합니다. 50-10 분 DAB 혼합물의 섹션을 품어. 이 시점에서, 당신은 갈색 색상이 각 부분에 대한 개발 준수합니다. </li><li> 부드러운 잡고 10 분 X 3 TX - PBS로 섹션을 씻으십시오. </li><li> 자유 부동 뇌 섹션은 조직 부착을 도울 수 있도록 젤라틴 코팅 슬라이드에 장착됩니다. 섹션 공기가 크실렌의 일련 취소하여 다음과 Entellen에 탑재 건조 후 수 있습니다. </li><li> Plaques은 40X 배율의 빛을 현미경 하에서 시각 있으며, 각각의 마우스에 대한 슬라이스 당 의미 플라크 수를 평가하여 계량하고 있습니다. </li></ol> 3. Thioflavin S는 neuritic plaques의 검출을위한 절차를 염색법 <ol><li> 마우스 희생과 두뇌 추출 절차와 같은 섹션 1.1 1.5로 표시됩니다. </li><li> 산 4-5 헤미 뇌 유리 슬라이드에 섹션과 완전히 얼룩하기​​ 전에 건조 공기 수 있습니다. </li><li> 1 분 70 % 에탄올로 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 1 분 80 %를 에탄올로 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 15 분 동안 필터링 (0.2 μm의 필터) thioflavin S 솔루션 (에탄올 80 %에서 1 %)에 슬라이드를 품어. (Thioflavin S 솔루션은 각각의 사용하기 전에 필터링해야합니다.) 참고 : 빛과 thioflavin S를 보호하고 빛으로부터 스테인드 슬라이드를 보호합니다. </li><li> 1 분 80 %를 에탄올로 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 70 % 에탄올 일분과 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 증류수로 두 번 씻으십시오. </li><li> 수성 장착 미디어와 슬라이드 투명 매니큐어로 밀봉 coverslip 뒤에 최소한 2 시간 동안 짙은 어둠 속에서 건조 수 있도록 마운트 슬라이드. 스테인드 섹션 4의 어둠 속에 보관해야 ° C. </li><li> 녹색 형광 스테인드 plaques는 형광 microscropy과 시각 수 있습니다. 얼룩이 시간 함께 사라질 것이다 때문에 일주일 이내 슬라이드를 분석할 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 안티 간질 약물과 neuritic 플라크 형성을 억제하는 기분 안정제 valproic 산성 (VPA)의 효능에 대한 최근 연구에서는, 우리는 위에서 설명한 immunostaining을 사용하고 thioflavin S는 광고 모델 마우스 (3)에서 neuritic plaques를 식별하는 절차를 염색법. 그림 1은 안티 Aβ 사용하여 biotinylated 4G8 물들일과 ABC 방식을 통해 감지 전형 9개월 된 APP23 형질 전환 마우스를 나타냅니다. Neuritic plaques는 명확하게 항체으로 표시되며 흰색 화살표로 표시됩니다. thioflavin S 얼룩을 사용하여, 우리는 2 달이 넘은 APP23xPS 트라 neuritic 플라크 증착을 감지nsgenic 마우스 (그림 2). Thioflavin S 바운드 Aβ 함유 neuritic의 plaques은 형광 현미경 (흰색 화살표로 표시)에서 녹색으로 나타납니다. 우리는 VPA 치료와 neuritic 플라크 형성이 상당히 (3) 감소는 것을 보여주었다. 또 다른 연구에서는, 우리는 분자 링크를 기본 hypoxia 및 광고 pathogenesis을 공부했다. 다시 두 4G8 방지 Aβ immunohistochemistry의 얼룩과 thioflavin S 염색법을 사용하여, 우리는 hypoxia가 neuritic plaques (4)이있는 Aβ의 형성을 촉진 발견했습니다. <img src="/files/ftp_upload/2831/2831fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. AD 유전자 변형 생쥐에서 neuritic 플라크 형성 Immunohistochemical 분석 9. 개월 나이에 APP23 생쥐가 희생되었고 해부했다는 고정하고, sectioned. hippocampal에 Neuritic plaques는 안티 Aβ 항체 4G8를 사용하여 감지되었으며 ABC와 DAB 방법을 사용하여 개발되었습니다. plaques은 40X로 가벼운 현미경에 의해 시각되었습니다. 화이트 화살표가 Aβ의 neuritic plaques을 가리 킵니다. <img src="/files/ftp_upload/2831/2831fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. AD 모델 생쥐에서 neuritic plaques의 Thioflavin S 얼룩. 올드 8주에서 APP23xPS45 두 유전자 변형 생쥐는 희생되었고 해부되었다, 고정하고, sectioned. hippocampal에 Neuritic 재앙은 thioflavin S 형광 염색법을 사용하여 확인 및 40X 배율에서 현미경에 의해 시각되었습니다 있습니다. 화이트 화살표 thioflavin S 스테인드 neuritic의 plaques를 나타냅니다.

