Name: 조류 FTA 카드 인플루엔자 감시 : 필드 방법, Biosafety, 그리고 교통 문제 해결 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: 학습하세요 조류 인플루엔자 바이러스 감시를 위한 FTA 카드 샘플링 방법을 배우세요. 야생 조류 분변에서 RNA를 추출하고 역전사 PCR로 바이러스를 식별하는 이 기술은 냉장 유지 없이 원격 지역에서 고처리량 분석을 가능하게 합니다.

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우리는 기술 지원 버트 Dibbits 감사합니다. 동물 사육 및 게놈 그룹, Wageningen 대학, 네덜란드, 아낌없이 자신의 실험실에서 우리를 열었다. Ottenby 버드 천문대, 스웨덴의 직원은 특정 매그너스 Hellström, 마커스 Danielsson, 크리스토퍼 매그너슨 및 Stina 앤더슨에 맬러즈 트래핑 및 샘플링에 대한 감사입니다. 우리는 실험실에서 촬영을위한 Sanne 스벤슨, Jonatan Qvist 및 Ottenby에서 촬영을 위해 당 엑셀 Gjöres, 그리고 마노 Camon 감사드립니다. 다니엘 Bengtson이 간행물의 비디오 부분에 대한 아름다운 오리 사진을 제공했습니다. CDC 보건 이미지 라이브러리 (필,에서 자유 자재 <a href="http://phil.cdc.gov/phil/">http://phil.cdc.gov/phil/는</a> ) 사용 되었음 : 전자 현미경 (제 280; 박사 어스킨 팔머에 의해)와 그림 (제 11823을; 인플루엔자 바이러스의 더글러스 요르단)에 의해. 재정 지원은 KNJV (로얄 네덜란드 사냥꾼 협회), 농업의 네덜란드 교육부, Faunafonds과에는 Stichting 드 Eik 트러스트 (모두 네덜란드)에 의해 주어진 것으로 스웨덴 연구 협의회 (부여 안돼. 2007-20774)과 EC Newflubird 프로젝트 설립. RNA 격리 화학 물질 앰비온, Inc의 RNA 회사의 후한 선물했다. 이것은 Ottenby 버드 천문대에서 기여 번호 245입니다.

