Name: Bromodeoxyuridine (BrdU) 레이블과 녹아 유기 문화 독립적인 확인을위한 후속 형광 활성 세포 정렬 탄소 굴욕 Bacterioplankton (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: 배우세요 BrdU 레이블링과 FACS를 이용한 수중 환경에서 용존 유기탄소 분해 세균 동정 방법. 이 기술은 활성 세균을 분리하여 미생물 생태학 및 탄소 순환 연구에 활용됩니다.

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이 프로젝트의 자금은 국립 과학 재단 (National Science Foundation)을 부여 OCE1029607 (XM)을하고 MCB0702125 (MAM)을하고 고든과 베티 무어 재단 (MAM)을 제공한했습니다.

1. 워터 샘플 처리 <ol><li> 1 μm의 - 기공 크기의 멤브레인 필터를 통해 필터 10L 환경 물은 큰 입자와 bacteriovores을 제거합니다. 상자 속에 든 대형 유리병에 물을 여과물를 수집합니다. </li><li> 4 ML 신선한 paraformaldehyde 용액 (; 10% PFA)를 포함하는 3 멸균 Eppendorf 튜브 (50 ML)로 전송 36 ML 각 여과물. 세포를 보존하기 위해 상온에서 2 시간을위한 부화. 진공 여과에 의해 0.22 - μm의 - 기공 크기의 흰색 멤브레인 필터에 세포를 수집합니다. 진공 여과에 의한 필터를 통해 호수 (PBS)를 인산 버퍼 10 ML를 전달하여 필터를 씻으십시오. 부정적인 컨트롤로 필터를 라벨 및 -20 ° C.에 그들을 저장 </li></ol> 단계 1.3-1.4 DOC - 제한 조건을 설정을위한 옵션입니다. <ol start="3"><li> (5 μm의 NH 4 Club 호텔, 5 μm의 나노 3, 1μM 아니 2 PO 4 최종 농도) 상자 속에 든 대형 유리병에 무기 질소와 인의 혼합물을 추가합니다. </li><li> 가끔 agitations 48 시간 동안 현장의 온도에서 어둠 속에 품어. </li></ol> 2. 소우주 설립과 부화 <ol><li> microcosms을 설정하는 단계 1.4의 상자 속에 든 대형 유리병에서 800 ML 물 샘플 여섯 1 - L 유리 flasks 각각 입력합니다. 각각의 소우주로 BrdU (10 μm의 최종 농도)을 추가합니다. 잘 섞는다. </li><li> microcosms 세에 한 ML 모델 DOC 화합물 솔루션을 추가, 이들은 DOC의 개정안이 될 것입니다. 세 남아 microcosms로 한 ML 멸균 PBS를 추가, 이들은 노 또한 컨트롤 역할을합니다. </li><li> 보육 흔드는 모든 microcosms을 품어 100 rpm으로 흔들어하면서 현장의 온도에서 어둠 속에 품어. </li><li> 시간 0 점, 8, 16, 24 시간 50 ML 살균 Eppendorf 튜브에 각각의 축소판 및 전송에서 물 샘플 36 ML를 수집합니다. 즉시 수집 튜브에 신선한 PFA 4 ML (10 %)를 추가하고 세포를 보존하기 위해 상온에서 2 시간에 대해 숙고하다. </li><li> 필터는 0.22 - μm의 - 기공 크기의 폴리 카보 네이트 막 필터를 통해 세포를 보존. 10 ML PBS로 필터를 씻으십시오. 다음 단계로 바로 진행 또는 -20 ° C.에 필터를 저장 </li></ol> 3. BrdU의 설립에 대한해라 면역에 <ol><li> 상온에서 필터 (DOC 개정 샘플, 노 또한 컨트롤과 부정적인 컨트롤) 해동. </li><li> 라이 소 자임 솔루션 1 ML을 적용합니다 [10 100 MM 트리스, 50 NM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 MG / ML 라이 소 자임 흰자위 (산도 = 8)] 필터에 박테리아 세포를 충당하기 위해 4. 30 분 실온에서 알을 품다. 흡입에 따라 그것을 통해 10 ML PBS를 전달하여 필터를 씻으십시오. </li><li> proteinase K 용액 1 ML 추가 [2 100 MM 트리스, 50 NM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 MG / ML proteinase K (산도 = 8)] 필터에 박테리아 세포를 충당하기 위해 4. 30 분 실온에서 알을 품다. 흡입에 따라 그것을 통해 10 ML PBS를 전달하여 필터를 씻으십시오. </li><li> 1 ML의 exonuclease 솔루션 [exonuclease III (50 U / ML) 5 MM의 MgCl 2, 50 MM 트리스 - HCL] 5 필터에 박테리아 세포를 표지에 추가합니다. 37 품어 ° C를 30 분. 