<ol><li>Glenner, G. G., Wong, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%3A+initial+report+of+the+purification+and+characterization+of+a+novel+cerebrovascular+amyloid+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein.</a> Biochem Biophys Res Commun. 120, 885-890 (1984).</li>
<li>Hardy, J., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+hypothesis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+progress+and+problems+on+the+road+to+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics.</a> Science. 297, 353-356 (2002).</li>
<li>Qing, H., He, G., Ly, P. T., Fox, C. J., Staufenbiel, M., Cai, F., Zhang, Z., Wei, S., Sun, X., Chen, C. H., Zhou, W., Wang, K., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproic+acid+inhibits+Abeta+production%2C+neuritic+plaque+formation%2C+and+behavioral+deficits+in+Alzheimer%27s+disease+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models.</a> J Exp Med. 205, 2781-2789 (2008).</li>
<li>Sun, X., He, G., Qing, H., Zhou, W., Dobie, F., Cai, F., Staufenbiel, M., Huang, L. E., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+facilitates+Alzheimer%27s+disease+pathogenesis+by+up-regulating+BACE1+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia facilitates Alzheimer's disease pathogenesis by up-regulating BACE1 gene expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 18727-18732 (2006).</li>
</ol>

모든 실험은 브리티시 컬럼비아 애니멀 케어 및 사용위원회 CIHR 지침의 대학에 따라 실시되었다.

