Bromodeoxyuridine (BrdU) 레이블과 녹아 유기 문화 독립적인 확인을위한 후속 형광 활성 세포 정렬 탄소 굴욕 Bacterioplankton

미생물은 수생 환경과 같은 곳에서 수많은 용존 유기 탄소 기질 또는 DOC 화합물의 분해를 매개합니다. DOC 전환에서 미생물의 역할을 완전히 이해하기 위해서는 이들의 분류학적 특성과 기능을 동시에 식별하는 것이 필요합니다. 본 영상에서는 수생 환경에서 특정 DOC 풀을 전환하는 자유 생활 박테리아 또는 박테리아 플랑크톤의 분류학적 식별 절차를 보여줍니다.

테스트 환경에서 수집한 수질 시료를 처리한 후, 관심 화합물 및 새롭게 합성된 DNA와 활발하게 성장하는 세포에 통합되는 bromo deoxy uridine, BRDU와 함께 배양합니다. 그 다음, BRDU가 표지된 박테리아 플랑크톤을 ZI가 접합된 anti BRDU 항체로 표지합니다. BRDU 표지 수준이 높은 박테리아 플랑크톤을 형광 활성 세포 분류법(fluorescence activated cell sorting)을 통해 분리합니다.

그 다음 분리된 세포에서 DNA를 추출하고, PCR 기반의 16 s ribosomal RNA 유전자 분석 결과에 근거하여 분류학적 동정을 수행합니다. 안녕하세요, 저는 켄트 주립대학교 생물과학과 Chen Mao 박사님 연구실의 Steven Robbins입니다. 오늘 저와 lu는 수생 환경에서 DOC 분해 박테리아 플랑크톤을 동정하기 위한 배양 독립적 방법을 보여드리겠습니다.

영양염 첨가 후 박테리아 군집 DNA를 분석하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 분석의 초점을 매우 활발한 박테리아에 맞추어 휴면 상태이거나 성장이 느린 세포를 제외한다는 점입니다. 본 논문에서는 특정 DOC 화합물을 이용하는 박테리아 플랑크톤의 식별 과정을 보여줍니다. 하지만 이 방법은 다른 단일 DOC 화합물이나 조류 삼출물과 같은 DLC 그룹을 이용하는 박테리아 플랑크톤을 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다.

이제 수중 샘플을 준비하여 시작하겠습니다. DOC 분해 박테리아 플랑크톤을 분석하기 전에 수중 샘플을 적절하게 처리해야 합니다. 여기에 제시된 샘플은 조지아 연안에서 수집되었으며, 수중 샘플에서 큰 입자와 ER VREs를 제거하는 과정이 필요합니다.

연동 펌프를 사용하여 수집용 카보이에서 1 µm 공극 크기의 필터가 장착된 여과 장치로 물을 옮깁니다. 다음으로, 여과액 36 mL씩을 멸균된 50 mL 폴리프로필렌 튜브 3개에 분주합니다. 각 튜브에는 갓 제조한 10% Paraformaldehyde 용액 4 mL가 들어 있어야 합니다. 배양 후 세포를 보존하기 위해 상온에서 2시간 동안 배양합니다.

0.22 µm 공극 크기의 흰색 멤브레인 필터가 장착된 유리 진공 여과 장치의 여과 타워에 물을 붓고, 진공을 가해 용액을 여과합니다. 10 mL의 PBS를 진공 필터에 통과시켜 필터를 세척합니다. 필터에 음성 대조군이라고 라벨을 붙인 후 -20 °C에서 보관합니다.

실험적 생태계 또는 마이크로코즘을 구축하려면, 먼저 세척한 1리터 유리 플라스크 6개에 사전 여과된 수질 시료 800 milliliters를 채웁니다. 각 마이크로코즘에 BRDU를 최종 농도 10 micromolar가 되도록 첨가합니다. 플라스크를 손으로 빠르게 회전시켜 혼합합니다.

각 샘플은 3회 반복하여 분석합니다. 따라서 3개의 마이크로코즘에 모델 DOC 화합물을 첨가합니다. 여기서는 최종 농도가 100 nanomolar가 되도록 reine을 마이크로코즘에 첨가합니다.