1. 오리 트래핑 및 Cloacal 보라고 <ol><li> 함정 류어 오리 또는 음식을 유치하여 케이지에 속 Anas (또는 다른 조류)의 오리 dabbling, 개인 카드 보드 상자에 넣어 두었어요. 상자에 교통 시간은 함정에 가까운 거리 내에서 필드 스테이션을 설치하여, 예를 들어, 최소로 보관해야합니다. 물류 환경은 각 연구에 따라 다를 수 있습니다. 조언 및 관련 동물 윤리위원회의 승인이 설정 각각의 새로운 추적을해야합니다. 또는 또한 사냥꾼 쇼트 조류는 샘플 수 있습니다. </li><li> 그 몸에 꽉 날개를 개최하여 상자의 오리 뽑아 낸다. 직접 상자의 아래쪽에서 가지 경우 대부분 존재하는 신선한 떨어지는를 샘플. 멸균 면봉으로 그들을 들고 왓먼 ​​FTA 카드에 유체를 적용해야합니다. 그렇지 않다면, cloacal 보라고을 수행합니다. </li><li> 의 뒷면에있는 오리를 켭니다. 이것은 하수에 대한 액세스를 허용하고 샘플링을 용이하게합니다. 하수구가 꼬리의 기본에 가까운 복부 아래에 위치하고 튀어나온 구조입니다. 경험이 풍부한 사람이 보유하고 샘플 새를 동시에, 또는 다른 두 사람이 도와 드릴 수 없습니다. </li><li> 조심스럽게 멸균 플라스틱 레이온 면봉 (코판, 이탈리아) 약 1cm를 삽입하고 하수의 완만한 소용돌이를 확인하십시오. 왓먼 FTA 카드의 표면을 통해 하수의 유체로 면봉을 롤. 동물의 샘플링을 수행한 후에는 즉시 릴리스는 바람직합니다. </li><li> 최소한 1 시간 동안 실온에서 FTA 카드를 건조 후, 종이 봉지 (예 : 봉투)에 각각 샘플을 저장합니다. 스토리지 아마도 습한 기후에서 실리카 비즈와 상온에서 가능합니다. 전송 및 기관 'biosafety 임원을 받고는 병원균이 FTA 카드 표면과 접촉시 운영 중지 상태가 될 있기 때문에, 일반 우편으로 FTA 카드를 보낼 수 있도록 수 있습니다. </li></ol> 2. 바이러스성 RNA 격리 <ol><li> 찌끼 / cloacal 유체를 포함하여 FTA 카드 자료를 추출합니다. 펀치 세 번 해리스 2mm의 구멍을 뚫는 장소 RNase 무료 96well 판의 우물에 사람을 모두와 함께 디스크. 각각의 새 샘플 사이, 알코올과 김 정학 (Kimtech) 닦아와 함께 조심스럽게 구멍을 뚫는를 청소하십시오. 항상 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 사용합니다. 긍정적인 컨트롤은 갓 FTA 카드에 적용 실험실 변형, 또는 긍정적인 결과를 얻을 수 알지있는 자연 샘플로 구성될 수 있습니다. 대조군으로, 빈 FTA 카드에서 디스크를 펀치. 또한, (템플릿으로 물로) 나중에 실험에서 PCR 컨트롤에 대한 또 다른 잘 무료로 둡니다. </li><li> 70μl RNA 빠른 추출 솔루션 (앰비온)과 열 밀봉 플레이트 (AbGene 온습 실러) 추가합니다. (; 사전에 시험이 사용된 접시 쉐이크 모델에 따라 다름) 유출 - 이상 발생하지 않는 결정 속도 상온에서 접시 쉐이크 5 분 알을 품다. </li><li> MagMAX - 96 바이러스 RNA 격리 키트 (앰비온)와 제조 업체의 프로토콜에 따라 바이러스성 RNA 격리 운반. 간단히 : 시간을 추가하십시오 130μl 준비 용해 / 각 잘하는 바인딩 솔루션 (키트에서). 전송 50μl는 각 잘하는 FTA 카드 자료를 추출. 1 분 접시를 흔들어. </li><li> 그리고 아래로 pipetting하여 각 샘플과 섞어 20μl 준비 구슬 믹스 (키트에서) 추가합니다. 5 분 결정 속도를 흔들어. RNA 분자는 자석 구슬에 바인딩합니다. </li><li> 자장으로 접시를 이동 96 잘 구슬을 캡처하라. 사용 자성 스탠드의 모델에 따라,이 5 분 이상 걸릴 수 있습니다. 솔루션은 완전히 명확 살이되면 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. 그런 다음 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 세척 용액 1 두 번 씻어 솔루션 2 (키트에서)와 함께 두 번 구슬을 씻으십시오. 4 세척 단계 각 각 샘플을 150μl 준비 세척 솔루션을 추가하는 경우, (또는 솔루션은 완전히 명확까지) 결정 속도에 1 분, 자기 서서 접시를 이동 약 5 분 동안 구슬을 캡처 흔들, 제거하고 뜨는 폐기하십시오. 그런 다음 자석 스탠드에서 접시를 제거 다음 씻어 솔루션을 추가하고, 같은 이전에 세척 단계를 수행합니다. 마지막 세척 단계 후, 2 분 동안 접시 통에 실온에서 가능하고 공기 건조 비즈만큼 씻어 솔루션을 제거합니다. </li><li> 비즈에서 RNA를 해제하고 접시 쉐이크 4 분 흔들 용출 버퍼의 50μl를 (키트에서) 추가합니다. 이전에 설명한대로 구슬을 캡처합니다. 뜨는 지금 하류 애플 리케이션을위한 준비가 분리된 RNA가 포함되어 있습니다. </li></ol> 3. AIV 매트릭스 진의 RT - PCR 25 μl 반응에서 한 단계 RT - PCR 교통 시스템과 역방향 전사 PCR (RT - PCR) (Promega)를 수행 (. 크라우스 외에서 조정 18 Fouchier 외 22.) <table border="1"><tbody><tr><td> Nuclease 무료로 물 </td><td> 1.5μl </td></tr><tr><td> AMV / Tfl5 버퍼 </td> 5μl </tr><tr><td> dNTPs </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> 프라이머 M52C 22 (10 μm의) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> 프라이머 M253R 22 (10 μm의) </td><td> 2.5μl </td></tr><tr><td> MgSO 4 (25 ㎜) </td><td> 7μl </td></tr><tr><td> AMV 반대 transcriptase (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> Tfl 효소 (5u/μl) </td><td> 0.5μl </td></tr><tr><td> RNA 샘플 </td><td> 5μl </td></tr></tbody></table> Biometra T1 thermocycler의 PCR 조건은 45 45 분 초기 역방향 전사 ° C, 94에서 이분 초기 변성 다음 ° C와 40 사이클 : 94 ° C 1 분, 1 분 56 ° C, 그리고에 대한 2 분 동안 68 ° C. 68에서 추가로 7 분 연신율은 ° C의 증폭을 마칩니다. 4. AI - 긍정적인 샘플에 대한 검사 및 젤에서 타겟 파편의 정화 <ol><li> 사전 심사 1 %의 ethidium의 브로마이드 (100 ML 젤 당 2.5μl) 물들일 1 % 아가로 오스 겔 (로체)에 2μl 배 로딩 염료 (BioRad)와 6μl 물과 혼합 PCR 제품의 2μl를로드합니다. </li><li> DNA 크기 표준 (BioRad EZ 하중 100 BP의 사다리)와 함께, 120V에서 1 시간 동안 젤을 실행, 겔 문서 시스템과 시각화. 