Name: 상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-25T12:03:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans 초기 배아 발생에서 형광 단백질을 이용한 시간 경과 현미경 기법을. 이 방법은 DNA와 소포체 역학을 실시간으로 관찰하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는 국립 보건원 (R15 LB에 GM065444 - 03)과 건강 (NIH)과 당뇨병과 소화기 및 신장 질환 국립 연구소 (KO)의 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에서 자금을 인정하고 싶습니다. NSF 수상 (DBI - 0923402)는 LSM700 공촛점 현미경의 인수를 투자. 우리는 또한 일반적인 지원과 박사 앤디 황금의 원고에 대한 유용한 의견을 인정하고 싶습니다. 신용 공유 자원, 프로토콜 및 아이디어에 대한 전체 C. 엘레간스 커뮤니티로 이동합니다.

1. 선충류 문화 <ol><li> 해당 C.를 구합니다 엘레간스는 Caenorhabditis 유전학 증권 센터 (CGC) 또는 동료로부터 변형. </li><li> OP50 박테리아 론 (3) 씨앗 NGM 한천 플레이트에 nematodes 성장. 25 GFP 종자 성​​장의 분석 ° C 권장합니다. </li><li> 당신의 현미경 실험 전날는 씨앗을 품고 접시에 최소한 40 L4 유충을 선택하고 ° C 야간 25 접시를 놓습니다. 이 벌레는 실험을 위해 젊은 성인 것입니다. </li></ol> 2. 주사 이 같은 lysosomes이나 mitochondria와 같은 구조를 볼 수 바람직 경우, 성인 시각화하기 전에 형광 색소를 주입 수 있습니다. <ol><li> 마른 아가로 오스 사출 패드를 준비합니다. (이것은 사전에 많은 일을 할 수 있습니다) <ol><li> 물에 녹은 2% 아가로 오스를 준비합니다. 파스퇴르 피펫으로 22X54 mm의 coverglass에 2 방울을 넣어. 드롭 위에 교차 현명한 다른 coverglass를 놓습니다. 패드의 직경이 약 1.5 cm 때까지 적절한 두께를 달성하기 위해 상단 coverglass에서 누르십시오. 50~10분 위해 앉아 보자. </li><li> 최고 coverglass를 제거합니다. 1 시간 동안 80 ° C 오븐에 넣어하여 아가로 오스 패드를 탈수 또는 특급 benchtop 앉을 수 있습니다. </li></ol></li><li> Mitotracker 또는 Lysotracker 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 에그 버퍼에 형광 에이전트를 희석. 우리는 일반적으로 Mitotracker 또는 Lysotracker의 1시 10분 희석을 사용합니다. </li><li> 주사 바늘은 1.2 OD의 유리 모세관에서 이루어집니다. 바늘 풀러를 사용하여 주사 바늘을 당기세요. </li><li> 다시 희석 염료로 바늘을 채우기 위해 뽑아 Pastuer의 pipet을 사용합니다. </li><li> 사용까지 가벼운 무료, humidified 챔버에 넣어 바늘. </li></ol></li><li> 사전 사출 : 현미경과 주사 바늘을 설정합니다. <ol><li> 분사 장치에 마운트 주입 바늘. 우리기구는 DIC 이미징 기능을 갖춘 니콘 TE200 거꾸로 현미경의 무대에 탑재 Narishige 직접 드라이브 micromanipulator입니다. </li><li> 압력 조절기에 연결된 1.2 mm ID를 튜브에 바늘을 연결합니다. 압축 공기 또는 질소 중은 외부 압력 소스로 사용할 수 있습니다. 레귤레이터 20-25 PSI로 설정합니다. </li><li> 사출 패드에 무거운 광유 (Parafin 기름) 대신 2 방울. </li><li> 현미경에 사출 패드를 놓고 기름에 바늘을 낮추십시오. 압력이 적용되었을 때 바늘에서 자유롭게 있는지 유체 흐름을 확인합니다. 사출 압력을 적용하고 액체가 바늘 밖으로 흐르는지를 관찰합니다. 그렇지 않다면, 당신은 부드럽게 바늘의 끝을 휴식이 필요합니다. 주사 바늘을 부드럽게 사출 패드에 위치 깨진 coverglass의 작은 조금에 팁을 운전하여 고장 수 있습니다. 바늘이 흐르는되면 다음 단계로 이동하십시오. </li></ol></li><li> 사출. <ol><li> 이전보기 배아로 약 1 시간, 사출 패드에 오일 드롭으로 젊은 성인 벌레를 전송할 수 있습니다. 해부 현미경을 사용하여 전송을 수행합니다. 전송 벌레에 대한 뾰족한 팁있는 플래티넘 와이어 웜 선택을 사용합니다. </li><li> 그들은 패드에 직접 누워 수 있도록 10 웜 - 3 정렬. 사출 들어, 그것은 쉬운되는 웜은 서로 평행 줄지어하고 좀 덜 이상의 웜 길이 떨어져.중인 경우 벌레가 사출 패드에있는되면 신속하게 작업하고 웜은 탈수에서 멸망하기 전에 분사 과정을 완료하는 것이 중요합니다. </li><li> 사출 현미경의 현미경 단계에 벌레로 coverglass를 놓습니다. 