흡입에 따라 그것을 통해 10 ML PBS를 전달하여 필터를 씻으십시오. </li><li> 제조 업체의 지시에 따라 프레임 씰 배양 챔버 (생물 래드)를 조립. </li><li> 알코올 세척 건조 표면에 살균 블레이드를 사용하여 eighths에 필터를 슬라이스. </li><li> 포셉를 사용하여 하나의 조립 프레임 씰 배양 챔버 (8 프레임 인감 챔버 스가 각 필터 샘플이 필요합니다)에 필터의 여덟째 섹션을 놓으십시오. 세포를 포함하는 필터 부분의 측면 위쪽 얼굴 것입니다. 필터의 뒷면에있는 수분은 슬라이드 필터 막대기를하실 수 있습니다. 필터가 건조되면, 슬라이드에있는 필터 섹션을 배치하기 전에 챔버의 중앙에 diH 2 O의 작은 방울 (2 μl)를 적용할 수 있습니다. </li></ol> 단계 3.8-3.20는 제조 업체의 지침에서 변경 절차에 따라 현장 세포 증식 키트에서 호슈에서 시약을 FLUOS 사용합니다. PBS를 제외하고, 모든 시약은 키트 안에 제공됩니다. <ol start="8"><li> 균일하게 도장이 적용되면 오버플로가 발생하지 않고 배양 챔버의 전체 필터 부분을 커버하기에 충분한 배양 버퍼 (0.5 % 소 혈청 횐자위, PBS에 0.​​1 % Tween20) 적용됩니다. </li><li> 배양 챔버 프레임을 통해 폴리 에스테르 프레임 커버를 놓습니다. 단단히 배양 챔버를 밀봉 아래로 누르십시오. 필터 위에 기포를 사용하지 마십시오. 어둠 속에서 실온에서 10 분에 대한 봉쇄 실 품어. </li><li> 폴리 에스테르 도장을 제거하고 배양 챔버 스를 엽니다. (참고 : 챔버를 열고 때로는 슬라이드에서 프레임 인감 끌어 올려서 그 경우에는 다음 단계에 대한 새로운 챔버를 준비..) </li><li> 챔버 한 구석에서 부화 버퍼 아웃 Pipet. 필터와 접촉을 피하십시오. </li><li> 부드럽게 100 μl PBS를 pipetting하여 필터를 세척하고챔버에서 밖으로 3 회. </li><li> 바로 사용하기 전에 제조 업체에서 권장하는 단계를 다음과 같은 안티 - BrdU - FLUOS 작업 솔루션을 준비합니다. </li><li> Pipet 120 μl 방지 BrdU - FLUOS, 필터에 솔루션을 작업을 균일하게하여 전체 표면을 커버주의한다. </li><li> 새로운 폴리 에스테르 커버와 챔버를 봉인. 필터 위에 공기 방울을 피하십시오. 37 어둠의 챔버를 품어 ° C를 3 시간 동안. 이 단계는 플루오레신 isothiocyanate (FITC)와 현장에서 BrdU 통합의 DNA 라벨을 것입니다. </li><li> 폴리 에스테르 커버를 제거하고 배양 챔버를 엽니다. 안티 BrdU - FLUOS 작업 솔루션을 밖으로 Pipet. PBS와 필터 3 번 씻으십시오. </li><li> 배양 챔버에서 멸균 표면에 필터를 전송합니다. 멸균 블레이드를 사용하여 작은 조각으로 필터 섹션을 얇게. </li><li> 2 ML microcentrifuge 튜브, 1 ML PBS를 포함하는 각에 필터 조각을 전송합니다. 단단히 parafilm으로 튜브와 인감을 모자. 37 품어 ° C와 10 분, 200 RPM. </li><li> 5 분 최대 속도 vortexer과 소용돌이로 튜브를 고정합니다. 멸균 15 ML Eppendorf 튜브에 Pipet 뜨는합니다. 5 번 이상을위한 인큐베이션 및 와동의 단계를 반복합니다. 각 샘플에 대해 동일한 15 ML Eppendorf 튜브에 뜨는을 결합합니다. 일반적으로 80 % 세포 현탁액에서 복구할 수 있습니다. </li><li> 4 resuspended 세포와 표면에 뜨는를 저장 ° C. 2 일 이내에 정렬합니다. </li></ol> 4. 외과 분석 BD FACSAria 흐름 cytometer와 해당 소프트웨어에 대한 절차는 여기에 설명되어 있습니다. <ol><li> 제조 업체에서 권장하는 흐름 cytometer의 다음 단계의 설정을 최적화합니다. 이 알아볼 필요 breakoff 매개 변수와 달콤한 자리를 설정하는 증폭 제어를 조정하고, 실험 쉬스 압력 레이저 지연과 영역 확장 요소를 최적화하고 FSC와 SSC 전압, FSC 임계값, FSC 형광 스케일링, 형광 PMT 전압 설정을 최적화 등 </li><li> FITC 측면 분산형 (SSC)의 형광 강도에 따라 흐름 cytometer (FCM)에 부정적인 컨트롤 샘플을 실행합니다. 부정적인 컨트롤에 세포가 FITC - SSC 수집 디스플레이에 의​​해 시각을 사용할 수 없습니다 때까지 FITC 임계값을 높이십시오. </li><li> 노 또한 제어 샘플을 실행하고 FITC와 SSC 인수에 따라 만 세포의 분포 패턴을 확인합니다. 모든 세포를 싸주십시오 그리고 "낮은 강도 전지"(LIS)로 지정하기위한 게이트를 정의합니다. </li><li> DOC - 개정 샘플을 실행하고 FITC와 SSC에 따라 만 세포의 분포 패턴을 확인합니다. 일부 세포는 미리 LI 게이트에 나타납니다. LIS보다 높은 형광 강도를 (그의)가 세포를 묶으 다른 게이트를 정의합니다. 문이 세포의 상대적인 풍부를 볼 수 통계를 수집. </li><li> "정화 한 방울"모드에서 500 μl PBS를 포함하는 컬렉션을 튜브로 정렬 HI 세포. 