biotinylated 표시 4G8 항체 얼룩에게 광고 neuritic plaques를 사용 Immunohistochemistry은 특이성과 쥐를 모델. 얼룩의 결과는 부량 및 다른 치료 그룹 사이의 플라크 부하의 비교를하실 수 있습니다. 결과에 영향을 미칠 수있는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 헤미의 두뇌는 두개골에서 추출하기 전에 perfused 있지 않기 때문에,주의가 헤미 두뇌에 손상을 방지하기 위해 추출 과정에서 사용해야합니다. 헤미의 두뇌가 수동적으로 perfused이기 때문에 더욱이, 우리는 4 적어도 48 시간 4퍼센트 PFA에 잠복기 권장 ° C 이전에 30 % 자당 솔루션 잠수함이 잠수합니다. 또는 transcardial 재관류는 두뇌를 추출하기 전에 할 수 있습니다. 두뇌가 제대로 고정되면, 그것은 고무 질감이 있어야합니다. 두뇌가 제대로 고정되지 않은 경우에는 섹션 쉽게 D&#39; Olomos 솔루션이나 얼룩 절차 중에 눈물 것입니다. 4G8 단클론 항체는 아미노산 잔류물 Aβ의 17-24에 반응하고 핵심 시퀀스 (VFFAE)에 에피토프을 인식. 4G8가 마우스 수종에서 파생된 것이므로, 그것은 높은 배경 얼룩을주는 경향이있다. 따라서, 우리는 배경 얼룩을 최소화하면서 고려 진정한 신호를 달성하기 위해 함께 표시된 희석에서 섹션을 품어하기로 결정했습니다. 4G8 항체를 사용하여 neuritic plaques 감지 immunostaining 이외에도, thioflavin S 얼룩 방법도 plaques을 식별하는 데 사용됩니다. Thioflavin S는 동질적인 염료 혼합물이다 sulfonic의 산성과 dehydrothiotoluidine의 methylation 결과에서 해당. Thioflavin S가 아닌 선택과 같은 아밀로이드 oligomers 이들과 같은 단백질의 베타 시트 내용을 바인딩합니다. 바인딩시 thioflavin는 방출 스펙트럼의 특성 푸른 변화를 겪습. 반대 monomeric 양식 thioflavin S 바인딩은 파란 변화를 이끌어내는하지 않으며 형광 현미경으로 발견하지 못했습니다. 형광의 강도가 아밀로이드 예금 소량의 좋은 시각화를 허용 등 Thioflavin S 얼룩이 아밀로이드에 대한 화면으로 빠른 대안을 제공합니다. 그러나, thioflavin S 얼룩 얘기가 하나 단점은 특이성의 부족이다. 이러한 fibrinoids, 유리 모양의, 각질 등으로 포함하는 광범위한 베타 시트를 포함한 많은 다른 조직 구성이 염료에 대한 다소 친근감을 가지고 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 및 장비의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P6148 - 1KG </td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidene </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> PVP40 - 100G </td></tr><tr><td> 자당 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> S5 - 3 </td></tr><tr><td> 에틸렌 글리콜 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 324558 - 2L </td></tr><tr><td> 조직 테크 OCT 컴파 운드 </td><td> 사쿠라 </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> 88% 개미 산성 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> A118P - 500 </td></tr><tr><td> 트리톤 X - 100 </td><td> ICN의 Biomedicals </td><td> 807426 </td></tr><tr><td> H2O2 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> H - 1009 </td></tr><tr><td> 비오틴은 4G8 항체를 라벨 </td><td> 시더 레인 </td><td> SIG - 39240-500 </td></tr><tr><td> 엘리트 ABC 키트 </td><td> 벡터 </td><td> PK - 6100 </td></tr><tr><td> IMM 협정 DAB </td><td> 벡터 </td><td> SK - 4105 </td></tr><tr><td> 크실렌 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> X4 - 4 </td></tr><tr><td> Entellan </td><td> EM 과학 </td><td> 65037-71 </td></tr><tr><td> Superfrost의 * 플러스 현미경 슬라이드 </td><td> 피셔 사이 언티픽 </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> 그라 이오 스탯 </td><td> Leica </td><td> CM - 3050 - S </td></tr><tr><td> MX35 프리미어 마이크로톰 블레이드 </td><td> 써모 과학 </td><td> 3,052,835 </td></tr><tr><td> Thioflavin S </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T1892 - 25G </td></tr></tbody></table>

알츠하이머 질병 마우스 모델에서 neuritic plaques의 감지

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

알츠하이머 병 (AD)은 치매로 이어지는 가장 일반적인 neurodegenerative 무질서이다. Neuritic 플라크 형성이 알츠하이머 질환의 병리 학적 특징 중 하나입니다. neuritic plaques의 중심 구성 요소는 β - secretase와 γ - secretase에 의해 베타 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 순차 proteolytic 절단에서 파생되는 작은 filamentous 단백질이라는 아밀로이드 β 단백질 (Aβ) 1입니다. 아밀로이드 가설 AD 병리 2 기본 독성 메커니즘으로 plaques을 Aγ 함유 것을 알아볼 수 있습니다. neuritic 플라크의 존재의 사후 분석 AD의 진단을 확인합니다. 광고 pathogenesis에 Aγ 신경 생물학 우리의 이해를 더하기 위해 인간의 APP의 유전자에 AD 관련 변이를 표현하는 다양한 마우스 종자가 생성되었습니다. 질병의 정도에 따라,이 마우스는 다른 연령대에 neuritic plaques을 개발합니다. 이 생쥐는 APP 처리 경로와 neuritic 플라크 형성에 영향을 미칠 수있는 pathogenesis 및 약물 개발 연구를위한 귀중한 도구 역할을합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 광고 모델 마우스에서 neuritic plaques의 구체적인 검출을위한 immunohistochemical 방법을 사용합니다. thiofalvin S 얼룩 방법을 사용하여 ABC​​와 DAB 방법과 형광 검출을 사용 immunohistochemical 감지 : 우리는 구체적으로 절반 뇌, paraformaldehyde 고정, cryosectioning 및 광고 형질 전환 마우스에서 신경질 plaques를 감지하는 두 가지 방법을 추출에서 준비에 대해 설명합니다.