말초 생식선 튜브의 중앙 부분 (rachis)에 중점을두고 있습니다. 그런 다음 동일한 초점 비행기로 바늘의 팁을 이동 micromanipulator를 사용합니다. 수평 그래서 벌레가 바늘로 구멍되는 단계로 이동합니다. 바늘 끝이 rachis 내부되면, 압력을 적용하고 생식선이 염료 혼합물로 작성하실 수 있습니다. 사출 패드에있는 모든 벌레의 생식선 무기를 모두 주사. </li><li> 주사 후, 벌레에 계란 버퍼의 0.5 ML를 제공하기 위해 가져온 파스퇴르 pipet을 사용합니다. 이것은 탈수의 죽음에서 그들을 유지하고 그들 사출 절차에서 복구하실 수 있습니다. </li><li> 벌레가 빛을 무료 humidified 챔버에서 실온에서 1~2시간에 대한 복구를 허용합니다. </li></ol></li></ol> 3. 배아를 볼 아가로 오스 패드 <ol><li> 에그 버퍼에서 용융 2% 아가로 오스를 준비합니다. </li><li> 파스퇴르 pipet으로 깨끗한 현미경 슬라이드에 용융 아가로 오스 3 방울을 넣어. </li><li> 그들을 취재 테이프를 라벨링 한 계층을 두 가지 다른 슬라이드 사이에 슬라이드. 다음은 아가로 오스의 패드가 올바른 두께 있는지 확인합니다 스페이서 역할을합니다. </li><li> 수직 아래로 아가로 오스 방울에 두 번째 깨끗한 현미경 슬라이드를 놓습니다. 상단 슬라이드 가이드 슬라이드에서 테이프에 달려 때까지 누르십시오. </li><li> 이 관찰을 위해 배아를 탑재 준비 직전에, 상단 슬라이드를 제거합니다. </li></ol><ol><li> 벌레가 주입되지 않은 경우, 다음 두 단계를 수행하십시오. 그렇지 않으면 그들을 건너 뛰십시오. <ol><li> 전날 준비했던 접시에서 젊은 성인 웜을 선택합니다. 당신은 젊은 성인 안에 배아를 볼 수 있어야합니다. </li><li> unseeded NGM 플레이트에 50-20 벌레를 선택하십시오. 벌레들에게 붙어있는 박테리아의 대부분을 잃게 될 수 있도록 벌레가 몇 분 동안 unseeded 접시 주위에 크롤 링을 허용합니다. </li></ol></li><li> 어른 벌레의 젊은 배아를 얻습니다 <ol><li> 18mm 2 글라스 coverglass (1.5 coverglass 두께가 바람직합니다)의 중간에 에그 버퍼의 5-20 μl 드롭 놓습니다. </li><li> 에그 버퍼의 드롭에 unseeded 판이나 사출 패드에서 벌레를 이동합니다. </li><li> 26 게이지 바늘로 피하 오픈 웜 컷. 외음부 근처의 벌레를 엽니다 컷. 이 배아는 웜의 흐르다가 나타납니다. </li></ol></li><li> 현미경 슬라이드에 마운트 <ol><li> 아가로 오스 패드와 함께 준비하고 태아와 coverglass에 그것을 낮은 현미경 슬라이드 반전. </li><li> 오랜 시간의 경과가 필요한 경우, dessication을 방지하기 위해 coverglass의 가장자리를 밀봉하기 위해 석유 젤리를 사용합니다. </li></ol></li></ol> 5. 현미경 사용법 <ol><li> 해당 배아 찾기. <ol><li> 현미경 단계에 플레이스 슬라이드. 배아를 찾을 10X 렌즈와 스캔. </li><li> 초기 단계의 배아를 찾으려면, 산모 감수 분열을 작성하는 과정에있는 배아를 검색합니다. 그들이 단축 공사를하지 않았기 때문에 Meiotic 배아는 나중에 태아에서 구별하실 수 있습니다. (배아는 세포의 감수 분열을 마친 후 앞쪽에 끝에있는 세포막과 알 껍질 사이에 큰 차이를 볼 수 있습니다.) </li><li> 일단 확인이 적절하게 embryogenesis의 기록에 대한 높은 배율 렌즈 이동, 배아를 개최. </li></ol></li><li> 이미징 <ol><li> 이 예제에서, 우리는 mCherry을 표현 배아를 상상하고 있습니다 : H2B 및 GFP : UB 태그 단백질. 우리는 자이스 혈구 LSM700 기존의 레이저 스캐닝 현미경을 사용하고 있습니다. </li><li> 이미지는 63X 1.4NA 렌즈를 사용하여 수집하고 있습니다. 488과 555 레이저는 최소한의 레이저 전원과 최대 이득과 함께 사용됩니다. AZ 스택은 모든 10-15초를 수집합니다. photobleaching의 범위에 따라 30-60 시간 포인트를 수집하고 있습니다. Z 스택 이미지는 최종 시간 경과 영상에 대한 최대 투사 이미지로 붕괴됩니다. </li></ol></li></ol> 6. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. C. 최초 유사 분열을 수정 엘레간스. <img src="/files/ftp_upload/2852/2852fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. Microinjection 절차. 보충 비디오 1 GFP의 시간 저속 비디오 :.. meiotic 배아에서 ubiquitin 플러스 Lysotracker 블루 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2852/2852fig3.avi">비디오를 보려면 여기를 누르십시오.</a>

