Name: Bromodeoxyuridine (BrdU) 레이블과 녹아 유기 문화 독립적인 확인을위한 후속 형광 활성 세포 정렬 탄소 굴욕 Bacterioplankton (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: 배우세요 BrdU 레이블링과 FACS를 이용한 수중 환경에서 용존 유기탄소 분해 세균 동정 방법. 이 기술은 활성 세균을 분리하여 미생물 생태학 및 탄소 순환 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트의 자금은 국립 과학 재단 (National Science Foundation)을 부여 OCE1029607 (XM)을하고 MCB0702125 (MAM)을하고 고든과 베티 무어 재단 (MAM)을 제공한했습니다.

1. 워터 샘플 처리 <ol><li> 1 μm의 - 기공 크기의 멤브레인 필터를 통해 필터 10L 환경 물은 큰 입자와 bacteriovores을 제거합니다. 상자 속에 든 대형 유리병에 물을 여과물를 수집합니다. </li><li> 4 ML 신선한 paraformaldehyde 용액 (; 10% PFA)를 포함하는 3 멸균 Eppendorf 튜브 (50 ML)로 전송 36 ML 각 여과물. 세포를 보존하기 위해 상온에서 2 시간을위한 부화. 진공 여과에 의해 0.22 - μm의 - 기공 크기의 흰색 멤브레인 필터에 세포를 수집합니다. 진공 여과에 의한 필터를 통해 호수 (PBS)를 인산 버퍼 10 ML를 전달하여 필터를 씻으십시오. 부정적인 컨트롤로 필터를 라벨 및 -20 ° C.에 그들을 저장 </li></ol> 단계 1.3-1.4 DOC - 제한 조건을 설정을위한 옵션입니다. <ol start="3"><li> (5 μm의 NH 4 Club 호텔, 5 μm의 나노 3, 1μM 아니 2 PO 4 최종 농도) 상자 속에 든 대형 유리병에 무기 질소와 인의 혼합물을 추가합니다. </li><li> 가끔 agitations 48 시간 동안 현장의 온도에서 어둠 속에 품어. </li></ol> 2. 소우주 설립과 부화 <ol><li> microcosms을 설정하는 단계 1.4의 상자 속에 든 대형 유리병에서 800 ML 물 샘플 여섯 1 - L 유리 flasks 각각 입력합니다. 각각의 소우주로 BrdU (10 μm의 최종 농도)을 추가합니다. 잘 섞는다. </li><li> microcosms 세에 한 ML 모델 DOC 화합물 솔루션을 추가, 이들은 DOC의 개정안이 될 것입니다. 세 남아 microcosms로 한 ML 멸균 PBS를 추가, 이들은 노 또한 컨트롤 역할을합니다. </li><li> 보육 흔드는 모든 microcosms을 품어 100 rpm으로 흔들어하면서 현장의 온도에서 어둠 속에 품어. </li><li> 시간 0 점, 8, 16, 24 시간 50 ML 살균 Eppendorf 튜브에 각각의 축소판 및 전송에서 물 샘플 36 ML를 수집합니다. 즉시 수집 튜브에 신선한 PFA 4 ML (10 %)를 추가하고 세포를 보존하기 위해 상온에서 2 시간에 대해 숙고하다. </li><li> 필터는 0.22 - μm의 - 기공 크기의 폴리 카보 네이트 막 필터를 통해 세포를 보존. 10 ML PBS로 필터를 씻으십시오. 다음 단계로 바로 진행 또는 -20 ° C.에 필터를 저장 </li></ol> 3. BrdU의 설립에 대한해라 면역에 <ol><li> 상온에서 필터 (DOC 개정 샘플, 노 또한 컨트롤과 부정적인 컨트롤) 해동. </li><li> 라이 소 자임 솔루션 1 ML을 적용합니다 [10 100 MM 트리스, 50 NM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 MG / ML 라이 소 자임 흰자위 (산도 = 8)] 필터에 박테리아 세포를 충당하기 위해 4. 