그림 1의 예제를 참조하십시오. </li><li> 예상 크기 범위에서 증폭된 파편 (200 BP 300 BP (대상 조각은 244 BP)을 사이로 샘플을 선택합니다. 2 6μl 배 로딩 염색과이 후보의 전체 PCR 반응 볼륨을 (23μl를 ~ 중 왼쪽에 있습니다)로드 %의 ethidium의 브로마이드는 아가로 오스 겔을 스테인드 2 시간 동안 실행됩니다. </li><li> UV - transilluminator (Bioblock 과학)에 젤 장소와 시각 검사. 그림 2에서 예제를 참조하십시오. 개별 1.5 ML 반응 튜브에 메스와 배치로 젤에서 올바른 크기의 엑사이스 밴드. Zymoclean 젤 DNA 복구 키트 (Zymo 연구)와 예를 들어, 겔에서 조각을 정화. </li></ol> 5. 시퀀싱 및 PCR 제품 식별 <ol><li> ABI 빅 다이 3.1 화학 (응용 Biosystems)와 ABI 3730 모세관 시퀀서에 대한 인스턴스에 대한 대상 조각 생거 시퀀싱을 수행합니다. 포함된 10μl 권 시퀀싱 반응을 준비 10-20 NG 젤 - 정화 템플릿 cDNA, 1.75μl 배 희석 버퍼, 0.5μl 빅 다이 V3.1의 premix, 1 μl 앞으로 프라이머 (M52C 20, 10 ㎜)과 ddH2O 있습니다. 자전거 조건은 다음과 같습니다의 25주기에 의해 다음 1 분 초기 변성, : 96 10 S ° C, 45 ° C 60 4 분 5 S ° C. 정화 및 내부 프로토콜에 따라 순서 반응을 준비합니다. </li><li> 이러한 바이오 정보 (NCBI에 대한 국립 센터 BLAST와 같은 웹 기반 도구를 예를 들면 같은 GenBank23 같은 뉴클레오 티드 데이터베이스에 대한 cDNA 시퀀스를 발생 식별 <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li></ol> 6. 대표 결과 : 맬러즈 (Anas platyrhynchos)는 2007 년 12 월에 Ottenby 버드 천문대에서 샘플링했다. 이 프로토콜에서 설명한대로 각 맬러드에서 FTA 카드의 샘플을 촬영했다. 배송 후, FTA 카드는 2 년간 -20 ° C에서 냉동실에 보관했다. 연구소의 동일한 FTA 카드 샘플 크라우스 외에 테스트 분리. 18은 긍정적인 제어뿐만 아니라 아홉 열배 시리얼 dilutions로 포함되었습니다. 마이너스 2 점 컨트롤) 빈 FTA 카드에서 추출, 구멍을 뚫는에서 - 이월있다면 테스트하고, nuclease 무료 물을 템플릿으로 사용어진 II) RT - PCR 반응, 오염 동안 발생한 경우 테스트, 아니면되었습니다 PCR 반응의 준비 인치 84 샘플을 분석했다. 다음 84 샘플의 PCR 제품의 겔 그림은 그림 1에서 찾을 수 있습니다. 자연 샘플 unspecific 밴드의 수많은이 선고를받은 여러 미생물 contaminations의 존재로 인해 볼 수 있습니다. 그러나, 뇌관의 쌍 대상 조각은 244 BP 깁니다. 약 올바른 크기 범위 (200 BP 300 BP 사이)에서 조각을 제작 샘플의 하위 집합의 전체 PCR 반응 볼륨 젤 (그림 1)에로드되었습니다. 겔에서 해고당한 밴드 중 일러스트는 보충 그림 1에서 찾을 수 있습니다. 긍정적인 컨트롤 이외에,이 샘플의 두 종류 (69899 및 69912) 새로운 프로토콜에 의해 긍정했다. 다른 모든 밴드가 가장 밀접하게 박테리아 시퀀스를 닮은, 혹은 전혀 읽을 수있는 순서를 양보 안하면서 NCBI 뉴클레오 티드 데이터베이스에 대해 BLAST 검색, AI 유전자 매트릭스 (그림 3)로 자신의 정체성을 공개했다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. PCR 제품의 예비 심사의 젤 그림. 긍정적인 제어 2 μl PCR 제품, S긍정적인 컨트롤, 두 부정적인 컨트롤과 84 cloacal 샘플 에리얼 dilutions가로드되었습니다. 48 샘플은 아래쪽 패널에서 최고의 겔 패널, 48 샘플에 표시됩니다. 빨간색 화살표는 100 BP의 DNA 크기의 표준에 사용되는 겔 차선을 나타냅니다. 그림 들면, 빨간 동그라미가 예상 크기 범위에서 밴드를 보여줍니다. 블루 동그라미 unspecific amplicon (상단 왼쪽) 또는 크기 100 BP (하단 오른쪽) 아래 프라이머의 이합체의 인위를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 200 BP 300 BP (대상 244 조각 BP) 사이의 밴드와 함께 올바른 크기의 범위에서 파편 샘플 선택. 샘플이 선택되었습니다. 녹색 화살표가 긍정적인 컨트롤을 나타냅니다 두 빨간색 화살표는 NCBI 뉴클레오 티드 데이터베이스에 자신의 cDNA 시퀀스를 비교하여 AIV 긍정적인 것으로 확인되었다 샘플을 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/2832/2832fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. NCBI에서 대표 BLAST 검색의 화면 캡처. excised 조각에서 얻은 cDNA 시퀀스 중 하나는 NCBI 웹사이트에서 뉴클레오 티드 데이터베이스에 대해 질의했다. 예제가 올바르게 AI 매트릭스 유전자 조각으로 식별됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2832/2832fig3large.jpg">이 이미지의 전체 크기 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="보조 그림 1" src="/files/ftp_upload/2832/2832supfig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="보충 그림 1"> 보충 그림 S1. 겔에서 excised 선택된 샘플의 밴드.이 사진은 200 BP 300 BP 사이의 후보 밴드 후에 그림 1에 묘사된 겔에서 찍은이 도려되었습니다.

