세 Parkinsonian 쥐의 초음파 Vocalizations의 타겟 트레이닝

이 절차의 전반적인 목표는 쥐가 초음파 발성(ultrasonic vocalizations, USV)의 횟수와 복잡성을 늘리도록 훈련시키는 것입니다. 이는 먼저 기저 발성을 기록함으로써 수행됩니다. 다음 단계는 정적 강화를 통해 표적 발성을 훈련하는 것입니다.

훈련 후, 포스트 트레이닝 단계에서 발성(vocalization)을 기록합니다. 절차의 마지막 단계는 기초선(baseline) 발성과 훈련 후 발성의 음향 분석 및 비교입니다. 최종적으로, 이를 통해 결과를 얻을 수 있습니다.

이는 훈련이 대역폭, 피크 주파수, 지속 시간과 같은 음향 파라미터의 증가를 통해 초음파 발성(ultrasonic vocalizations)의 수와 복잡성을 증가시킨다는 것을 보여줍니다. 이 방법은 발성 운동이 기저의 신경 기전을 어떻게 조절하는지와 같이 의사소통 장애 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 방법은 파킨슨병 및 노화와 관련된 두개 sensory motor 결손에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

이 방법은 초음파 발성(ultrasonic vocalizations)을 행동 지표로 사용하는 다른 질환 모델 및 조건에도 적용할 수 있습니다. 발성 훈련 시연은 제 연구실의 구성원인 Emerald Dahl과 Jamie Shire가 진행하겠습니다. 초음파 모니터링을 시작하려면 Avis Soft Recorder 소프트웨어를 실행하고, 수동으로 녹음을 시작하고 중지할 수 있도록 트리거 설정을 'permanent unlimited'로 선택하십시오. 그다음, 기본 디렉토리에서 캡처된 오디오 파일이 저장될 위치를 지정하십시오.

가장 높은 발성 주파수를 포착하기 위해 샘플링 속도는 최소 200,000 hertz여야 합니다. 이러한 매개변수 설정이 완료되면, 수컷의 홈 케이지 덮개를 제거하고 마이크 바로 아래에 배치하십시오. 다음으로, Lordosis, 귀 씰룩임 및 빠른 돌진 행동을 통해 성적 수용성이 있는 암컷 쥐를 식별하십시오.

수용성 암컷 쥐를 대상 수컷 쥐의 홈 케이지에 넣습니다. 수컷이 코를 킁킁거리거나, 뒤쫓거나, 올라타는 등의 행동으로 암컷에게 관심을 보이면, 암컷을 제거하고 1~2분 동안 수컷의 발성음을 기록합니다. 실시간 스펙트로그램을 관찰하여 초음파 발성음을 시각적으로 모니터링합니다.

수컷이 발성하지 않는 경우, 즉시 암컷 쥐를 수컷의 홈 케이지에 잠시 넣어 발성을 유도하십시오. 먼저, 수컷 쥐 한 마리를 훈련실로 데려옵니다. 나머지 모든 수컷은 각자의 훈련 세션 전까지 인접한 방에 보관해야 합니다.

물을 보상으로 활용하기 쉽도록 사전에 쥐의 수분 섭취를 제한해야 합니다. 훈련 단계에서는 앞서 설명한 대로 Avis 소프트 레코더를 설정하십시오. 그다음, 마이크 아래에 홈 케이지를 배치합니다.

수컷이 자리를 잡으면, 수용성이 있는 암컷 쥐를 케이지에 넣습니다. 수컷이 암컷에게 관심을 보이면 암컷을 제거하고 대상 발성을 모니터링합니다. 초기에는 50 kHz 주파수 변조 호출음이 발생할 때마다 보상을 제공합니다.

펜을 클릭함과 동시에 물병이나 먹이를 짧게 보여주어 보상을 제공하십시오. 훈련이 진행됨에 따라, 5회 또는 10회의 울음소리가 빠르게 연속되는 경우와 같이 점차적으로 복잡해지는 일련의 울음소리 조합에 대해서만 강화를 실시하십시오. 총 30회의 강화가 이루어질 때까지 훈련을 계속하십시오.

기초선 및 훈련 후 녹음 파일을 분석하는 데 보통 5분에서 10분이 소요됩니다. 먼저, 원본 사운드 파일의 아카이브를 생성하고 작업용 복사본을 만들어 초음파 발성 이하의 소음 주파수를 제거하는 편집을 수행하십시오. AVI Soft SaaS Lab Pro의 일괄 처리 모드를 사용하여 사운드 파일에 25 kilohertz의 하이패스 필터를 적용하십시오.

SaaS Lab Pro의 자동 요소 검출 기능을 사용하기 위해 필요한 노이즈 임계값을 결정하려면, 사운드 파일을 열고 스펙트로그램을 생성하십시오. FFT 길이를 512로 설정하고 프레임 크기는 75%, 시간적 중첩(temporal overlap)은 93.75%로 설정하십시오. 스펙트로그램에서 지워진 노이즈가 파형에서도 제거될 수 있도록 파형 편집 기능을 활성화하십시오. 자동 파라미터 측정 설정을 여기와 같이 구성하십시오.