30 분 실온에서 알을 품다. 흡입에 따라 그것을 통해 10 ML PBS를 전달하여 필터를 씻으십시오. </li><li> proteinase K 용액 1 ML 추가 [2 100 MM 트리스, 50 NM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 MG / ML proteinase K (산도 = 8)] 필터에 박테리아 세포를 충당하기 위해 4. 30 분 실온에서 알을 품다. 흡입에 따라 그것을 통해 10 ML PBS를 전달하여 필터를 씻으십시오. </li><li> 1 ML의 exonuclease 솔루션 [exonuclease III (50 U / ML) 5 MM의 MgCl 2, 50 MM 트리스 - HCL] 5 필터에 박테리아 세포를 표지에 추가합니다. 37 품어 ° C를 30 분. 흡입에 따라 그것을 통해 10 ML PBS를 전달하여 필터를 씻으십시오. </li><li> 제조 업체의 지시에 따라 프레임 씰 배양 챔버 (생물 래드)를 조립. </li><li> 알코올 세척 건조 표면에 살균 블레이드를 사용하여 eighths에 필터를 슬라이스. </li><li> 포셉를 사용하여 하나의 조립 프레임 씰 배양 챔버 (8 프레임 인감 챔버 스가 각 필터 샘플이 필요합니다)에 필터의 여덟째 섹션을 놓으십시오. 세포를 포함하는 필터 부분의 측면 위쪽 얼굴 것입니다. 필터의 뒷면에있는 수분은 슬라이드 필터 막대기를하실 수 있습니다. 필터가 건조되면, 슬라이드에있는 필터 섹션을 배치하기 전에 챔버의 중앙에 diH 2 O의 작은 방울 (2 μl)를 적용할 수 있습니다. </li></ol> 단계 3.8-3.20는 제조 업체의 지침에서 변경 절차에 따라 현장 세포 증식 키트에서 호슈에서 시약을 FLUOS 사용합니다. PBS를 제외하고, 모든 시약은 키트 안에 제공됩니다. <ol start="8"><li> 균일하게 도장이 적용되면 오버플로가 발생하지 않고 배양 챔버의 전체 필터 부분을 커버하기에 충분한 배양 버퍼 (0.5 % 소 혈청 횐자위, PBS에 0.​​1 % Tween20) 적용됩니다. </li><li> 배양 챔버 프레임을 통해 폴리 에스테르 프레임 커버를 놓습니다. 단단히 배양 챔버를 밀봉 아래로 누르십시오. 필터 위에 기포를 사용하지 마십시오. 어둠 속에서 실온에서 10 분에 대한 봉쇄 실 품어. </li><li> 폴리 에스테르 도장을 제거하고 배양 챔버 스를 엽니다. (참고 : 챔버를 열고 때로는 슬라이드에서 프레임 인감 끌어 올려서 그 경우에는 다음 단계에 대한 새로운 챔버를 준비..) </li><li> 챔버 한 구석에서 부화 버퍼 아웃 Pipet. 필터와 접촉을 피하십시오. </li><li> 부드럽게 100 μl PBS를 pipetting하여 필터를 세척하고챔버에서 밖으로 3 회. </li><li> 바로 사용하기 전에 제조 업체에서 권장하는 단계를 다음과 같은 안티 - BrdU - FLUOS 작업 솔루션을 준비합니다. </li><li> Pipet 120 μl 방지 BrdU - FLUOS, 필터에 솔루션을 작업을 균일하게하여 전체 표면을 커버주의한다. </li><li> 새로운 폴리 에스테르 커버와 챔버를 봉인. 필터 위에 공기 방울을 피하십시오. 37 어둠의 챔버를 품어 ° C를 3 시간 동안. 