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, 트래핑 취급 및 조류 샘플링하는 것은 국가의 법률에 따라 수행되었으며 농업과 연구 동물 윤리위원회의 스웨덴어위원회에 의해 승인되었습니다.

여기에서 설명한 프로토콜은 AIV의 존재를 faecal 또는 유사한 샘플을 화면으로 보충 방법을 제공합니다. 이것은 특히 샘플 수집 빠르고 쉽게하도록 설계되었습니다. 이렇게하면 같은 사냥꾼이나 야생 동물의 관리자로서 적은 훈련 명, AI 감시에 기여 할 수 있습니다. 가능한 샘플을 냉동 것은 권장하지만 아무도 시원한 체인은 적용할 필요가 없습니다. 실온의 며칠 예를 들어 실험실로 이송하는 동안, 카드 건조 남아만큼, FTA 카드에서 RNA 분자에 대한 문제가되지 않았습니다. 이러한 알코올 15 구아니딘 16로 현재 연구 공동체에 의해 평가하는 다른 비 냉각 저장 시스템은, 때문에 그들의 유해 자연의 특별 운송 계약이 필요합니다. 반면, FTA 카드 방식은 유해 물질의 전달을 요구하지 않습니다. 그러나, 이러한 측면에서 또 다른 흥미로운 저장 매체는 17도 위험이 아니라고 RNAlater ™입니다. 샘플 분석은 어떤 표준 분자 연구실에서 진행하실 수 있습니다. 일반적인 PCR 반응 및 모세관 배열 이외의 특별한 장비는 필요 없었습니다. 이미 샘플 컬렉션에있는 잠재적인 병원성 대리인이 FTA 카드의 항균 및 항바이러스 활동에 의해 inactivated 있었기 때문에 모든 단계 biosafety 수준없이 진행 될 수 있습니다. 교차 오염 및 그 이후의 거짓 긍정적인 표본은 야생 조류 샘플의 실험에서 관찰되지 않았습니다. 그러나, RNA 및 PCR 작업했을 때 사전 및 사후 PCR 단계 작업 장소와 별도의 객실을 청소 특별한주의를 지불하는 것이 좋습니다. 펌 후드에 근무하는 실험실에서 에어로졸 오염의 위험을 감소시킵니다. Pipetting 필터 팁을 진행해야합니다. 우리가 84 샘플의 여섯 전통 RealTime에 의해 RT - PCR 방법 24 RealTime을 RT - PCR에서 CT 값이 알려져있다 긍정적인 것을 알고있는 동일한 오리에서 동시에 촬영한 샘플에 대한 이전의 연구에서. CT 값 &lt;30 (바이러스 RNA의 높은 농도를 나타내는)했다 오리에서 우리의 방법의 줄기에 의해 감지 두 가지 긍정적인 샘플. 전통적인 프로토콜로 긍정적인하던 나머지 네 가지 예제&gt; 30 일 (이하 집중)와 우리의 프로토콜에 의해 감지되지 않았습니다 CT 값을했다. 상대적으로 높은 바이러스 titers만이 샘플의 분석에 긍정적인되었으며 그것은 방법의 감도는 모든 긍정적인 샘플을 감지하는 실패의 원인이라고 가능성이 높습니다. 또한, 현재 연구의 표본 크기가 매우 낮은 경우 더 많은 통제와 엄격한 실험을 수행하는 경우 메서드는 완전히 개발 및 평가 수 있습니다. 이 샘플은 원격 지역에서 수집했을 경우에는, 전통적인 분석이 전혀 불가능되지 않았을 것입니다. 또한 이러한 첫번째 결과 더 최적화가 필요 파일럿 실험에서 줄기. 샘플 수집 후 정기적으로 -20 ° C의 냉장고에서 2 년간의 저장 기간은 아마도 또한 바이러스 RNA의 품질에 영향을. inactivated 바이러스의 상온 저장을 상대할 때는이 가능한 RNA 저하가 중요한 문제입니다. 상기와 같은 다른 액체에 저장된 샘플은 바이러스 게놈 16 이상 펼쳐진 분석 영향을 크게 저하의 고통. 우리의 연구에 테스트하지 않지만, FTA 카드는 물론 조류 독감 바이러스 25, 26 매우 유사한 다른 RNA 시스템에 그대로 RNA 분자를 보존하기 위해 적합한 것으로 입증했습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약이나 악기의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 플라스틱 레이온 마른 면봉 </td><td> 코판, 이탈리아 </td><td> 167KS01 </td><td></td></tr><tr><td> FTA 카드 </td><td> 워트 먼지 </td><td></td><td> 몇 가지 옵션을 </td></tr><tr><td> 매트와 해리스 마이크로 펀치 2mm </td><td> 워트 먼지 </td><td> 1,154,409 </td><td></td></tr><tr><td> RNase 무료 96well 플레이트 </td><td> 그라 이너 바이오 원 </td><td> 652290 </td><td> 또는 유사한 </td></tr><tr><td> 김 정밀 쳐줍니다 </td><td> Kimtech </td><td> 75,512 </td><td></td></tr><tr><td> RNA 빠른 추출 솔루션 </td><td> 앰비온 </td><td> AM9775 </td><td></td></tr><tr><td> MagMAX - 96 바이러스성 격리 키트 </td><td> 앰비온 </td><td> AM1836 </td><td></td></tr><tr><td> 원 - 스텝 RT - PCR 교통 시스템 </td><td> Promega </td><td> A1250 </td><td> 또는 유사한 </td></tr><tr><td> 아가로 오스 MP </td><td> 로체 </td><td> 1388991001 </td><td> 다목적 아가로 오스 </td></tr><tr><td> 배 로딩 버퍼 </td><td> BioRad </td><td></td><td> DNA 사다리와 함께 배달 </td></tr><tr><td> EZ 하중 100 BP 사다리 </td><td> BioRad </td><td> 170-8353 </td><td> 또는 유사한 </td></tr><tr><td> Ethidium 브로마이드 1퍼센트 </td><td> Fluka </td><td> 46,067 </td><td> 또는 유사한 </td></tr><tr><td> 1.5ml 반응 튜브 </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> 또는 유사한 </td></tr><tr><td> Zymoclean 젤 DNA 회복 키트 </td><td> Zymo 연구 </td><td> D4001 </td><td> 또는 유사한 </td></tr><tr><td> ABI 큰 염료 3.1 화학 </td><td> 응용 Biosystems </td><td></td><td> 또는 유사한 </td></tr></tbody></table>