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

정자와 융합 후, 접합자는 동적 이벤트의 시리즈를 겪습. 이러한 이벤트는 급속히 발전 배아에 상대적으로 정적 세포에서 oocyte를 변환. 많은 생물에서 세포질 rearrangements는 배아 극성을 수립 및 계란 활성화를 위해 중요하다. C. 엘레간스의 배아는 난자의 ​​활성화 및 embryogenesis 이러한 초기 이벤트를 관찰 수있는 훌륭한 기회를 제공합니다. 수정 후 비교적 빠른 속도로 난자는 투명하고 초기 개발 이벤트가 발생합니다. C.가 엘레간스 연구팀은 찬란 초기 개발에 참여 표시된 단백질을 표현하는 많은 유용한 유전자 변형 종자를 생성합니다. RNAi 또는 돌연변이와 함께 이러한 변종을 사용하면 다세포 유기​​체의 개발 (5, 6, 7, 8) 기초 분자 경로를 해부위한 강력한 시스템을 제공합니다. 이 동영상이 문서에서는 C. 일찍 embryogenesis 동안에 이벤트를 기록하기 위해 이러한 도구와 기술을 사용하는 실용적인 접근 방식을 제시 엘레간스. 성숙 C. 엘레간스의 oocyte는 감수 분열 I의 prophase에서 체포되고 성인 남녀 추니의 spermatheca에 수정된 것입니다. 수정 후, oocyte는 감수 분열 I 및 II의 나머지 단계를 진행. 이러한 단계는 찬란 분류 히스톤 H2B (5)를 사용하여 볼 수 있습니다. 산모 감수 분열이 완료하는 동안 정자의 DNA는 (그림 1 참조) 응축 남아 있습니다. 감수 분열의 완성 후, 모자 아버지 DNA는 decondensed와 두 pronuclei 양식이됩니다. 산모 pronucleus은 그런 아버지 pronucleus 대한 마이 그 레이션 그리고 그들은 배아의 중앙 근처에 함께 참여합니다. 유사 분열 신속하게 pronuclear 회의 후 ensues. 이 모든 일들이 시간 안에 발생합니다. 따라서 이벤트의 순서의 시간 경과 현미경을 쉽게 수행할 수 있습니다. 이 기술을 수행하는 것은 공촛점 현미경에 대한 액세스 이외에 선충류의 culturing뿐만 아니라 기본적인 현미경 기술의 특정 시설이 필요합니다. 여기에 제시 예제는 유전자 변형 C.을 활용 : ubiquitin과 mCherry : : : H2B이 형광 단백질, GFP를 표현 엘레간스 변형. 공촛점 레이저 스캐닝 현미경은 두 단백질의 역동적인 현지화을 관찰하는 데 사용됩니다. 또한, 우리는 찬란 분류 Lysotracker의 주입은 수정 후 배아의 lysosomes의 운명을 수행하는 데 사용할 수있는 것을 보여줍니다. 라벨 추적 장치의 분사도 mitochondria 또는 지방 칼슘 농도 (9)의 시각화를 위해 수행할 수 있습니다. 이론적으로, 사출 프로토콜은 배아의 찬란 분류 분자의 모든 종류를 볼 사용할 수 있습니다. 이 표시된 작은 분자, 단백질, lipids 등 일부의 경우를 포함할 수 있습니다, 그것은 실제로 벌레가 쉽게 이해 등 mitotracker (10) 같은 염료를하므로 레이블 추적기를 주입 필요하지 않을 수 있습니다. 그러나, 우리는 몸으로 및 lysotracker의 주입을 모두 시도하고 배아의 시각화를 위해 사출과 함께 훨씬 더 나은 결과를 발견했다. 기술 고려 사항 : 이 절차가 나타 기술적 과제는 microinjection 기술뿐만 아니라 영상에 어려움을 아주 초기 배아를 포함합니다. microinjections에 대해서, 아가로 오스 분사 패드의 두께가 성공적으로 주사를 위해 중요합니다. 패드가 너무 두꺼운 경우 벌레가 dessicate 신속하게 죽을 것이다. 패드가 너무 얇은 경우에는 벌레가 사출 과정에서 패드에 집중하지 않습니다. 초기 배아는 온도와 버퍼 조건으로 환경 조건에 민감 수 있습니다. 와일드 타입 배아는 정자의 DNA와 세포의 감수 분열 II (4) 완성 분 정도 이내 pronuclear 이주 decondensation를 시작합니다. 20 분 내에, 첫번째 cytokinesis 시작한다. 배아가 매우 높은 레이저 강도에 노출되거나 과열되거나 설치 중에 깔린 경우,이 프로세스가 중단될 수 있습니다. 이러한 배아 개발을 체포합니다. 이 문제가 발생하면, 실험은 감소 레이저 전원 또는 두꺼운 아가로 오스 패드와 반복해야합니다. C. 엘레간스의 배아가 곧 수정이 끝날 때까지 자신의 알 껍질을 분비하지 않습니다. 수정 및 계란 껍질의 분비 사이의 짧은 시간 동안, 태아는 어머니 (11) 이외의 가능한되지 않습니다. 일부 실험실은. utero의 영상 배아 (5, 12)에 의해이 문제를 피할 수 있었을 utero에 이미지는 수정 중에 또는 이후에 발생하는 이벤트를 캡처하는 능력과 같은 특정 혜택을 제공합니다. 그러나,이 기술은 깊은 조직 이미징을 허용 현미경 시스템의 사용을 필요로합니다. 