이 단계는 플루오레신 isothiocyanate (FITC)와 현장에서 BrdU 통합의 DNA 라벨을 것입니다. </li><li> 폴리 에스테르 커버를 제거하고 배양 챔버를 엽니다. 안티 BrdU - FLUOS 작업 솔루션을 밖으로 Pipet. PBS와 필터 3 번 씻으십시오. </li><li> 배양 챔버에서 멸균 표면에 필터를 전송합니다. 멸균 블레이드를 사용하여 작은 조각으로 필터 섹션을 얇게. </li><li> 2 ML microcentrifuge 튜브, 1 ML PBS를 포함하는 각에 필터 조각을 전송합니다. 단단히 parafilm으로 튜브와 인감을 모자. 37 품어 ° C와 10 분, 200 RPM. </li><li> 5 분 최대 속도 vortexer과 소용돌이로 튜브를 고정합니다. 멸균 15 ML Eppendorf 튜브에 Pipet 뜨는합니다. 5 번 이상을위한 인큐베이션 및 와동의 단계를 반복합니다. 각 샘플에 대해 동일한 15 ML Eppendorf 튜브에 뜨는을 결합합니다. 일반적으로 80 % 세포 현탁액에서 복구할 수 있습니다. </li><li> 4 resuspended 세포와 표면에 뜨는를 저장 ° C. 2 일 이내에 정렬합니다. </li></ol> 4. 외과 분석 BD FACSAria 흐름 cytometer와 해당 소프트웨어에 대한 절차는 여기에 설명되어 있습니다. <ol><li> 제조 업체에서 권장하는 흐름 cytometer의 다음 단계의 설정을 최적화합니다. 이 알아볼 필요 breakoff 매개 변수와 달콤한 자리를 설정하는 증폭 제어를 조정하고, 실험 쉬스 압력 레이저 지연과 영역 확장 요소를 최적화하고 FSC와 SSC 전압, FSC 임계값, FSC 형광 스케일링, 형광 PMT 전압 설정을 최적화 등 </li><li> FITC 측면 분산형 (SSC)의 형광 강도에 따라 흐름 cytometer (FCM)에 부정적인 컨트롤 샘플을 실행합니다. 부정적인 컨트롤에 세포가 FITC - SSC 수집 디스플레이에 의​​해 시각을 사용할 수 없습니다 때까지 FITC 임계값을 높이십시오. </li><li> 노 또한 제어 샘플을 실행하고 FITC와 SSC 인수에 따라 만 세포의 분포 패턴을 확인합니다. 모든 세포를 싸주십시오 그리고 "낮은 강도 전지"(LIS)로 지정하기위한 게이트를 정의합니다. </li><li> DOC - 개정 샘플을 실행하고 FITC와 SSC에 따라 만 세포의 분포 패턴을 확인합니다. 일부 세포는 미리 LI 게이트에 나타납니다. LIS보다 높은 형광 강도를 (그의)가 세포를 묶으 다른 게이트를 정의합니다. 문이 세포의 상대적인 풍부를 볼 수 통계를 수집. </li><li> "정화 한 방울"모드에서 500 μl PBS를 포함하는 컬렉션을 튜브로 정렬 HI 세포. 그의 수가 500,000 카운트에 도달할 때 정렬을 종료할 수 있습니다. </li></ol> 5. 16의 필터 PCR 증폭은 rRNA 유전자를 필터 PCR 절차 Kirchman 외에서 수정 6. <ol><li> 흰색에 필터 정렬 세포, 0.22 μm의 - 기공 크기, 25mm 지름, 폴리 카보 네이트 멤브레인 필터. 멸균 블레이드를 사용하여 어떤 박테리아 세포를 포함하지 필터의 가장자리를 낸다. 8 동등한 크기의 조각으로 필터를 슬라이스. </li><li> 세포가 튜브의 안쪽을 향하고과 PCR 반응 관에 하나의 필터 부분을 넣으십시오. PCR 반응 관에 45 μl PCR 등급 물을 추가합니다. 