조류 fta 카드 인플루엔자 감시 : 필드 방법, biosafety, 그리고 교통 문제 해결

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

조류 독감 바이러스 (AIVs)는 인간이 하나 등 많은 포유 동물을 감염. 이러한 AIVs 거의 모든 가능한 바이러스 subtypes 2 품고 그들의 자연적인 호스트로 다양합니다. 독감의 인간 전염병은 원래 AIVs 3 줄기. 최근에 H5N1 발생하는 동안 많은 치명적인 인간의 환자가보고되었다. 최근, 새로운 AIV 관련 변종은 &#39;신종 인플루엔자의 유행&#39;4 유발, 인간의 인구를 휩쓸고. 인간의 무역과 운송 활동이 높은 병원성 종자 5의 확산에 대한 책임 것으로 보인다 있지만, 분산도 일부 야생 조류 6, 7에 의한 수 있습니다. 그러나 모든 AIV 종자의 실제 저수지 야생 조류입니다. 이것과 가금류 산업에 심각한 상업적인 손실의 얼굴에 대한 반응으로, 대형 감시 프로그램은 AIVs의 생태에 대한 정보를 수집하고, 특정 고도의 병원성 변종 8-12을 감지하는 조기 경보 시스템을 설치하는 세계적으로 구현되었습니다. 전통 virological 방법은 바이러스가 온전하고 분석하기 전에 재배가 필요합니다. 이것은 깊은 냉동고 및 수송 동안에있을 무거운 biosafety 절차와 엄격한 감기에 사슬을 요구. 장기 감시 따라서 일반적으로 잘 갖추어진 실험실에 가까운 몇 가지 필드 방송국에 제한됩니다. logistically 성가신 절차를 구현하지 않는 원격 영역은 샘플 수 없습니다. 이러한 문제는 13 인정, 14, 대체 저장소 및 운송 전략의 사용 (알콜이나 구아니딘) 15-17를 조사하고 있습니다. 최근 크라우스 외. 18 특수 여과지에 따라 수집하는 방법, 저장 및 전송 AIV 샘플을 소개했다. FTA 카드 19 건조 저장 기준 20 RNA를 보존 및 연락처 21시 비활성 병원균을 렌더링합니다. 이 연구는 FTA 카드 리버스 전사 PCR과 결과 cDNA가 합성 및 바이러스 유전자와 결정 될 수 AIV RNA를 감지하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났다. AIV가 사용되었고, 샘플 개별적으로 처리했는지 크라우스 외. 18 연구에서는 실험실 격리. 여기에 제시 확장에 Ottenby 버드 천문대 (SE 스웨덴)에서 오리 트랩에서 야생 조류에서 faecal 샘플은 현장 조건에 따라 방법의 유용성을 설명하기 위해 직접 테스트했다. cloacal 면봉으로 오리 및 샘플 수집 잡는 것은 증명합니다. 현재 프로토콜은 하나의 튜브 처리에서 96 잘 설계 작업 흐름의 최대 - 스케일링을 포함합니다. 전통적인 방법보다 민감하지만, FTA 카드의 방법은 대형 감시 제도에 대한 훌륭한 보완을 제공합니다. 그것은 알코올이나 구아니딘 같은 위험한 시약의 운송과 관련하여 시원한 체인 또는 안전 규정을 유지하기 위해 필요없이 어디서나 세계에서 샘플의 수집과 분석이 가능합니다.

조류 독감 바이러스의 RNA를 보존 감지하고 순서 방법 확인과 조류의 자연 faecal 샘플을 사용하여 확장되었습니다. 이 기술은 시원한 체인 및 전염성 바이러스의 취급을 유지의 필요성을 제거하고 96 - 웰 높은 처리량 설치에 적용할 수 있습니다.

조류 FTA 카드 인플루엔자 감시 : 필드 방법, Biosafety, 그리고 교통 문제 해결

조류 인플루엔자 바이러스(AIV)는 인간을 포함한 많은 포유류를 감염시킵니다1. 이러한 AIV는 천연 숙주가 매우 다양하며, 거의 모든 가능한 바이러스...