그의 수가 500,000 카운트에 도달할 때 정렬을 종료할 수 있습니다. </li></ol> 5. 16의 필터 PCR 증폭은 rRNA 유전자를 필터 PCR 절차 Kirchman 외에서 수정 6. <ol><li> 흰색에 필터 정렬 세포, 0.22 μm의 - 기공 크기, 25mm 지름, 폴리 카보 네이트 멤브레인 필터. 멸균 블레이드를 사용하여 어떤 박테리아 세포를 포함하지 필터의 가장자리를 낸다. 8 동등한 크기의 조각으로 필터를 슬라이스. </li><li> 세포가 튜브의 안쪽을 향하고과 PCR 반응 관에 하나의 필터 부분을 넣으십시오. PCR 반응 관에 45 μl PCR 등급 물을 추가합니다. 물 속에 완전히 필터 잠수함. </li><li> 이 호슈 illustra PuReTaq 읽기 - 투 - 고, PCR 반응 관에 PCR 비즈를 간단히 와동을 추가합니다. PCR 반응 튜브의 각으로, 2 μl 같은 27F 및 1492R 7로 순방향 및 역방향 16 rRNA 유전자 primers (0.4 μm의 각 프라이머에 대한 최종 농도)를 각각 추가합니다. </li><li> (선택 사항) adsorb 증폭 억제제를 돕기 위해 PCR 반응 혼합물에 1μl 소 혈청 알부민 솔루션 (BSA, 최종 농도가 30μg/100 μl)을 추가합니다. 한 BSA를 추가하지 선택한 경우, 대신에 물을 1μl 추가할 수 있습니다. </li><li> 열 자전거 타는 사람에 PCR 증폭을 수행합니다. PCR 프로그램 다운 터치 권장합니다, 이것은 순차적으로 62에서 52로 감소 어닐링 온도를 가지고 ° C 1 ° C 52 어닐링 온도와 15주기에 의해 다음 11주기, ° C.에 대한 사이클당 모든주기는 (95 ° C에서) denaturing (62에서 52 ° C) 어닐링, 및 확장 (72 ° C에서) 50 기간의 단계를 포함합니다. 초기 3 분 변성 및 최종 10 분 확장 단계는 PCR 프로그램에 포함되어 있습니다. </li><li> ethidium 브로마이드 묻은 1퍼센트 아가로 오스 겔 전기 영동에 의한 PCR의 증폭을 확인합니다. 엑사이스 PCR의 겔에서 amplicons 및 QIAGEN QIAquick 겔 추출 키트와 함께 청소하십시오. </li><li> 각 샘플에 대한 두 개의 추가 PCR amplifications을 수행, 각 시간이 새 필터 섹션을 사용합니다. PCR 젤 purificati 후에 함께 동일한 샘플의 amplicons을 수영장. 정화 16 rDNA의 amplicons 지금 같은 클론 라이브러리 구축 및 시퀀싱과 같은 taxonomic 식별을 허용 분자 분석의 여러 준비가되어 있습니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : 대표 결과는 예를 들어 putrescine - 굴욕적인 박테리아의 연구를 사용하여 설명되어 있습니다. 물 샘플은 조지아 해안 사이트에서 수집하여 위에서 설명한 절차에 따라 처리되었습니다. 외과 분석 putrescine 또한 높은 BrdU의 설립 속도 (그림 1)을 나타내는 높은 FITC 형광 강도와 박테리아의 그룹의 발전을 유도하는 것으로 나타났습니다. 이 전지는 높은 BrdU - 정관 전지 (그의)으로 지정되었으며 대부분 putrescine - 굴욕적인 박테리아를 포함하는 것으로 예상했다. HIS는 BrdU의 설립 (LIS)의 낮은 수준의 세포가 포함된 노 또한 컨트롤에서 누락되었습니다. LIS는 주로 추가 putrescine를 사용할 수 없습니다 bacterioplankton를 포함할 것으로 예상했다. 그의 분리 튜브에 정렬하고 멤브레인 필터로 수집했다. 16 rRNA 유전자 amplicons는 필터 PCR을 사용하여 높은 HI 세포에 대한 취득했다. <img src="/files/ftp_upload/2855/2855fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 노 또한 제어 및 부화 후 24 H 수집 (여기서 예로 putrescine) 모델 화합물 - 개정 표본의 흐름 cytometric 분석. 세포 분포 분석은 긍정적으로 BrdU의 정관의 수준과 관련이 FITC 라벨 (X 축) (1) 형광 강도에 따라 있었고, (2) 사이드 분산형 (SSC, Y 축)은, 긍정적으로 세포에 관련된 어떤 크기. 게이트 표기법은 BrdU의 설립, (; LI, 낮은 BrdU - 정관 HI, 높은 BrdU - 정관)의 수준에 따라 달라집니다. HI 및 LI 세포의 상대적 비율은 해당 게이트에 표시됩니다.

<ol><li>Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DNA-synthesizing+bacterial+cells+in+coastal+North+Sea+plankton%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).</li>