이러한 두 광자 또는 다중 광자와 같은 시스템은 특히이 (13, 14)에 적합합니다. 종래의 레이저가 - 스캔 또는 디스크 공촛점 현미경을 회전, 최고의 이미지는 배아에서 얻은 것을 헥타르를 사용할 때여기에 설명된하신 성인 웜 잘라되었습니다. 이미징 시스템 고려 사항 : 사용 공촛점 이미징 시스템의 유형은 사용자의 요구에 따라 달라집니다. 한 소원이 가능한 가장 높은 해상도의 이미지를 얻기위한 경우 일반적으로 레이저 스캔 시스템은 좋습니다. 이미지 수집가 비교적 신속하고 photobleaching / phototoxicity가 감소로 한편, 회전 디스크 시스템은 더 높은 동적 이미징 프로세스에 적합합니다. 특정 영상 매개 변수는 실험 설계 및 고용 공촛점 이미징 시스템에 따라 달라집니다. 다차원 영상에서, 하나는 수집 채널, 초점 비행기, 그리고 시간이 지점의 수를 고려해야합니다. photobleaching 및 phototoxicity의 제한 효과로 인해, 이미지의 유한 번호는 특정 실험에서 취득하실 수 있습니다. 당신이 취득하는 채널의 수를 늘리기 위해 선택하는 경우 따라서, 당신은 가능성이 초점 비행기 및 / 또는 시간 지점과 반대의 수를 줄이기 위해 필요합니다. 획득 수있는 이미지의 총수는 물론 사용중인 공촛점 현미경의 감도로 몇 군데되는 형광단의 강도에 의해 영향을받습니다. 더 강렬 fluorophores 더 민감한 악기 짧은 노출 시간을 필요로하기 때문에 적은 photobleaching 및 phototoxicity을 생산합니다. 다수 또는 이미징 시스템을 사용할 수 있습니다. 우리는 우리 자신의 실험실에서 사용되고있는 시스템에 대한 자세한 내용을 제공할 것입니다. 디스크 공촛점 현미경을 회전하여 영상 웜 배아 위해, 우리는 계획 APO 목표를 NA 60X/1.4 장착된 니콘 TE2000U 거꾸로 현미경을 사용합니다. 현미경은 요코 CSU10 회전 디스크 장치, 하마 마츠 C9100 - 13 EM CCD 카메라, 그리고 스펙트럼 적용 연구 LMM5 레이저 병합 모듈 405에서 출력없이 네 고체 레이저를 포함, 491, 561 및 655 nm의 연결되어 있습니다. 이 시스템을 사용 우리는 하나 또는 두 개의 채널 6-12 초점 비행기, 그리고 25-50 timepoints을 (30~60초 간격) 캡처할 수 있습니다. 전형적인 노출 시간 100 200 밀리초입니다. 레이저 공촛점 현미경을 스캔 이미징 배아 위해, 우리는 2 채널과 네 개의 고체 레이저 (405 488, 555 및 635 nm의)이 장착된 자이스 혈구 LSM700을 사용합니다. 이 제도는 배아 이미징에 사용되는 계획 - APO 63X/1.4NA의 목적으로 자이스 혈구 Axio 관측기 거꾸로 현미경에 첨부되어 있습니다. 또한이 시스템은 제한된 영상 처리 및 분석 서비스를 제공합니다 이미지 수집을위한 자이스 혈구 선종 소프트웨어를 사용합니다. 이 fluorochromes과 이미징, 우리가 일반적으로 1-5 초점 비행기를 (따로 ~ 0.5 μm의) 수집 및 Z 스택에게 15 초마다를 수집할 경우. 중요한 photobleaching가 발생되기 전에 컬렉션이 계속됩니다. 최종 시간 경과 비디오를 생성하려면, Z 스택 이미지는 선 소프트웨어의 최대 투영 도구를 사용하여 통합하고 있습니다. 동영상은 AVI 파일과 소프트웨어 수출하고 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 구성 </th></tr><tr><td> 에그 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 5mM Hepes의 산도 7.2, 110mM NaCl, 4mm짜리 KCl, 5mM MG 아세테이트, 5mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> Mitotracker </td><td> Invitrogen </td><td> M - 7512 </td><td></td></tr><tr><td> Lysotracker </td><td> Invitrogen </td><td> L - 7525 </td><td></td></tr><tr><td> 사출 모세관 Pipet </td><td> 하버드 장치, 켄트, 영국 </td><td> GC120F - 10 </td><td></td></tr><tr><td> 니들 풀러 </td><td> Kopf </td><td> 모델 700C </td><td></td></tr><tr><td> Microinjector 장치 </td><td> Tritech 연구 </td><td> MINJ - 1 microinjection 조절기 </td><td></td></tr></tbody></table>