최근의 신종 돼지 독감 유행을 포함한 인간의 인플루엔자 팬데믹은 인플루엔자 A 바이러스의 한 종인 조류 인플루엔자 바이러스(A IV)에서 비롯되었습니다. A IV의 생태계에 관한 정보를 수집하고 고병원성 균주를 탐지하기 위해 대규모 감시 프로그램이 시행되어 왔습니다. 본 영상에서는 야생 조류로부터 A IV 샘플을 분리하고 식별하는 방법이 제시됩니다.먼저 오리를 포획합니다. 오리의 분변을 수집하여 FTA 카드에 도포하며, 이는 건식 보관을 위해 바이러스 RNA를 보존하는 역할을 합니다. FTA 카드에서 샘플을 채취하고 분변 물질을 추출합니다. RNA를 추출한 후 자성 비드(magnetic beads)를 사용하여 정제합니다.CD NA를 생성하기 위해 역전사 PCR을 수행하며, 이후 이에 대한 서열 분석을 진행합니다. 생성된 서열을 기지의 a IV 서열과 비교하여 샘플에 존재하는 a IV의 유형을 확인합니다. 감염성 바이러스를 증식시키는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 엄격한 배양 조건을 유지할 필요가 없으며, 원거리 지역의 샘플링이 용이하다는 점입니다.또한, FDA 카드를 이용한 생물안전 규정의 시행이 더 용이합니다. 이 방법은 어떤 인플루엔자 균주가 발생하는지와 같이 질병 생태학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 이 방법은 조류 인플루엔자 연구에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.이 방법은 바이러스 및 기타 미생물에 의해 발생하는 다른 야생동물 질병과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 살아있는 오리나 다른 조류를 포획하고 샘플링하는 데 숙련도가 필요하며, RNA를 이용한 실험실 작업이 까다롭기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 우리는 Watman FDA 가드에 저장된 동물 분변에서 일반 DNA를 성공적으로 샘플링하고 분리했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었으며, 유인용 오리나 먹이로 유인하여 케이지에 쇠오리나 다른 조류를 가두어 포획했습니다.여기서는 onus 속의 오리들을 포획합니다. 포획된 오리들을 각각 개별 판지 상자에 넣으십시오. 오리의 날개를 몸에 밀착시켜 단단히 잡은 상태로 상자에서 꺼내십시오.대부분의 경우, 상자 바닥에 신선한 액체 배설물이 남아 있습니다. 매번 새로운 멸균 면봉을 사용하여 배설물을 채취한 후, 카드의 표면이 충분히 젖을 때까지 Watman FTA 카드에 도포하십시오. 상자 바닥에 배설물이 없는 경우에는 총배설강 면봉 채취를 수행하십시오.먼저 오리를 배가 위로 향하도록 눕혀 총배설강에 접근할 수 있게 합니다. 총배설강은 복부 아래쪽 꼬리 기부 근처에 돌출된 구조물입니다. 필요한 경우, 숙련된 작업자는 새를 잡는 동시에 시료 채취를 수행할 수 있습니다.첫 번째 사람이 새를 잡고 있는 동안 두 번째 사람이 샘플 채취를 도울 수 있습니다. 멸균 플라스틱 레이온 면봉을 약 1cm 정도 조심스럽게 삽입하고 배설강 부위를 부드럽게 닦아냅니다. 면봉을 제거한 다음, 이를 Whatman FTA 카드의 표면에 굴려 묻힙니다.FTA 카드를 실온에서 최소 1시간 동안 건조합니다. 각 샘플을 종이 봉투에 넣습니다. 그 후, 단기 보관 시에는 봉투를 실온에 보관하고, 장기 보관 시에는 냉동 보관합니다.FTA 카드는 병원균이 비활성화되므로 일반 우편으로 보낼 수 있습니다. 흄 후드 내에서 작업을 수행하며 FTA 카드 표면과 접촉하십시오. Harris 2mm 펀처를 사용하여 분변을 포함한 FTA 카드 재질을 추출함으로써 바이러스 RNA 분리 절차를 시작합니다. 디스크 3개를 펀칭하여 RNAse-free 96웰 플레이트의 웰에 모두 넣으며, 각 새로운 샘플 사이에 간격을 둡니다.알코올과 Kim precision wipe를 사용하여 펀처를 주의 깊게 세척합니다. 양성 대조군을 생성합니다. 음성 대조군으로서 실험실 균주를 FTA 카드에 도포합니다.빈 FTA 카드에서 디스크를 펀칭하여 떼어냅니다. 이를 이전과 동일하게 플레이트에 넣되, PCR 대조군을 위해 다른 웰 하나를 비워 두십시오. 실험 후반부에 해당 웰에 RNA rapid extraction solution 70 µL를 추가합니다.그런 다음 써모 실러(thermo sealer)를 사용하여 플레이트를 열 밀봉하고, 플레이트를 쉐이커 위에 놓은 뒤 내용물이 넘치지 않도록 속도를 설정합니다. 실온에서 5분 동안 플레이트를 흔들어 배양합니다. 배양 후, 키트에 제공된 빈 플레이트의 각 웰에 준비된 lysis binding solution 130 µL를 넣고 ambience Mag Max 96 키트를 사용하여 바이러스 RNA를 분리합니다.그 다음 추출된 FDA 카드 물질 50 µL를 각각 옮깁니다. 플레이트를 쉐이커에 올리고 1분 동안 작동시킵니다. 이어서, 키트에서 준비된 비드 믹스 20 µL를 각 샘플에 첨가하고 파이펫팅으로 혼합한 후 5분 동안 쉐이킹합니다.이 배양 과정 동안 RNA 분자가 자성 비드에 결합하게 됩니다. 그 다음, 용액이 완전히 투명해지면 플레이트를 96웰 자성 스탠드로 옮겨 비드를 포집하십시오.피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 버립니다. 그런 다음 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. 