그런 다음 나머지 세 개의 마이크로코즘에 멸균된 PBS를 추가합니다. 이는 비-DOC 대조군으로 사용됩니다. 모든 마이크로코즘을 25 °C의 현장 온도에서 어두운 상태로 100 RPM 진탕 배양기에 넣습니다. 여기서 0, 8, 16, 24시간 시점에 샘플을 채취합니다.

각 마이크로코즘에서 36 mL를 채취하여 4 mL의 신선한 10% paraformaldehyde가 들어 있는 50 mL 멸균 폴리프로필렌 튜브에 넣고, 세포를 고정하기 위해 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 그다음, 고정된 세포를 0.22 µm 공극 크기의 화이트 멤브레인 필터로 여과합니다. 진공 필터를 통해 10 mL의 PBS를 통과시켜 PFA 잔류물을 세척합니다.

즉시 INS in situ 면역 검출을 진행하거나, 박테리아 플랑크톤의 BRDU 통합을 분석하기 위해 필터를 -20 °C에서 보관하십시오. 먼저 박테리아 세포벽을 손상시키기 위해 실온에서 샘플 필터를 처리하는 것으로 시작합니다. 필터를 여과 장치 위에 놓고, 세포가 덮이도록 라이소자임 용액 1 mL를 필터 위에 피펫으로 분주한 후 실온에서 30분 동안 배양하십시오.

배양 후, 진공을 가하여 용액을 제거합니다. 용액이 필터를 통과하면, 10 milliliters의 PBS를 추가하여 세포를 세척하고 다시 진공을 가합니다. 그런 다음 세포벽을 더욱 손상시키기 위해, 필터 위의 세포가 덮이도록 1 milliliter의 proteinase K 용액을 추가합니다.

실온에서 30분 동안 배양합니다. PBS로 세척하여 단층 DNA를 생성합니다. 필터 위의 세포가 잠기도록 엑소뉴클레아제(exonuclease) 용액 1 mL를 첨가합니다.

37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 진공 필터에 10 mL PBS를 통과시켜 필터를 세척합니다. 다음으로, 세포가 없는 부분을 제거하기 위해 필터의 가장자리를 잘라냅니다.

그 후 알코올로 세척하여 건조시킨 표면 위에서 멸균 블레이드를 사용하여 필터를 8등분으로 자릅니다. 각 시료당 8개의 프레임 씰 배양 챔버가 필요하며, 필터의 1/8 조각을 조립된 프레임 씰 배양 챔버에 시료 면이 위로 향하게 하여 넣습니다. 챔버 조립이 완료되면, Roche Intu cell proliferation kit flus를 사용하여 in situ에서 A-B-R-D-U 표지 세포를 검출합니다.

정지 절차가 완료되면, 배양 챔버에서 필터 섹션을 제거하여 멸균된 표면에 놓으십시오. 멸균된 칼날을 사용하여 필터 섹션을 작은 조각으로 자릅니다. 필터 조각들을 1 mL PBS가 들어 있는 2 mL 마이크로 원심 분리 튜브로 옮긴 후 튜브 뚜껑을 단단히 닫고 파라필름으로 밀봉합니다. 그런 다음 37 °C, 200 RPM의 진탕 배양기에서 10분 동안 배양합니다.

배양 후, 튜브를 고정하고 최대 속도로 볼텍싱합니다. 5분 동안 상층액(SUP natant)을 멸균된 15 milliliter 폴리프로필렌 튜브에 피펫으로 옮깁니다. 그 다음 필터를 PBS에 재현탁하고 볼텍싱과 배양 단계를 두 번 더 반복하며, 매번 각 샘플의 상층액을 동일한 15 milliliter 튜브에 추가합니다.

재부유시킨 세포를 4°C에서 보관하십시오. 샘플은 2일 이내에 분석해야 합니다. 마지막으로, 세포를 분류하여 BRDU 통합 수준이 높은 세포군을 얻으십시오.