상순 embryogenesis의 시간 경과 현미경 caenorhabditis 엘레간스

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis 엘레간스은 종종 초기 발달 과정 연구의 모델 시스템으로 사용되고 있습니다. 배아, 유전 자원, 그리고 변화의 상대적 용이성의 투명성 C. 만들 자질 아르 조기 embryogenesis을위한 훌륭한 모델을 엘레간스. 레이저 기반 공촛점 현미경과 찬란 라벨 태그는 연구자가 개발 배아의 특정 세포 구조와 단백질을 따르십시오 수 있습니다. 예를 들어, 하나는 찬란 표시된 염료를 사용하여 같은 lysosomes 또는 mitochondria 같은 특정 organelles을 따를 수 있습니다. 이러한 염료는 성인 생식선에 microinjection에 의해 초기 배아에 전달할 수 있습니다. 또한, 특정 단백질의 지방화는 형광 단백질의 태그를 사용하여 다음 수 있습니다. 예제는 여기에 형광 염료를 사용 lysosomal뿐만 아니라 찬란 태그 히스톤 및 ubiquitin 단백질을 입증 제공됩니다. 분류 히스톤는 DNA를 시각화하기 때문에 세포주기의 단계를 식별하는 데 사용됩니다. GFP - ubiquitin 태그는 초기 배아에서 ubiquitinated vesicles의 역학을 나타낸다. 라벨 lysosomes 및 GFP의 관찰 : ubiquitin는 ubiquitinated vesicles과 lysosomes 사이 colocalization가 있는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다. lysosomal 염료의 microinjection에 대한 기술이 제공됩니다. transgenenic 변종을 생성하기위한 기법 (1, 2) 다른 제공됩니다. 공촛점 현미경이나 회전 디스크 공촛점 현미경 표준 레이저에 시간 경과 현미경 다음 이미징 경우, 태아는 성인 남녀 추니의 nematodes 밖으로 절단되고 2퍼센트 아가로 오스 패드에 장착. 이 방법론은 일찍 embryogenesis의 높은 해상도 시각화를 위해 제공합니다.

이 문서는 선충류에 embryogenesis의 초기 이벤트의 시각화를위한 기술을 설명합니다<em&gt; Caenorhabditis 엘레간스</em&gt;.

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

*Caenorhabditis elegans*는 초기 발달 과정 연구에서 모델 시스템으로 자주 사용되어 왔습니다. 배아의 투명성과 유전적...