각 샘플에 준비된 세척액 150 µL를 첨가하여 비드를 세척하고, 1분 동안 흔든 후 자석 스탠드에서 비드를 포집합니다.용액이 완전히 투명해지면, 상청액을 제거하여 버립니다. 이 세척 과정을 한 번 더 반복합니다. 그 다음, 용액 2를 사용하여 두 번 세척합니다.마지막 세척 후, 피펫을 사용하여 용액을 최대한 제거하고 건조한 플레이트를 상온의 쉐이커에 2분 동안 두어 비드를 공기 건조시킵니다. 비드가 건조되면 키트에 포함된 용출 버퍼 50 µL를 첨가하고 4분 동안 흔들어 비드에서 RNA를 분리합니다. 이전과 동일한 방법으로 비드를 회수합니다.이제 상층액에는 분리된 RNA가 포함되어 있으며, 이는 바이러스 유전자의 cDNA를 생성 및 증폭하는 하위 응용 단계에 사용할 준비가 된 상태입니다. 동봉된 서면 프로토콜에 기술된 대로 25 µL 반응 부피의 one step access R-T-P-C-R 시스템을 사용하여 역전사 PCR을 수행하십시오.PCR이 완료되면 샘플의 IV 양성 여부를 스크리닝하고 정제할 수 있습니다. 샘플의 IV 양성 여부를 판단하기 위해, 1% aro 겔에 2 µL의 PCR 산물을 로딩하고 1% atherium bromide로 염색한 후 120 V에서 1시간 동안 전기영동을 수행합니다. 겔 문서화 시스템으로 시각화하여 예상 크기 범위에서 증폭된 단편이 있는 샘플을 확인합니다.여기서 표적 단편은 244 bp입니다. 따라서 빨간색 원으로 표시된 것과 같이 200 bp에서 300 bp 사이에 밴드가 나타나는 샘플을 찾으십시오. 다음으로, PCR 반응액의 나머지를 로딩합니다.2% 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색된 아가로스 겔(agarose gel)에 후보군 약 23 µL를 로딩하고 2시간 동안 전기영동합니다. 겔을 UV 트랜스일루미네이터(transilluminator) 위에 놓습니다. 그런 다음 메스를 사용하여 정확한 크기의 밴드를 절취하고, DNA 회수 키트(DNA recovery kit)를 사용하여 각각 1.5 mL 반응 튜브에 옮깁니다.시퀀싱 및 동정을 위해 겔 조각으로부터 DNA를 정제합니다. 여기서 표적 조각의 Sanger 시퀀싱을 수행합니다. A IV 매트릭스 유전자의 시퀀싱을 위해 정방향 프라이머 M 52 C를 사용합니다.시퀀싱 결과가 확보되면, 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)의 blast와 같은 로컬 또는 웹 기반 도구를 사용하여 cDNA 서열을 GenBank와 같은 뉴클레오타이드 데이터베이스와 비교함으로써 유전자 단편 서열을 기존 항목과 매칭할 수 있습니다. 이를 통해 특정 A IV 균주를 특성화하고 서열 특징에 관한 유용한 정보를 얻을 수 있습니다.2007년 12월 Autumn B 조류 관측소에서 84마리의 청둥오리를 샘플링하였으며, 본 프로토콜에 설명된 대로 각 청둥오리로부터 FTA 카드를 이용한 샘플을 채취하였습니다. 운송 후 FTA 카드는 -20 °C의 냉동고에 2년 동안 보관되었습니다. 이 84개 천연 샘플로부터 얻은 PCR 생성물의 겔 사진이 여기에 제시되어 있습니다.분변 내에 다양한 미생물 오염원이 존재하기 때문에 수많은 비특이적 밴드가 관찰될 수 있습니다. 여기에 사용된 프라이머 쌍의 표적 단편은 244 bp입니다. 예상 크기의 긴 밴드들이 빨간색 원으로 표시되어 있습니다.파란색 원은 100 base pairs 미만 크기의 비특이적 앰플리콘 또는 프라이머 이합체 아티팩트를 나타냅니다. 빨간색 화살표로 표시된 샘플들은 분리 및 시퀀싱되었습니다. 초록색 화살표는 양성 대조군을 나타냅니다.선택된 샘플들은 cDNA 서열을 NCBI 뉴클레오타이드 데이터베이스와 비교하여 IV 양성임을 확인하였습니다. 이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 FDA 카드를 로딩한 시점부터 깨끗한 RNA 템플릿을 얻기까지 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 작업 공간의 청결 유지, 장갑 착용, PCR 전후 작업 환경의 분리, 필터 팁 사용, 그리고 본 절차에 따른 안전 후드 내 작업에 주의를 기울이는 것이 중요합니다.개발 이후, 벡터로 조각을 클로닝하는 것과 같은 다른 다운스트림 응용법을 통해 한 숙주에 여러 조류 인플루엔자 변종이 감염되었는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 이 절차는 질병 생태학 분야의 연구자들이 이전에는 조류 인플루엔자 샘플링이 불가능했던 원격 지역에서 조류 인플루엔자 감염을 탐색할 수 있는 길을 열어줄 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 조류 인플루엔자를 위해 총배설강에서 샘플을 채취하고, FTA 카드에서 RNA 분자를 분리 및 정제하며, 감염 여부와 어떤 변종에 의해 감염되었는지를 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.야생 조류를 다룰 때는 조류 인플루엔자 또는 기타 인수공통 감염병에 감염된 개체를 취급할 위험이 있다는 점을 잊지 마십시오. 따라서 이 절차를 수행하는 동안 항상 보호복을 착용하는 것이 매우 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 연구는 휴대용 RRT - PCR 시스템을 사용 야생 조류에서 조류 독감의 진단을 설명합니다. 방법은 확산 시나리오의 전형이 아닌 실험실 환경에서 야생 조류를 화면에 냉동 건조 시약을 활용합니다. 분자 도구의 사용은 신속한 진단을 위해 정확하고 민감한 대안을 제공합니다.