물 속에 완전히 필터 잠수함. </li><li> 이 호슈 illustra PuReTaq 읽기 - 투 - 고, PCR 반응 관에 PCR 비즈를 간단히 와동을 추가합니다. PCR 반응 튜브의 각으로, 2 μl 같은 27F 및 1492R 7로 순방향 및 역방향 16 rRNA 유전자 primers (0.4 μm의 각 프라이머에 대한 최종 농도)를 각각 추가합니다. </li><li> (선택 사항) adsorb 증폭 억제제를 돕기 위해 PCR 반응 혼합물에 1μl 소 혈청 알부민 솔루션 (BSA, 최종 농도가 30μg/100 μl)을 추가합니다. 한 BSA를 추가하지 선택한 경우, 대신에 물을 1μl 추가할 수 있습니다. </li><li> 열 자전거 타는 사람에 PCR 증폭을 수행합니다. PCR 프로그램 다운 터치 권장합니다, 이것은 순차적으로 62에서 52로 감소 어닐링 온도를 가지고 ° C 1 ° C 52 어닐링 온도와 15주기에 의해 다음 11주기, ° C.에 대한 사이클당 모든주기는 (95 ° C에서) denaturing (62에서 52 ° C) 어닐링, 및 확장 (72 ° C에서) 50 기간의 단계를 포함합니다. 초기 3 분 변성 및 최종 10 분 확장 단계는 PCR 프로그램에 포함되어 있습니다. </li><li> ethidium 브로마이드 묻은 1퍼센트 아가로 오스 겔 전기 영동에 의한 PCR의 증폭을 확인합니다. 엑사이스 PCR의 겔에서 amplicons 및 QIAGEN QIAquick 겔 추출 키트와 함께 청소하십시오. </li><li> 각 샘플에 대한 두 개의 추가 PCR amplifications을 수행, 각 시간이 새 필터 섹션을 사용합니다. PCR 젤 purificati 후에 함께 동일한 샘플의 amplicons을 수영장. 정화 16 rDNA의 amplicons 지금 같은 클론 라이브러리 구축 및 시퀀싱과 같은 taxonomic 식별을 허용 분자 분석의 여러 준비가되어 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : 대표 결과는 예를 들어 putrescine - 굴욕적인 박테리아의 연구를 사용하여 설명되어 있습니다. 물 샘플은 조지아 해안 사이트에서 수집하여 위에서 설명한 절차에 따라 처리되었습니다. 외과 분석 putrescine 또한 높은 BrdU의 설립 속도 (그림 1)을 나타내는 높은 FITC 형광 강도와 박테리아의 그룹의 발전을 유도하는 것으로 나타났습니다. 이 전지는 높은 BrdU - 정관 전지 (그의)으로 지정되었으며 대부분 putrescine - 굴욕적인 박테리아를 포함하는 것으로 예상했다. HIS는 BrdU의 설립 (LIS)의 낮은 수준의 세포가 포함된 노 또한 컨트롤에서 누락되었습니다. LIS는 주로 추가 putrescine를 사용할 수 없습니다 bacterioplankton를 포함할 것으로 예상했다. 그의 분리 튜브에 정렬하고 멤브레인 필터로 수집했다. 16 rRNA 유전자 amplicons는 필터 PCR을 사용하여 높은 HI 세포에 대한 취득했다. <img src="/files/ftp_upload/2855/2855fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 노 또한 제어 및 부화 후 24 H 수집 (여기서 예로 putrescine) 모델 화합물 - 개정 표본의 흐름 cytometric 분석. 세포 분포 분석은 긍정적으로 BrdU의 정관의 수준과 관련이 FITC 라벨 (X 축) (1) 형광 강도에 따라 있었고, (2) 사이드 분산형 (SSC, Y 축)은, 긍정적으로 세포에 관련된 어떤 크기. 게이트 표기법은 BrdU의 설립, (; LI, 낮은 BrdU - 정관 HI, 높은 BrdU - 정관)의 수준에 따라 달라집니다. HI 및 LI 세포의 상대적 비율은 해당 게이트에 표시됩니다.