측정할 세 가지 파라미터는 요소의 지속 시간, 피크 주파수 및 피크 진폭입니다. 측정 위치에서는 최대 진폭 및 전체 요소의 최소 및 최대 파라미터를 활성화하는 섹션을 선택하십시오. 요소 분리 항목에서는 자동 단일 임계값을 선택하고 임계값을 표시하십시오.

스펙트로그램에서 호출음이나 소음이 없는 영역을 찾으십시오. 이것이 배경 소음입니다. 임계값을 배경 소음보다 약간 높은 수준으로 설정하십시오.

스펙트로그램 위의 전력 스펙트럼 창에서 검은색 선을 조정하여 이전 단계에서 설정한 임계값의 데시벨 수준을 여기서 확인할 수 있습니다. 거부 진폭 미만(rejective amplitude is less than) 값을 임계값보다 1dB 낮게 설정하십시오. 이제 이 두 값을 분석할 모든 사운드 파일에 적용해야 합니다.

모든 녹음 설정이 동일하다고 가정할 때, 발성(vocalization)을 레이블링하려면 앞서 설정한 자동 임계값과 이전에 보여준 동일한 설정을 사용하여 스펙트로그램을 생성하십시오. 다음 기준에 해당하는 노이즈를 수동으로 삭제하십시오. 첫째, 발성으로 잘못 식별된 노이즈. 둘째, 발성의 시작 또는 끝의 판별에 영향을 주는 노이즈. 셋째, 발성의 최고 또는 최저 주파수로 잘못 식별된 노이즈이며, 이는 각각 상단과 하단의 빨간색 선으로 표시됩니다.

어떤 경우에는 발성음이 이동 중의 베딩 소리와 같은 주변 소음과 분리되지 않을 수 있습니다. 이러한 외침은 정확하게 분석할 수 없으므로, 모든 발성음을 식별한 후 영구적으로 삭제해야 하며, 사운드 파일에서 스펙트로그램의 삭제된 섹션을 영구적으로 제거해야 합니다. 도구 드롭다운 메뉴에서 'remove, erase spectrogram sections from waveform'(파형에서 스펙트로그램 섹션 제거)을 선택하여 사운드 파일에 영구적인 레이블을 생성하십시오.

자동 파라미터 측정 설정 창을 열고, 화면의 안내와 음성 지시에 따라 요소 분리 섹션의 편집 버튼을 클릭하십시오. 각 레이블이 지정된 발성 내용을 검토하여 범주를 결정하고, 미리 정의된 텍스트 모듈을 사용하여 적절한 레이블을 할당하십시오. 분석에 사용되는 범주는 단순 주파수, 변조 및 고조파입니다.

스펙트로그램을 닫고 사운드 파일을 저장한 다음, 분석할 다음 사운드 파일로 진행하십시오. 모든 사운드 파일에서 발성(Vocalizations) 식별이 완료되면, 일괄 처리 도구를 사용하여 모든 파일의 음향 파라미터를 자동으로 측정하십시오. 일괄 처리 대화 상자의 드롭다운 메뉴에서 자동 파라미터 측정을 선택하십시오.

선택한 폴더의 모든 파일 처리 체크박스를 선택하십시오. 그런 다음 폴더 버튼을 클릭하고 음향 파일이 저장된 폴더를 선택하십시오. 시작을 클릭하면 마지막으로 사용한 설정에 따라 각 파일이 자동으로 분석됩니다.

자동 파라미터 측정 설정 대화 상자에서, 측정값은 DDE 파라미터 슬래시 로그 파일 설정 명령을 사용하여 정의할 수 있는 텍스트 파일에 저장됩니다. 이후 이 텍스트 파일을 통계 분석용 프로그램으로 가져올 수 있습니다. 이러한 그래프들은 세션당 발성 횟수와 분당 발성률이 6주의 훈련 기간 동안 모두 증가함을 보여줍니다.

우리가 사용하는 50 kilohertz 발성 세 가지 범주 각각의 대표적인 발성 파형이 왼쪽에서 오른쪽 순으로 제시되어 있습니다. 이는 단순 주파수, 변조 및 고조파 발성입니다. 이 예시에서는 동일한 쥐의 주파수 변조 발성이 파킨슨병 유도 전, 파킨슨병 유도 후, 그리고 발성 훈련 후에 각각 어떻게 나타나는지 보여줍니다.

패널 A의 기저선 발성(baseline vocalization)과 비교했을 때, 패널 B의 파킨슨병 상태(Parkinsonism condition)에서의 발성은 대역폭, 지속 시간 및 강도가 감소한 것을 보여줍니다. 패널 C에 표시된 훈련 후 발성은 발성 훈련 후 지속 시간, 강도, 대역폭 및 주파수 변조가 어떻게 기저선 수준으로 회복되는지를 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후에는 쥐의 초음파 발성을 훈련, 기록 및 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.