AD의 병리 학적 특징 중 하나는 아밀로이드 β 단백질의 긍정적인 neuritic plaques의 형성이다. immunohistochemical 감지 thioflavin S 얼룩 방법을 사용하여 ABC​​와 DAB 방법과 형광 검출을 사용하여이 프로토콜에서 우리는 유전자 변형 AD 모델 마우스에서 neuritic plaques를 감지하는 두 가지 방법을 설명합니다.

알츠하이머 질병 마우스 모델에서 Neuritic Plaques의 감지

알츠하이머병(AD)은 치매를 유발하는 가장 흔한 신경퇴행성 질환입니다. 신경섬유 엉킴 및 아밀로이드 플라크 형성은 주요 병리학적 특징 중 하나로...

본 실험 절차의 전체적인 목표는 4G8 면역 염색과 플라빈 S 염색을 통해 아밀로이드 모델 마우스 뇌에서 베타 아밀로이드 플라크를 검출할 수 있도록 준비하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마우스의 두개골에서 뇌를 적출하고 4% PFA로 수동 관류한 다음, 30% sucrose 용액에 침전시킨 후 뇌를 세로 방향으로 30 µm 두께로 동결 절편 제작합니다. 그 후 4G8 항체를 사용하여 베타 아밀로이드 플라크를 염색하고 DAB법으로 시각화합니다.또한, Thioflavin S 염색을 통해 amyloid-beta 플라크를 염색하고 형광 현미경을 사용하여 시각화합니다. 최종적으로, 항체 기반 검출과 Thioflavin S 염색약을 통한 염색을 통해 뇌 조직 내 amyloid-beta 플라크 침착을 확인할 수 있습니다. 기존 방법과 비교했을 때 이러한 기술의 주요 장점은 4G8 염색과 Thioflavin S가 beta 단백질을 포함하는 amyloid-beta 플라크에 대해 매우 높은 선택성을 가진다는 점입니다.여기에 제시된 방법은 알츠하이머병 형질전환 마우스의 베타 플라크를 검출하기 위한 것이지만, 이 방법은 알츠하이머병 환자의 인간 뇌 조직에서도 베타 플라크를 검출하는 데 사용될 수 있습니다. 이산화탄소 가스를 사용하여 형질전환 마우스를 안락사시킨 후, 참수하여 뇌를 추출하고 중앙에서 세로로 절개합니다. 뇌의 절반은 생화학적 분석을 위해 드라이아이스에서 급속 냉동하고, 나머지 절반은 4% paraformaldehyde에 담가 4°C에서 최소 48시간 동안 고정합니다.Hemi Brain을 4°C의 30% sucrose 용액으로 옮깁니다. 처음에는 Hemi brain이 sucrose 용액에 떠 있지만, 24~48시간 후에는 저온 절편 제작 전 바닥으로 가라앉습니다. 녹(knob) 부분에 OCT를 얇게 도포한 후 -20°C에서 동결시킵니다. Hemi Brain의 나머지 부분에서 소뇌를 제거합니다.나머지를 얼어있는 OCT 층 위에 놓은 다음, 즉시 OCT로 덮고 -20 °C에서 천천히 얼립니다. 크라이오스탯(cryostat)의 절편 두께를 30 µm로 설정하고, 각 절편을 Domo 용액이 담긴 용기에 수집합니다. 각 부유 절편을 88% formic acid로 15분 동안 처리합니다.절편들이 쭈그러드는 것처럼 보일 것입니다. 그런 다음 각 절편을 플레이트로 옮기고 Triton XPBS로 5분 동안 부드럽게 흔들어주며 3회 세척합니다. Triton XPBS에 0.5% 과산화수소를 섞은 용액으로 실온에서 30분 동안 부드럽게 흔들어주며 내인성 활성을 억제합니다.