<ol><li>Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DNA-synthesizing+bacterial+cells+in+coastal+North+Sea+plankton%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).</li>
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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리의 접근 커플 BrdU의 설립, 외과 및 16 rDNA 분석 수생 환경에서 개별 DOC 구성 요소를 대사 bacterioplankton의 종 수준의 식별을 허용합니다. BrdU의 설립 분석은 활성 세균에 대한 분석이 가능하기 때문에 휴면 세포를 포함하지 않습니다 신진 대사 활동을 기반으로 박테리아 세포를 표시합니다. 우리의 접근에서 BrdU의 설립은 이후 시각 아르 BrdU의 설립의 다른 수준을 가지고 immunodetected 현장과 박테리아의 그룹화 및 외과를 사용하여 정렬됩니다. BrdU 통합 세포의 분석은 또한 분자 분석 2,8,9 다음 BrdU - 라벨 DNA의 자기 비드 immunocapture를 사용하여보고되었습니다. 후자 방법 중 하나는 제한이 다른 활동 수준의 세포를 구별하기 위해 못하는 것입니다. 이 경우에는 분석 (그림 1, LIS) 물 샘플에서 원주민 DOC를 사용하여 약간 활성 상태로 유지 세포를 포함하게됩니다. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> BrdU </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> B5002 - 5G </td><td></td></tr><tr><td> 라이 소 자임 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> L6876 - 5G </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> P2308 - 25MG </td><td></td></tr><tr><td> 현장 세포 확산 키트, FLUOS에서 </td><td> 키트 </td><td> 로체 </td><td> 11810740001 </td><td> 안티 BrdU - FLUOS와 제조 업체가 제안보다 반응마다 부화 버퍼 더 소비합니다. </td></tr><tr><td> 프레임 시일 배양 챔버 </td><td> 자료 </td><td> 바이오 래드 </td><td> SLF - 1201 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 카보 네이트 멤브레인 필터 (142 - mm - 직경 1.0 μm의 - 구멍 크기) </td><td> 자료 </td><td> Millipore </td><td> FALP14250 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 카보 네이트 막 필터 (25 - mm - 직경 0.2 μm의 - 구멍 크기) </td><td> 자료 </td><td> Millipore </td><td> FGLP02500 </td><td></td></tr><tr><td> illustra PuReTaq 즉시 이동 PCR 비즈 </td><td> 키트 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 27-9559-01 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick 겔 추출 키트 </td><td> 키트 </td><td> QIAGEN </td><td> 28,704 </td><td></td></tr><tr><td> 안전 장치 ​​PCR 시스템 </td><td> 키트 </td><td> EPICENTRE </td><td> FS99060 </td><td></td></tr></tbody></table>

bromodeoxyuridine (brdu) 레이블과 녹아 유기 문화 독립적인 확인을위한 후속 형광 활성 세포 정렬 탄소 굴욕 bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

미생물이 수중 환경에서 다수의 용해 유기 탄소 (DOC) 기판의 저하를 중재 주요 수단이된다. 그러나, 자연 DOC의 특정 풀을 변형 박테리아 taxa의 식별은 기술적인 도전을 포즈. 여기서 우리는 접근 방식을 설명하는 것을 커플 bromodeoxyuridine (BrdU) 정관, 형광 활성 세포 분류 (외과), 그리고 16 수생 환경에서 굴욕 특정 DOC 화합물 가능한 bacterioplankton 문화 독립적인 식별이 가능 rRNA 유전자 기반의 분자 분석. 세중의의 bacterioplankton의 microcosms은 BrdU와 모델 DOC 화합물 (DOC 개정) 또는 전용 BrdU (노 또한 컨트롤)를 모두 받도록 설정되었습니다. 새로 합성된 박테리아 DNA와 BrdU - 라벨 DNA의 thymidine의 BrdU의 대용품이 순위는 쉽게 immunodetected 1,2 수 있습니다. 추가 DOC 화합물을 선택적으로 활성화 될 것으로 예상하고, 따라서에서 노 DOC의 개정과 세포에 비 응답 전지보다 BrdU의 설립 높은 수준의 (HI 세포)를 가지고 있습니다 사용할 수 있습니다 24 시간 보육, bacterioplankton 통해 또한 컨트롤 (낮은 BrdU의 설립 세포, LI 전지). 형광 면역 후, HI 전지는 구별하고 육체적으로 형광 활성 세포 분류 (외과) 3 LI 세포 분리. 정렬 DOC - 반응 전지 (HI 세포)의 DNA가 추출 taxonomically PCR, 클론 라이브러리 구축 및 시퀀싱을 포함하여 rRNA 유전자 기반의 분석 이후 16를 통해 식별됩니다.

환경 bacterioplankton는 유기 탄소 (DOC) 화합물과 DNA 라벨 시약, bromodeoxyuridine (BrdU)를 해산 모델 incubated 있습니다. 그 후, DOC - 굴욕적인 세포는 형광 활성 세포 분류 (외과)를 사용하여 고가 BrdU의 설립에 따라 대량 지​​역 사회에서 분리됩니다. 이러한 전지는 다음 이후의 분자 분석에 의해 식별됩니다.