다음 실험의 전반적인 목표는 *C. elegans*의 초기 배아 발생 과정 중 세포 내 사건들을 기록하는 것입니다. 이는 DNA뿐만 아니라 소포의 일부 집합을 시각화할 수 있도록 여러 개의 형광 표지 단백질을 가진 형성 유전자 변형 계통을 사용하여 달성됩니다. 초기 배아에서, LysoTracker 또는 MitoTracker와 같은 형광 염료를 성체 벌레의 생식샘에 미세 주입하여 특정 소기관들을 표지합니다. 다음으로 성체 벌레에서 배아를 적출하고 공초점 현미경으로 관찰하여 소기관 내 표지된 단백질들의 움직임을 시계열로 기록합니다.궁극적으로, 이 프로토콜은 CL 알레르겐의 초기 발달 과정 동안 리소좀과 GFP 표지 소포의 흥미로운 이동을 보여줍니다. 제 이름은 Connie Hedger이며, 오늘은 University of Alabama in Huntsville의 Boyd 연구실에서 타임랩스 현미경 관찰을 수행하는 방법을 보여드리겠습니다. 이 실험을 위해, 실험 전날 25 °C에서 OP 50 박테리아 론이 도말된 NGM 한천 플레이트에서 선충을 배양하십시오. 최소 40마리의 L4 유충을 도말된 플레이트로 옮겨 25 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.이 벌레들은 청년기 성체여야 합니다. 실험을 위해, 과거 피펫을 사용하여 2% agros 수용액 두 방울을 두 개의 커버글라스 슬라이드 사이에 넣고 압력을 가해 agros를 지름 1.5 centimeter의 원형으로 만들어 주입 패드를 제작하십시오.상단 커버 슬립을 제거하고 패드를 80 °C 오븐에 1시간 동안 두어 탈수시키거나, 벤치탑 위에 하룻밤 동안 방치합니다. 주입 당일에 희석된 MIT tracker 또는 lyo tracker 염색액을 준비하고 1.2 od 유리 모세관으로 주입 바늘을 제작합니다. 바늘에 희석된 염색액을 역충전하여 채운 후 어두운 가습 챔버에 보관합니다. 주입 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 장착하고, 내경 1.2 mm 튜브를 사용하여 바늘을 압력 조절기에 연결합니다.이제 고밀도 미네랄 오일 두 방울을 주입 패드 위에 떨어뜨립니다. 주입 패드를 현미경 위에 올리고 바늘을 오일 속으로 내립니다. 주입 압력을 가하여 바늘에서 액체가 흘러나오는지 관찰합니다.그렇지 않은 경우, 인젝션 패드 위에 놓인 작은 커버 글라스 파편에 바늘 끝을 가볍게 밀어 넣어 바늘 끝을 살짝 깨뜨려야 합니다. 바늘을 통해 액체가 흐르는 것이 확인되면, 배아를 관찰하기 한 시간 전에 주입을 진행하십시오. 픽(pick)을 사용하여 성체 초기 단계의 벌레를 인젝션 패드 위의 오일 방울 속으로 옮깁니다.3~10마리의 벌레를 평행하게 배치하고, 벌레 몸길이의 1배보다 약간 덜 되는 간격을 둡니다. 벌레가 건조되기 전에 빠르게 주입하는 것이 중요합니다. 벌레가 놓인 패드를 현미경 스테이지 위로 옮깁니다.원위 생식샘의 중앙 부분에 초점을 맞춥니다. 그 다음 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘 끝을 동일한 초점 평면으로 이동시킵니다. 