Zebrafish의 Pronephros의 레이저 절제는 신장 상피 조직이 재생된를 공부

본 절차의 전반적인 목표는 급성 신손상 이후의 신장 상피 재생을 연구하기 위해 제브라피쉬 배아 신장인 전신(pronephros) 내 신장 세포를 표적 라벨링하는 것입니다. 이는 먼저 제브라피쉬 배아에 덱스트란 형광 접합체(dextran fluorescent conjugate)를 미세 주입함으로써 수행됩니다. 하룻밤 동안의 배양 과정에서, 이 접합체들은 신세뇨관 근위세뇨관 세포에 의해 선택적으로 흡수됩니다.

다음 날, 에피 형광 현미경으로 세포를 관찰하고 펄스 레이저 시스템을 사용하여 선택한 세포를 제거합니다. 이후 조직학, 전체 마운팅 C two 하이브리드화 및 면역조직화학법을 사용하여 형태학적 및 분자적 변화를 평가합니다. 신독성 항생제인 gentamicin을 사용하여 급성 신손상을 유도하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 기존의 처리 방식은 치명적인 손상을 일으켜 치사율이 높기 때문에 시간에 따른 신장 재생 과정을 분석하는 것이 불가능하다는 점입니다.

이 방법은 상피 재생 중에 발생하는 분자 신호 전달 사건의 식별과 같이 신장 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 저희는 처음 페트리 접시 내에서 신장 상피 재생에 대한 상세한 분석법을 개발하고자 했을 때 이 기술에 대한 아이디어를 얻었습니다. 메틸렌 블루가 포함되지 않은 수정된 E3 용액에서 수정된 제브라피시 배아를 수집하십시오.

수정란을 28.5 °C에서 배양하여, 배아의 신장 시스템이 기능을 시작하는 수정 후 48에서 55시간 사이가 될 때까지 성장시킵니다. 주입을 시작하기 전, 배아를 고정할 수 있는 삼각형 홈이 있는 몰드를 사용하여 aros 주입 트리를 준비합니다. 다음으로, 표준 미세주입 바늘과 근위세뇨관을 표지하기 위한 주입 용액을 준비합니다. 배아를 준비함으로써 실험을 시작합니다.

먼저, 미세 핀셋을 사용하여 부화하지 않은 알에서 Corian을 제거합니다. 그런 다음 Corian 파편과 페트리 접시의 잔해를 헹구고, 접시에 30 milliliters의 수정된 E three 용액을 다시 채웁니다. 두 번째로, 5 milliliters의 trica를 사용하여 유충을 마취시킵니다.

접촉 반응을 확인하여 유충이 완전히 마취되었는지 확인하십시오. 완전히 마취되지 않은 경우, 주입 중에 유충이 경련을 일으킬 수 있습니다. 세 번째로, 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 유충을 몰드에 넣으십시오.

동물의 머리가 오목한 부분의 가장 깊은 곳에 위치하고 몸통이 웰의 측면을 따라 놓이도록 배치합니다. 이제 준비된 바늘에 2~3 µL의 dextran fluorescein을 채워 근육 내 미세 주사를 진행하며, 바늘의 위치를 잡고 각 동물의 몸통 부위에 약 1 nL의 용액을 주입합니다. dextran 접합체는 네프론 근위세관에 의해 쉽게 내세포작용(endocytosed)되어, 이 상피세포 집단을 선택적으로 표지할 수 있게 합니다.

체절의 상단 부위를 겨냥하고 난황낭 연장 부위를 피하십시오. 그렇지 않으면 이 부적절하게 주입된 동물 사례와 같이 네프론 세뇨관이 손상될 수 있습니다. 유충에 주입이 완료되면, 깨끗한 페트리 접시로 옮긴 후 신선한 E3 배지로 세 번 헹구어 트라이카(trica)의 모든 흔적을 제거하십시오. 이제 뚜껑을 알루미늄 호일로 덮고 28 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.

본 절차를 시작하기 전, 고정 매질(Im mobilization media)을 준비하여 일부는 실온에서 즉시 사용할 수 있도록 분주해 두고, 나머지는 장기 보관을 위해 4°C에 보관하십시오. 먼저 30 mL의 E3 용액에 5 mL의 trica를 섞어 제브라피쉬 치어를 마취시킵니다. 이전과 마찬가지로, 물고기가 촉각 자극에 반응하지 않는지 확인하십시오.

이제 형광 현미경으로 주입된 동물들을 관찰하여 근위세관이 쉽게 시각화된 유생을 선택합니다. fitzy 필터, 명시야 조명 및 레이저 성능이 갖춰진 복합 형광 현미경 하에서, 동일한 농도의 trica가 포함된 새 접시에 유생을 최대 12마리까지 옮깁니다. 절제술은 유생을 고정 매체가 들어 있는 접시로 옮겨 마취시키는 것으로 시작합니다.

2분 동안 기다린 후, 고정액 한 방울이 들어 있는 유리 오목 슬라이드로 유생을 옮깁니다. 미세 프로브를 사용하여 동물의 등 쪽이 위로 향하도록 조심스럽게 배치하고 등 쪽에 초점을 맞춥니다. 이제 보정된 펄스 마이크로 포인트 레이저 시스템을 사용하여, 대조군으로 남겨둘 다른 쪽은 그대로 둔 채 네프론 중 하나를 절제합니다.

신장 상피세포가 제거됨에 따라 형광이 퍼지는 것을 확인할 수 있습니다. 그런 다음 동물을 12-웰 플레이트의 웰로 조심스럽게 옮기고, E3 배지로 세 번 헹구어 메틸셀룰로오스를 씻어냅니다. 첫 번째 12-웰 플레이트가 다 찰 때까지 네프론 제거 과정을 계속합니다.

그런 다음 다른 12마리의 동물을 마취하고 동일한 과정을 반복합니다. 근위세뇨관을 선택적으로 표지하기 위해 Dextra Fitzy를 주입했습니다. 수정 후 3일째에 각 동물의 네프론을 레이저 절제했습니다.

절제 후 하루가 지난 모습입니다. 절제 후 4일째에는 재생이 뚜렷하지 않으나, in situ two의 세포 절제 후에는 재생이 일어났습니다. 단일 시점의 고정된 샘플 내 변화를 분석하기 위해 하이브리드화법을 사용하였습니다.

이 배아는 절제술을 거치지 않았습니다. 이와 대조적으로, 이 배아는 관상 상피의 넓은 구간을 절제하였으며, 이 배아는 관상 상피의 짧은 구간을 절제하였습니다. 이 과정 이후에는 nephron 재생 과정 중의 유전자 발현 변화 정체성과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 whole mount situ hybridization과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

화학 물질을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점을 잊지 마십시오. 본 실험 과정 중에는 실험복과 장갑과 같은 개인 보호 장비를 착용하는 등의 주의 사항을 준수할 것을 권장합니다.