본 과정에서는 BD FACS Aria 유세포 분석기와 해당 소프트웨어를 사용합니다. 세포 분리(sorting)가 완료되면, BrDU가 농축된 세포군을 분석하여 분류학적 정체성을 결정할 수 있습니다. 분리된 박테리아의 16S 리보솜 RNA 유전자를 증폭하기 위해 필터 PCR을 수행하며, 분리된 세포를 0.22 µm 공극 크기의 흰색 폴리카보네이트 멤브레인 필터 위에 피펫으로 옮기고 진공 펌프를 작동시킨 후, 멸균된 칼날을 사용하여 세포가 없는 필터의 가장자리를 잘라냅니다.

필터를 각 조건에 맞게 동일한 크기의 4조각으로 자른 후, 3개의 PCR 반응 튜브에 필터 조각을 하나씩 넣되 세포가 튜브 안쪽을 향하게 합니다. PCR 등급의 증류수 45 µL를 첨가합니다. 필터 조각이 물에 완전히 잠기도록 둡니다.

다음으로, Roche illustra pure T ready to go PCR bead 2개를 넣고 짧게 vortex 하여 bead가 잘 녹도록 돕습니다. 그런 다음, 정방향 및 역방향 16 s ribosomal RNA 유전자 프라이머를 각각 2 µL씩 첨가합니다.

증폭 억제제 흡수를 돕기 위해 1 µL의 BSA를 추가하거나 1 µL의 증류수를 추가합니다. 열 순환기(thermal cycler)를 사용하여 PCR 증폭을 수행합니다. 어닐링 온도(annealing temperature)를 사이클당 1 °C씩 62 °C에서 52 °C까지 순차적으로 낮춘 후, 52 °C에서 15 사이클을 진행하는 touchdown PCR 프로그램을 권장합니다.

브롬화물로 염색된 1% Agros 젤에서 전기영동을 통해 PCR 증폭을 확인한 후, 젤에서 PCR 증폭 산물을 절단하고 KaiGen cayo quick gel extraction kit를 사용하여 정제합니다. PCR 젤 정제 후, 동일한 샘플의 증폭 산물들을 한데 모읍니다. 이렇게 정제된 16 s ribosomal DNA 증폭 산물은 이제 다양한 분자 분석에 사용할 준비가 되었습니다.

조지아의 해안 지역에서 샘플을 수집하였으며, 본 비디오에 설명된 절차에 따라 Racine 분해 박테리아를 연구하기 위해 처리하였습니다. Racine은 해양 환경에서 보편적으로 발견되는 폴리아모리 화합물입니다. 여기에서 보여주는 바와 같이, 이는 해양 박테리아의 영양분 및 에너지원으로 작용할 수 있습니다.

시료의 분석 결과, 24시간 배양 후 Racine이 첨가된 마이크로코즘에서 BRDU 통합 정도와 양의 상관관계를 보이는 더 높은 수준의 FXI 형광 강도를 가진 박테리아 집단이 발달한 것으로 나타났습니다. 이 세포들은 고-BRDU 통합 세포 또는 HI로 지정되었으며, 대부분 Racine 분해 박테리아를 포함하고 있을 것으로 예상되었습니다. HI는 발견되지 않았습니다.

첨가물이 없는 대조군에서도 세포가 발견되었으며, 여기에는 BRDU 통합 수준이 더 낮은 lii 세포로 지칭되는 세포들만 포함되어 있었습니다. 이들은 주로 이용 가능한 영양분이 없어 성장하지 못한 박테리아 플랑크톤으로 구성되었을 것으로 예상되었습니다. 첨가된 Racine HI 세포는 각각 별도의 튜브로 분리하여 정렬한 후 멤브레인 필터로 수집하였습니다. 필터 PCR 이후 부분적인 16S ribosomal RNA 유전자 앰플리콘을 얻었으며, 이를 겔 전기영동으로 확인하였습니다.

분류 필터링 후, 분류된 세포 간의 기능적 다양성을 조사하기 위해 기능성 유전자의 PCR 증폭을 수행할 수 있습니다. 지금까지 형광 활성 세포 분류(FACS)와 BrDU 통합법을 결합한 접근 방식을 사용하여 수생 환경에서 기능성 박테리아 세포를 물리적으로 분리하고 식별하는 방법을 보여드렸습니다. BrDU는 유해하므로, 이 절차를 수행하는 동안에는 항상 실험복과 장갑을 착용해야 함을 기억하십시오.

이상입니다. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.