스테이지를 수평으로 이동시켜 벌레를 찌릅니다.바늘 끝이 큐스(cus) 내부에 위치했을 때, 압력을 가하여 생식샘을 염료 혼합물로 채웁니다. 주입되는 부피에 따라 생식샘이 팽창하게 됩니다. 계속해서 주입을 진행하십시오.주입 후 각 벌레의 양쪽 팔 부분을 가볍게 잡습니다. 0.5 milliliters의 egg buffer를 도포하여 벌레를 덮어줍니다. 그 다음, pulled pasture pipette을 사용하여 벌레를 빛이 차단된 가습 챔버 내의 상온에서 1~2시간 동안 회복시킵니다.먼저 파스텟 피펫을 사용하여 주입된 배아를 관찰하기 위한 새로운 agros 패드를 준비합니다. 녹은 agros 세 방울을 깨끗한 현미경 슬라이드 위에 떨어뜨리고, 해당 슬라이드를 라벨링 종이 한 겹으로 감싼 다른 두 개의 슬라이드 사이에 놓습니다. 테이프를 사용하여 패드의 두께를 조절합니다.다음으로, 깨끗한 현미경 슬라이드를 agros 방울 위로 내려 테이프 슬라이드 위에 놓이게 합니다. 배아를 마운트할 준비가 될 때까지 상단 슬라이드를 제거하지 마십시오. 이제 커버 글라스 중앙에 20 µL의 egg buffer를 떨어뜨리고 주입된 벌레들을 buffer로 옮깁니다. 해부 현미경 하에서 벌레의 vulva 근처를 절개합니다.26게이지 피하 주사 바늘을 사용하여 배아를 벌레 밖으로 배출시킵니다. 이제 이미징 슬라이드의 상단 슬라이드를 제거하고, 배아가 들어 있는 커버 글라스 위에 aros 패드를 뒤집어서 내립니다. 배아를 장기간 이미징해야 하는 경우, 건조를 방지하기 위해 커버 글라스의 가장자리를 바셀린으로 밀봉하십시오.이제 10배 대물렌즈를 사용하여 배아의 위치를 찾아 이미징을 시작하며, 모체 감수분열이 완료되는 과정에 있는 초기 단계의 배아를 찾으십시오. 감수분열 단계의 배아는 길이가 짧아지지 않았으므로 이후 단계의 배아와 구별할 수 있습니다. 감수분열이 완료되면 배아의 전단(anterior end)에서 세포막과 난각 사이에 상당한 간격이 생깁니다.적절한 발달 단계의 배아가 확인되면, 배아 발생 과정을 기록하기 위해 더 높은 배율의 렌즈로 전환하십시오. 이 배아는 M cherry histone two B와 GFP ubiquitin 태그 단백질을 모두 발현합니다. 모계 및 부계 DNA는 M cherry H two B를 통해 관찰 가능하며, 이를 통해 초기 발달 단계를 확인할 수 있습니다.이 배아에는 OC Tracker blue가 주입되었으며 GFP Ubiquitin이 발현됩니다. 이미지는 63 x 1.4 NA 렌즈와 최소 출력 및 최대 게인으로 설정된 4 88 및 5 55 레이저를 사용하여 수집되었습니다. 일반적으로 광탈색이 일어나기 전까지 최대 60개 타임포인트에 대해 10~15초 간격으로 Z-stack을 수집합니다.본 타임랩스 영상을 위해 Z-스택은 타임랩스 촬영 중에 최대 투영 이미지로 병합되었습니다. 현미경 관찰 시 배아는 감수 분열 2기가 완료된 후 몇 분 이내에 전핵 이동이 시작되어야 하며, 20분 이내에 첫 번째 세포질 분열이 시작되어야 합니다.배아의 발달 정지가 관찰되는 경우, 레이저 강도를 낮추거나 더 두꺼운 augurous pad pad를 사용해 보십시오.

