외과 종양 표본의 Explants를 사용하여 소설 안티 - 암 의약품 개발을위한 방법

본 절차의 전반적인 목표는 종양 X 적출법(tumor X explan method)이라 명명된 뇌종양 수술 검체를 이용한 새로운 약물 효능 평가 방법을 확립하는 것입니다. 이를 위해 먼저 전임상 실험을 목적으로 악성 신경교종의 수술 중 갓 적출된 수술 검체를 확보합니다. 그 다음, 검체들을 조직 조달 핵심 시설(tissue procurement core facility)로 운송하여 임상 진단용과 연구용으로 분리합니다.

그 후 연구 실험실에서 종양 절편을 여러 개의 작은 조직으로 분할하여 최적화된 배지로 옮깁니다. 마지막으로 약물 후보 물질을 종양 내로 주입하고 절편을 16시간 동안 배양합니다. 최종적으로 헤마톡실린 및 에오신 염색과 세포 유형 특이적 마커를 이용한 면역조직화학 분석을 통해 치료 효능을 확인할 수 있는 결과를 얻을 수 있습니다.

유세포 분석 및 신경구 형성 분석을 통해 인비트로(in vitro)에서 약물 효능을 평가할 수도 있습니다. 현재 사용되는 대부분의 약물 효능 분석법은 현재의 전임상 실험 모델에서의 약물 효능과 실제 환자에서의 효능 사이에 간극이 존재합니다. 특히, 악성 교종과 같은 고형암에서 후보 약물을 테스트할 때, 세포 내 신호 전달뿐만 아니라 세포 간 신호 교환의 중요성을 간과해서는 안 됩니다.

고형암의 미세환경 파괴를 방지하기 위해, 연구진은 종양 적출물에 대한 배양 방법을 수립하였습니다. 환자로부터 종양을 제거한 후, 검체는 병리과로 이송되거나 병리과로부터 이송됩니다. 종양 덩어리를 두 조각으로 나눕니다. 한 조각의 종양 샘플은 임상 진단을 위한 동결 절편 제작 및 파라핀 임베딩에 사용하며, 나머지 종양 조직은 연구자가 사용할 수 있도록 연구실로 보내집니다.

이 방법을 통해 종양 인접 내피 세포 및 면역 세포뿐만 아니라, 종양을 둘러싸고 있거나 종양 공동으로 이동하는 정상 뇌세포를 포함한 종양의 미세환경을 보존할 수 있습니다. 교모세포종 조직을 처리하기 전, 액체, 배지 및 한천 용액을 준비합니다. 이를 1:1 비율로 혼합합니다.

그런 다음 6-웰 플레이트의 각 웰에 1 mL씩 넣습니다. 신선한 교모세포종 조직을 받으면 핀셋을 사용하여 페트리 접시에 옮기고, 수술용 칼과 핀셋을 이용해 5 mL의 ice cold 1x PBS로 세 번 조심스럽게 세척합니다. 해부된 샘플에서 직경 약 10 mm의 연속 절편을 잘라 종양 블록을 만들고, 각 블록을 한천 배지가 들어 있는 6-웰 플레이트의 각 웰로 옮기되, 조직의 생존력을 유지하기 위해 공기에 충분히 노출되도록 합니다.

다음으로, 1 mL 인슐린 주사기와 28 gauge 1/2인치 바늘을 사용하여, 5% DMSO 또는 2.5 nM temozolomide 또는 새로운 항암제 후보 물질을 종양 블록에 3회 주입하고, 5% CO₂가 포함된 습윤 공기 속 37 °C에서 16시간 동안 배양합니다. 배양 후, 1× PBS 5 mL로 블록을 3회 세척합니다. 그런 다음 50 mL 튜브에 블록을 넣고 10% v/v 4% 포르말린 10 mL로 24시간 동안 고정합니다.

조직을 파라핀에 매립하고 4 µm 두께로 절편을 만든 후, 탈파라핀화 및 재수화 과정을 거칩니다. 슬라이드를 랙에 넣고 다음의 용액들에서 배양합니다. 실렌(Xylene)에서 5분씩 3회 처리합니다.