Bromodeoxyuridine (BrdU) 레이블과 녹아 유기 문화 독립적인 확인을위한 후속 형광 활성 세포 정렬 탄소 굴욕 Bacterioplankton

미생물은 수생 환경에서 수많은 용존 유기 탄소(DOC) 기질의 분해를 매개하는 주요 인자입니다. 하지만...

미생물은 수생 환경과 같은 곳에서 수많은 용존 유기 탄소 기질 또는 DOC 화합물의 분해를 매개합니다. DOC 변환에서 미생물의 역할을 완전히 이해하기 위해서는 이들의 분류학과 기능에 대한 동시 식별이 필요합니다. 본 영상에서는 수생 환경에서 특정 DOC 풀을 변환하는 유리 생활 박테리아 또는 박테리아 플랑크톤의 분류학적 식별 절차를 시연합니다.테스트 환경에서 수집한 수중 시료를 처리하고, 관심 화합물 및 신생 DNA와 활성 성장 세포에 통합되는 bromo deoxy uridine(BRDU)과 함께 배양합니다. 다음으로 BRDU가 표지된 박테리아 플랑크톤을 ZI가 결합된 anti BRDU 항체로 표지합니다. BRDU 표지 수준이 높은 박테리아 플랑크톤을 형광 활성 세포 분류법으로 분리합니다.그 후 분류된 세포에서 DNA를 추출하고, PCR 기반 16 s ribosomal RNA 유전자 분석 결과를 바탕으로 분류학적 동정을 수행합니다. 안녕하세요, 저는 켄트 주립대학교 생물과학과의 Chen Mao 교수님 연구실의 Steven Robbins입니다. 오늘 저와 동료는 수생 환경에서 DOC 분해 박테리아 플랑크톤을 동정하기 위한 배양 독립적 방법을 보여드리겠습니다.영양분 보충 후 박테리아 군집 DNA를 분석하는 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 매우 활성도가 높은 박테리아에 분석을 집중하고 휴면 상태이거나 성장이 느린 세포는 배제한다는 점입니다. 본 연구에서는 특정 DOC 화합물을 사용하는 박테리아 플랑크톤의 식별 과정을 보여줍니다. 하지만 이 방법은 다른 단일 DOC 화합물이나 조류 삼출물과 같은 DLC 그룹을 사용하는 박테리아 플랑크톤을 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다.그럼 수중 샘플을 준비하여 시작하겠습니다. DOC 분해 박테리아 플랑크톤을 분석하기 전, 수중 샘플을 적절하게 처리해야 합니다. 여기에 표시된 샘플은 조지아 해안에서 채집되었으며, 수중 샘플에서 큰 입자와 ER VRE를 제거하는 과정이 필요합니다.연동 펌프를 사용하여 수집 카보이에서 1 µm 공극 크기의 필터가 장착된 여과 장치로 물을 옮깁니다. 그다음, 여과액 36 mL씩을 멸균된 50 mL 폴리프로필렌 튜브 3개에 각각 분주합니다. 각 튜브에는 새로 준비한 10% Paraformaldehyde 용액 4 mL가 들어 있어야 합니다. 배양 후 세포를 보존하기 위해 상온에서 2시간 동안 배양합니다.0.22 µm 공극 크기의 흰색 멤브레인 필터가 장착된 유리 진공 여과 장치의 여과탑에 물을 붓고, 진공을 가해 용액을 여과합니다. 진공 필터를 통해 10 mL의 PBS를 통과시켜 필터를 세척합니다. 필터에 음성 대조군이라고 라벨을 붙인 후 -20 °C에서 보관합니다.실험적 생태계 또는 마이크로코즘(microcosm)을 구축하려면, 먼저 세척된 1L 유리 플라스크 6개에 미리 여과한 수중 시료 800 milliliters를 채웁니다. 각 마이크로코즘에 BRDU를 최종 농도가 10 micromolar가 되도록 첨가합니다. 플라스크를 손으로 빠르게 회전시켜 혼합합니다.각 샘플은 3반복으로 분석됩니다. 따라서 3개의 마이크로코즘에 모델 DOC 화합물을 첨가합니다. 여기서는 reine을 최종 농도가 100 nanomolar가 되도록 마이크로코즘에 첨가합니다.