time-lapse-microscopy-of-early-embryogenesis-in-caenorhabditis-elegans

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

에 산소 결핍 유도 일시 중지 된 애니메이션을 시각화하기 위해 시간 경과에 현미경을 사용<em&gt; C. elegans</em&gt; 태아

여기에서는 예쁜꼬마선충의 발달 과정을 추적하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 쉽게 구현할 수 있는 오픈 소스 도구를 기반으로 합니다. 3D 세포 모양 모델을 재구성하는 방법, 세포 내 구조를 수동으로 추적하는 방법, 피질 수축 흐름을 분석하는 방법을 보여줍니다.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

여기에서는 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장의 초기 및 후기 단계에서 발생하는 형태 생성 결함을 모니터링하기 위해 특별히 고안된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 궁극적으로, 이러한 프로토콜은 이러한 단계를 조절하는 유전자를 식별하고 배아의 전후 축을 따라 차등 요구 사항을 특성화하도록 설계되었습니다.

소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

이 문서에서는 사용자 지정 미세 장치를 채용 하는 개별 벌레의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다.

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이 프로토콜은 배아 후 발달 전반에 걸친 미세유체 기반 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 타임랩스 이미징을 설명합니다.

모든 유충 단계에서 이미징하는 고해상도 C. elegans

학습하세요 Caenorhabditis elegans 초기 배아 발생에서 형광 단백질을 이용한 시간 경과 현미경 기법을. 이 방법은 DNA와 소포체 역학을 실시간으로 관찰하여 발달생물학 연구에 활용됩니다.

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

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