야생 조류에서 조류 독감 바이러스의 신속한 진단 : 현장에서 휴대용 RRT - PCR 및 정지 - 건조 시약의 사용

이 방법은 높은 감도에 감염된 생쥐들의 bronchioalveolar 세척 (BAL) 유체에서 H1N1의 탐지를위한 적외선 염료 기반 이미징 시스템의 사용을 설명합니다. 이 방법론은 96에서 수행할 수 있습니다 - 또는 판 384 자, 시험 물질 &lt;10 μl 볼륨이 필요하고 여러 병원체의 동시 상영을위한 잠재력을 가지고 있습니다.

인플루엔자 바이러스에 대한 높은 처리량 검출 방법

이 비디오는 인플루엔자 바이러스 A와 B를 정량화하기 위한 분석을 보여줍니다. 이 분석은 인플루엔자 특이적 프라이머를 사용한 니킹 엔도뉴클레아제 증폭과 분자 비콘 프로브를 사용한 표적 검출을 사용합니다.

인플루엔자 A 및 B 바이러스를 정량화하기 위한 분자 기반 분석

저자는 인플루엔자 A 바이러스를 탐지하고 격리하기 위해 돼지 비강 물티슈를 수집하는 프로토콜을 제시합니다.

돼지에서 인플루엔자 바이러스 탐지 및 격리를위한 코 닦음

고위험 병원체는 공기 중 입자를 통해 피험자를 감염시킬 수 있기 때문에 공기 생물학은 병인 연구 및 의료 대책 개발에 점점 더 많이 적용되고 있습니다. 우리는 동물 생물 안전 레벨 4 최대 봉쇄 환경에서 비인간 영장류의 에어로졸 챌린지 중 항공 생물학 절차에 대한 자세한 시각적 시연을 제시합니다.

(A)의 안전주의 사항 및 운영 절차 BSL-4 실험실 3. 공중 생물학

여기서는 배큘로 바이러스 또는 포유류 발현 시스템, 및 초 원심 정제를 사용하여 바이러스 입자의 합성을위한 프로토콜을 제시한다. 이것은 매우 최적화 방법은 안전하고 유연하게 타겟으로 백신 바이러스 항원을 확인하는 데 사용된다.

표현과 예방 접종에 대한 바이러스 입자의 정제

우리는 분자 기반 인플루엔자 A, 신속하고 B 분석에 대해 설명합니다. 인플루엔자 분석은 분자 표지 프로브와 표적 탐지 뒤에 인플루엔자 특이 프라이머를 등온 증폭을 이용하여 15 분 이내에 각 대상을 감지합니다. 인플루엔자 A와 B의 분석은 사용자 친화적이고 수행 할 최소한의 실습 시간이 필요합니다.

빠른 분자 탐지 및 인플루엔자 바이러스 A와 B의 차별화

음이온 교환 수 지 기반 방법, 바이러스의 충돌-기반 bioaerosol 샘플링 시연 액체에 적응 합니다. 다운스트림 분자 탐지와 결합 하면 메서드 bioaerosols에서 바이러스의 손쉬운 및 민감한 감지.

Bioaerosols 음이온 교환 수 지를 사용 하 여 바이러스의 검출

신속 하 게 구축, 오프-그리드 실험실 설계 되었고 원격, 리소스 제한 전역 설정에 대 한 내장. 기능 및 물류 개선, 확장, 다기능 실험실 모듈의 중요 한 측면을 탐구 된다. 기본적인 실험실 작업에 대 한 점검 및 호흡기 바이러스 진단 테스트에 대 한 프로토콜 개발 이며 제시.

원격 실험실 관리: 호흡기 바이러스 진단

이 프로토콜은 IAV의 비강내 투여 및 마우스 폐 손상 및 폐 세포 유형에 대한 관련 전사 변화의 다운스트림 분석에 대한 지침을 제공합니다.

인플루엔자 감염 후 이형성 및 기능적 폐포 복구 모델링

학습하세요 조류 인플루엔자 바이러스 감시를 위한 FTA 카드 샘플링 방법을 배우세요. 야생 조류 분변에서 RNA를 추출하고 역전사 PCR로 바이러스를 식별하는 이 기술은 냉장 유지 없이 원격 지역에서 고처리량 분석을 가능하게 합니다.

조류 FTA 카드 인플루엔자 감시 : 필드 방법, Biosafety, 그리고 교통 문제 해결

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