그런 다음 나머지 세 개의 마이크로코즘에 멸균된 PBS를 첨가합니다. 이는 비 DOC 대조군으로 사용됩니다. 모든 마이크로코즘을 25 °C의 현장 온도에서 어두운 상태로 100 RPM 진탕 배양기에 넣습니다. 이후 0, 8, 16, 24시간 시점에서 샘플을 채취합니다.4 mL의 신선한 10% paraform aldehyde가 포함된 50 mL 멸균 폴리프로필렌 튜브에 각 마이크로코즘으로부터 36 mL를 수집하고, 세포를 고정하기 위해 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 보존된 세포를 0.22 micrometer 공극 크기의 화이트 멤브레인 필터로 여과합니다. 진공 필터를 통해 10 mL PBS를 통과시켜 PFA 잔여물을 세척합니다.즉시 INS in situ 면역 검출을 진행하거나, 박테리아 플랑크톤의 BRDU 통합을 분석하기 위해 필터를 -20 °C에서 보관하십시오. 먼저 박테리아 세포벽을 손상시키기 위해 샘플 필터를 실온에서 처리하십시오. 필터를 여과 장치 위에 놓고, 세포가 덮이도록 라이소자임 용액 1 mL를 필터 위에 피펫으로 분주한 후 실온에서 30분 동안 배양하십시오.배양 후, 진공을 가하여 용액을 제거합니다. 용액이 필터를 통과하면 PBS 10 milliliters를 추가하여 세포를 세척하고 진공을 가합니다. 그런 다음 세포벽을 더욱 손상시키기 위해 proteinase K 용액 1 milliliter를 필터에 추가하여 세포를 덮어줍니다.실온에서 30분 동안 배양합니다. PBS로 세척하여 단층 DNA를 생성합니다. 필터 위의 세포가 덮이도록 exonuclease 용액 1 mL를 첨가합니다.37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 진공 필터에 10 mL PBS를 통과시켜 필터를 세척합니다. 그다음, 세포가 없는 부분을 제거하기 위해 필터의 가장자리를 잘라냅니다.그런 다음 알코올로 세척하여 건조시킨 표면 위에서 멸균 칼날을 사용하여 필터를 동일한 크기의 8조각으로 자릅니다. 각 샘플당 8개의 프레임 씰 배양 챔버가 필요하며, 필터의 8분의 1 조각을 조립된 프레임 씰 배양 챔버에 샘플 면이 위로 향하게 놓습니다. 챔버 조립이 완료되면, Roche Intu 세포 증식 키트를 사용하여 in situ에서 A-B-R-D-U 표지 세포를 검출합니다.정치 과정이 완료되면 배양 챔버에서 필터 섹션을 꺼내 멸균된 표면에 놓습니다. 멸균된 칼날을 사용하여 필터 섹션을 작은 조각으로 자릅니다. 잘라낸 필터 조각들을 1 mL PBS가 들어 있는 2 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후, 튜브 뚜껑을 단단히 닫고 파라필름으로 밀봉합니다. 그 다음, 37 °C, 200 RPM 조건의 진탕 배양기에서 10분 동안 배양합니다.배양 후, 튜브를 고정하고 최대 속도로 볼텍싱합니다. 5분 동안 상층액(SUP natant)을 멸균된 15 milliliter 폴리프로필렌 튜브로 피펫팅하여 옮깁니다. 그다지 필터를 PBS에 재현탁하고 볼텍싱과 배양 단계를 두 번 더 반복하며, 각 샘플마다 상층액(snat)을 동일한 15 milliliter 튜브에 추가합니다.재부유시킨 세포를 4 °C에서 보관하십시오. 샘플은 2일 이내에 분석해야 합니다. 마지막으로, 세포를 분리하여 BRDU 통합 수준이 높은 세포군을 얻으십시오.본 과정에서는 BD FACS Aria 유세포 분석기와 해당 소프트웨어를 사용합니다. 세포 분리가 완료되면, BRDU가 농축된 집단에 대해 분석을 수행하여 분류학적 정체성을 결정할 수 있습니다. 