그 다음, 완만한 진동을 가하며 Triton XPBS로 섹션을 10분 동안 3회 세척합니다. Triton XPBS에 용해된 5% 무지방 탈지분유를 사용하여 실온에서 완만한 진동과 함께 1시간 동안 섹션을 블로킹합니다. 5% 우유가 포함된 Triton XPBS에 희석한 1차 항체 내에서 4°C로 하룻밤 동안 완만한 진동과 함께 섹션을 계속 배양합니다. 샘플을 Triton XPBS로 10분 동안 3회 세척합니다.이제 제조사의 프로토콜에 따라 b, C 용액을 준비하고, A B, C 혼합액에서 절편들을 살살 흔들어주며 30분 동안 배양한 후, Triton X-100이 포함된 PBS로 10분씩 세 번 세척합니다. 갓 준비한 DAB 혼합액에서 각 절편에 갈색이 나타날 때까지 5~10분 동안 배양하고, Triton X-100이 포함된 PBS로 살살 흔들어주며 10분씩 세 번 세척합니다. 부유 상태의 뇌 절편을 젤라틴 코팅 슬라이드에 부착하여 공기 건조시키고, 일련의 자일렌 처리를 통해 투명화한 후 lin에 마운팅합니다.광학 현미경의 40배 배율로 플라크를 관찰하고, 앞서 설명한 대로 마우스에서 뇌 조직을 추출하여 마우스당 슬라이스별 평균 플라크 수를 정량화합니다. 4~5개의 뇌 반구 절편을 유리 슬라이드에 부착하고 완전히 공기 건조시킨 후, 70% Ethanol에서 1분 동안, 이어서 80% ethanol에서 1분 동안 샘플을 완전히 탈수시킵니다. 그 다음, 슬라이드를 0.1% 여과된 THEOF Flavin S 용액에 넣고 15분 동안 배양합니다.Theof Flavin S 용액과 염색된 슬라이드를 빛으로부터 보호하며 주의하여, 80% ethanol로 1분간, 70% ethanol로 1분간, 그리고 증류수로 두 번 세척합니다. 이제 슬라이드를 수성 마운팅 매질로 마운팅하고 어두운 곳에서 최소 2시간 동안 공기 건조시킨 후, 투명 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉합니다. 염색된 절편은 4 °C의 암소에 보관하십시오.마지막으로, 1주일 이내에 형광 현미경을 사용하여 녹색 형광으로 염색된 플라크를 시각화합니다. 항간질제이자 기분 조절제인 발프로산(valproic acid)의 retic 플라크 형성 억제 효능에 관한 최근 연구에서, 당사는 위에서 설명한 면역 염색 및 flavin s 염색 절차를 사용하여 ad 모델 마우스의 retic 플라크를 식별하였습니다. 전형적인 9개월령 A PP 23 형질전환 마우스에 BIOTINYLATED 4G eight를 사용하여 anti A beta 염색을 수행하고 ABC법을 통해 검출하였습니다.신경 망상 플라크(Neuro retic plaques)는 항체로 명확하게 라벨링되어 있으며 흰색 화살표로 표시되어 있습니다. 여기서는 flavin S 염색을 통해 2개월 된 APP 23 times PS 형질전환 마우스의 망상 플라크 침착을 검출합니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 3일 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 4% PFA로 뇌를 완전히 고정하고 뇌가 30% sucrose 용액의 바닥까지 완전히 가라앉도록 하는 것이 중요합니다.이 절차를 마친 후, tau의 과인산화 및 신경세포 손실과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 tau에 대한 면역 염색과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