100% ethanol로 5분씩 3회 세척합니다. 95% ethanol로 5분간 1회, 70% ethanol로 5분간 1회 세척합니다. 마지막으로 흐르는 수돗물로 3분 동안 헹굽니다.

항원 회복 및 내부 과산화물 억제에 대한 자세한 내용은 첨부된 서면 프로토콜을 참조하십시오. 섹션을 블로킹하기 위해 조직을 10% normal goat serum으로 덮고, 슬라이드를 습윤 박스로 옮겨 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 슬라이드를 1배 PBS에서 5분씩 3회 세척합니다.

다음으로, 1배 PBS로 희석한 human specific caspase three 또는 KI 67과 같은 1차 항체를 첨가한 후 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 슬라이드를 1배 PBS로 10분씩 3회 세척합니다. 그다음, 조직 위에 HRP 표지 2차 항체를 2~3방울 떨어뜨려 덮어줍니다.

슬라이드를 습윤 상자에 넣고 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 1x PBS로 5분씩 3회 세척합니다. 제조사의 지침에 따라 chromogen DAB 키트를 사용하여 샘플을 발색시키고 대조 염색을 수행합니다.

슬라이드를 헤마틴(hematin)에 10~15초 동안 담급니다. 그런 다음 흐르는 수돗물로 3분 동안 헹굽니다. 마운팅 시약과 커버슬립을 사용하여 슬라이드를 다음 용액들에 차례로 담가 시료를 탈수시킵니다.

그 다음 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 촬영합니다. 이 그림의 가돌리늄 조영 증강 T1 강조 MRI 영상은 수술 전 환자의 우측 전두엽에 있는 조영 증강된 교모세포종(glioblastoma multiform 또는 GBM) 종양을 보여줍니다. 수술 후 영상에서는 병변의 아전절제(subtotal removal)가 확인되었습니다.

헤마톡실린 및 에오신 염색 결과, 괴사, 가성 책상 배열 세포(pseudo palisade cells) 및 미세혈관 증식이 관찰되었습니다. 따라서 이러한 종양 설명편(explan) 샘플을 신뢰성 있게 활용할 수 있는지 조사하기 위해, 해당 종양들을 조직병리학적으로 GBM으로 진단하였습니다. 약물 효능 시험을 위해 테모졸로마이드(temozolomide 또는 TMZ) 약물의 효과를 테스트하였으며, TMZ 처리된 GBM 조직의 면역조직화학 염색 결과, 대조군 샘플에 비해 KI 67 양성 종양 세포가 실질적으로 감소한 것이 확인되었습니다.

이어서, 세포 사멸 마커인 caspase three를 이용한 면역조직화학 분석 결과, TMZ 처리된 신경교종 표본과 대조군 샘플 사이에 유의미한 차이가 나타나지 않았습니다. 테모졸로마이드의 치료 효과는 이 ex explan 분석법을 인비트로(in vitro) 배양 또는 유세포 분석과 결합하여 더욱 자세히 규명할 수 있습니다. 우리는 새로운 항암제 스크리닝을 위해 이 ex explan 방법과 제노그라프트(xenograft) 이식 및 인비트로(in vitro) 구체 형성 분석법을 비교할 수 있습니다.

실험실에서 종양 조직을 확보한 후, 본 실험 절차는 1시간 이내에 완료될 수 있습니다. 이 새로운 분석법은 처리된 종양 이식편을 해리시킨 후 상대적으로 수행하기 쉽고 재현성이 높습니다. 또한, 이를 인비트로(in vitro) 실험과 결합하여 활용할 수 있습니다.

이 분석법의 주요 장점은 종양 미세환경을 보존한다는 점입니다. 우리는 Temodar로 처리된 종양 절편에서 양성 데이터를 얻었으며, 이는 수술 후 Temodar 치료를 받은 동일 환자들의 결과와 일치했습니다. 마지막으로, 이 방법은 다른 고형암에도 적용 가능하므로 고형암 치료를 위한 새로운 화학요법제의 발굴을 가속화할 가능성이 있습니다.