분리된 박테리아의 16 s 리보솜 RNA 유전자를 증폭하기 위해 필터 PCR을 수행하며, 분리된 세포를 흰색 0.22 pore size 폴리카보네이트 막 필터 위에 피펫으로 옮기고 진공 펌프를 작동시킨 뒤, 멸균된 블레이드를 사용하여 필터의 세포가 없는 가장자리 부분을 잘라냅니다.필터를 각 조건에 맞게 동일한 크기의 네 조각으로 자르고, 세포가 튜브 안쪽을 향하게 하여 세 개의 PCR 반응 튜브에 필터 조각을 하나씩 넣습니다. PCR 등급의 증류수 45 µL를 추가합니다. 필터 조각이 물에 완전히 잠기게 합니다.다음으로, Roche illustra pure T ready to go PCR 비드 2개를 넣고 짧게 볼텍싱하여 비드가 잘 녹도록 합니다. 그런 다음 정방향 및 역방향 16 s 리보솜 RNA 유전자 프라이머를 각각 2 µL씩 첨가합니다.증폭 억제제 흡수를 돕기 위해 1 µL의 BSA를 추가하거나 1 µL의 물을 추가합니다. 열 순환기(thermal cycler)에서 PCR 증폭을 수행합니다. 어닐링 온도가 사이클당 1 °C씩 62 °C에서 52 °C까지 순차적으로 감소한 후, 52 °C에서 15 사이클을 진행하는 touchdown PCR 프로그램을 권장합니다.브로마이드로 염색된 1% agarose 겔에서 전기영동을 통해 PCR 증폭을 확인하고, 겔에서 PCR 증폭 산물을 절단한 후 KaiGen cayo quick gel extraction kit로 정제합니다. PCR 겔 정제 후, 동일한 샘플의 증폭 산물들을 하나로 모읍니다. 이제 정제된 16s ribosomal DNA 증폭 산물은 다양한 분자 분석에 사용할 준비가 되었습니다.조지아의 해안 지역에서 샘플을 수집하였으며, 본 영상에서 설명하는 절차에 따라 라신(Racine) 분해 박테리아를 연구하기 위해 처리하였습니다. 라신은 해양 환경에서 어디서나 발견될 수 있는 폴리아모리 화합물입니다. 여기에서 보여주는 바와 같이, 이는 해양 박테리아의 영양분 및 에너지원으로 작용할 수 있습니다.시료의 사실 분석 결과, 24시간 배양 후 Racine 수정 마이크로코즘에서 BRDU 통합 정도와 양의 상관관계를 보이는 더 높은 수준의 FXI 형광 강도를 가진 박테리아 그룹이 생성된 것으로 나타났습니다. 이 세포들은 고-BRDU 통합 세포 또는 HI로 지정되었으며, 주로 Racine 분해 박테리아를 포함하고 있을 것으로 예상되었습니다. HI는 발견되지 않았습니다.첨가물을 넣지 않은 대조군에서도 세포가 발견되었으며, 여기에는 BRDU 통합 수준이 낮은 lii 세포로 지칭되는 세포들만 포함되어 있었고, 주로 이를 이용할 수 없는 박테리아 플랑크톤이 포함되어 있을 것으로 예상되었습니다. 추가된 Racine HI 세포는 개별 튜브로 분류한 후 멤브레인 필터로 수집하였습니다. 필터 PCR 이후 부분적인 16s 리보솜 RNA 유전자 앰플리콘을 얻었으며, 겔 전기영동을 통해 이를 확인하였습니다.분류 필터링 후, 분류된 세포 간의 기능적 다양성을 조사하기 위해 기능성 유전자의 PCR 증폭을 수행할 수도 있습니다. 지금까지 형광 활성 세포 분류(FACS)와 BrdU 도입을 결합한 접근 방식을 사용하여 수생 환경에서 기능성 박테리아 세포를 물리적으로 분리하고 식별하는 방법을 보여드렸습니다. BrdU는 유해하므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 실험복과 장갑을 착용해야 함을 기억하십시오.이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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