AD의 형질 (TG) 마우스 모델을 어떻게 그리고 왜 Aβ 또는 타우 수준 CSF의 변화에​​ 질병이 인간의 환자에서 진행됨에 따라 조사를 위해 좋은 기회를 제공합니다. 여기, 우리는 마우스 시리얼 CSF 샘플링을위한 세련된 cisterna 마그나 찔린 기법을 보여줍니다.

Cisterna 마그나 마우스에서 뇌척수의 직렬 그룹에 대한 기술

출처: Bisht, K., et. al. β-Amyloid Plaques와의 미세아교세포 상호 작용을 연구하기 위한 Correlative Light and Electron Microscopy. J. Vis. 특급. (2016) 이 비디오는 형광 및 명시야 현미경을 사용하여 알츠하이머병 마우스 뇌 절편에서 Methoxy-X04 표지 아밀로이드 플라크의 시각화 및 매핑을 보여주며, 알츠하이머 병리학 연구를 위한 플라크와 해부학적 구조의 정확한 상관관계를 가능하게 합니다.

알츠하이머병 마우스 뇌 절편에서 메톡시-X04 표지 아밀로이드 플라크의 시각화 및 매핑

출처: Arango-Lievano, M. et. al., 대뇌혈관 구조의 종단 생체 내 이미징: 중추신경계 질환과의 관련성. J. Vis. Exp. (2016)이 비디오는 형광 표지된 아밀로이드 플라크와 대뇌 혈관 구조를 시각화하기 위한 생체 내 이광자 이미징을 보여줍니다. 파란색 형광은 플라크를 표시하고 녹색 형광은 뇌 혈관을 강조합니다. 관심 영역의 3D 지도와 고해상도 모자이크 이미징은 아밀로이드 플라크와 대뇌 혈관의 상세한 상호 작용을 보여줍니다.

알츠하이머병 마우스 모델에서 대뇌혈관 및 아밀로이드 플라크의 생체 내 이미징

여기에서는 아밀로이드-베타의 직접 입체성 뇌 주입을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론은 뇌 뉴런에 대한 아밀로이드-베타의 단기적인 영향을 해결하기 위한 대안적인 생체 내 마우스 모델을 제공합니다.

마우스 해마에 올리고머 아밀로이드 - 베타의 정위 주입

아밀로이드-β (Aβ)의 동물 모델에 정의 된 수량 및 Aβ 단편 종의 관리를 가능하게하고 각 연구 그룹 내의 개별 차이를 줄여 주사 하였을. 이 프로토콜은 정상 마우스에서 알츠하이머와 같은 행동 이상의 생산을 가능하게 정위기구없이 Aβ​​의 뇌실 (ICV) 주입을 설​​명합니다.

일반 마우스의 아밀로이드-β의 펩티드의 뇌 실내 주사는 급성 치매와 같은인지 적자를 유도합니다

여기서는 토닉과 효소 결합 된 미세 배열 (MEA)를 사용하여 생체 내 세포 외 글루타메이트 phasic 변화를 측정하는 공간적 및 시간적 정확한 방법에 대한 설치 소프트웨어 탐색 및 데이터 분석을 기술한다.

효소 기반의 바이오 센서를 사용하면 알츠하이머 병 마우스 모델에서 토닉과 Phasic이 품목을 측정하는

여기에는 β- 아밀로이드증 및 타우 병증 유전자 변형 마우스 모델에서인지 및 기능 운동 행동에 대한 생체 내 효능을 나타내는 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수있는 단계적 행동 스크리닝 방법이 기재되어있다. 이 방법은 단기 및 작업 메모리 작업에서 활동을 위해 화합물을 스크리닝하기 위해 최적화됩니다.

아밀로이드 -β 및 타우 신경 병증의 유전자 변형 마우스 모델에서 자발적 교대, 새로운 대상 인식 및 사지 걸림의 평가

본 프로토콜은 알츠하이머병의 APP/PS1 트랜스제닉 마우스 모델에서 아밀로이드-베타 부하를 정량화하기 위해 시상 마우스 뇌 절편의 전체 영역 또는 관심 영역 분석을 수행하는 절차를 설명하고 비교한다.

마우스 뇌 절편에 대한 아밀로이드-베타 부하의 전체 대 하위 지역 정량화

알츠하이머병 중 하나는 기능은 Aβ의...

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42</subHippocampal 조각에 시냅틱 소성 장애의>와 유도

Aptamers는가 선택한 짧은 ribo-/deoxyribo-oligonucleotides...

아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 병의 원인이되는 에이전트에 대한 Aptamers의 선택

학습하세요 알츠하이머 질병 마우스 모델에서 뉴라이틱 플라크를 검출하는 면역조직화학적 및 형광 염색법을. 4G8 항체와 티오플라빈 S를 사용하여 아밀로이드 베타 단백질을 특이적으로 시각화하고 병리학적 변화를 정밀 분석하는 효과적인 기술입니다.

알츠하이머 질병 마우스 모델에서 Neuritic Plaques의 감지

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