개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

이득 또는 기능 연구의 손실 중 하나를 수행하기위한 목적으로 murine 망막 세포에 플라스미드 DNA의 결합을위한 방법

이 절차의 전반적인 목표는 유전 물질을 망막 세포에 안정적으로 도입하기 위해 신생아 마우스에서 생체 내 전기천공법 실험을 수행하는 것입니다. 이것은 먼저 마취를 통해 신생아 쥐를 약 5분에서 10분 동안 얼음 위에서 팝함으로써 이루어집니다. 절차의 두 번째 단계는 융합된 눈꺼풀의 접합부를 확인하고 이 접합부를 따라 절단하여 눈을 뜨는 것입니다.

그런 다음 마이크로 주입 주사기의 삽입을 용이하게 하기 위해 눈을 절개합니다. 그런 다음 절개 부위를 통해 마이크로 주사기를 삽입하고 DNA 용액을 망막하 공간에 주입합니다. 마지막으로, 핀셋 전극을 팝의 헤드에 놓고 일련의 전기 펄스를 전달합니다.

레트로바이러스 형질도입과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 in vivo electroporation이 유전자 전달을 위한 도구로서 생물학적 제제의 생성 및 취급을 필요로 하지 않는다는 것입니다. 그 결과, 이 기술은 노동력과 시약이 덜 필요하며 동물 절차에 대해 승인된 모든 워크스테이션에서 수행할 수 있습니다. 일반적으로 이 기술을 처음 접하는 개인은 마이크로 주입 주사기를 망막하 공간에 배치하는 느낌을 개발하는 데 시간과 반복이 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Jimmy DeMilo입니다. 전기천공에 필요한 DNA 농도가 상대적으로 높기 때문에 원하는 플라스미드 DNA를 먼저 증폭하여 maxi prep을 사용하여 추출한 무능 세포를 증폭한 다음 정제하고 마이크로리터당 약 5마이크로그램으로 농축합니다. 빠른 녹색 FCF 염료는 주입 추적자로 추가됩니다.

플라스미드 DNA가 준비되면 갓 태어난 새끼 쥐를 얼음 위에서 약 5분 동안 마취하고 발바닥 압박으로 의식을 잃을 때까지 모니터링합니다. 70% isop 프로필 알코올을 주입할 눈 부위를 교체하고 해부 현미경을 사용하여 눈꺼풀이 함께 모이는 FUS 접합 상피를 확인합니다. 날카로운 30게이지 바늘을 사용하여 과도한 하향 압력을 가하거나 눈꺼풀 범위를 벗어나지 않도록 융합된 접합 상피를 따라 절단하여 조심스럽게 눈을 뜹니다.

눈꺼풀을 열고 눈이 노출되면 바늘 끝을 사용하여 각막과 접합부 근처의 공막을 작게 절개하되 너무 깊숙이 침투하여 수정체에 구멍을 뚫지 않도록 주의합니다. 끝이 뭉툭한 주사 바늘을 절개 부위에 삽입합니다. 반대쪽 공막 벽의 저항이 느껴질 때까지 0.3마이크로리터의 점성 DNA 용액을 망막하 공간에 천천히 주입합니다.

공막 벽을 너무 세게 누르지 않도록 주의하면서 동물을 회전시켜 망막 내에 DNA 용액이 고르게 퍼져 있는지 확인합니다. 먼저 핀셋 전극을 PBS에 담궈 전기 전도도를 최대화합니다. 그런 다음 주입된 눈이 양극 전극에 인접하고 주입되지 않은 눈이 음극 전극에 인접하도록 전극 사이에 주입된 강아지의 머리를 놓습니다.

펄스 발생기를 사용하여 각 펄스의 지속 시간이 80볼트이고 지속 시간이 50밀리초이며 펄스 간 간격이 950밀리초인 5개의 사각형 펄스를 적용합니다. 마지막으로 얼음 마취에서 회복될 때까지 따뜻한 램프 아래에서 강아지를 따뜻하게 합니다. 회복되면 전기천공된 새끼를 출생 후 3일차에 어미에게 돌려줍니다.

EGFP 전기천공된 세포의 대다수는 망막 신경가소성층에 위치하며 망막의 분화된 신경교세포의 뚜렷한 형태학적 특성을 나타내지 않습니다. 출생 후 14일째가 되면 전기천공된 세포가 망막의 바깥쪽 핵층과 내부 핵층, 그리고 다양한 표지된 세포에서 발견될 수 있습니다. 이제 분화된 뉴런의 특징적인 형태학적 특징을 나타냅니다.

이 절차를 시도하는 동안 모든 단계를 원활하고 균일하게 수행하는 것이 중요합니다. 미세 주입 중에 망막이 손상되는 것은 매우 쉬우며 조직 손상을 방지하는 데 필요한 수동 손재주를 개발하는 데 필요한 연습이 필요합니다. 이 절차를 따릅니다.

면역조직화학(immunohistochemistry) 또는 제자리 혼성화(in situ hybridization)와 같은 다른 방법은 관심 유전자의 발현이 전기 망막에서 상향 또는 하향 조절되는지 여부를 결정하기 위해 수행될 수 있습니다.