<li>Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+and+isolation+of+DNA+from+metabolically+active+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).</li>
<li>Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterioplankton+assemblages+transforming+dissolved+organic+compounds+in+coastal+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater.</a> Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).</li>
<li>Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+PCR+for+visualization+of+microscale+distribution+of+specific+genes+and+gene+products+in+prokaryotic+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).</li>
<li>Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodeoxyuridine+%28BrdU%29+immunocytochemistry+by+exonuclease+III+%28Exo+III%29+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion.</a> Histochemistry. 98, 199-199 (1992).</li>
<li>Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+bacterial+communities+in+aquatic+systems+as+revealed+by+filter+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat.+Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR.</a> Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).</li>
<li>Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+stains%3A+ribosomal+RNA-based+probes+for+the+identification+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells.</a> Science. 243, 1360-1360 (1989).</li>
<li>Artursson, V., Jansson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bromodeoxyuridine+immunocapture+to+identify+active+bacteria+associated+with+arbuscular+mycorrhizal+hyphae%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).</li>
<li>Mou, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+carbon+processing+by+generalist+species+in+the+coastal+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean.</a> Nature. 451, 708-708 (2008).</li>
<li>Mou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+cell+sorting+and+subsequent+molecular+analyses+for+culture-independent+identification+of+bacterioplankton+involved+in+dimethylsulfoniopropionate+transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).</li>
<li>Dean, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리의 접근 커플 BrdU의 설립, 외과 및 16 rDNA 분석 수생 환경에서 개별 DOC 구성 요소를 대사 bacterioplankton의 종 수준의 식별을 허용합니다. BrdU의 설립 분석은 활성 세균에 대한 분석이 가능하기 때문에 휴면 세포를 포함하지 않습니다 신진 대사 활동을 기반으로 박테리아 세포를 표시합니다. 우리의 접근에서 BrdU의 설립은 이후 시각 아르 BrdU의 설립의 다른 수준을 가지고 immunodetected 현장과 박테리아의 그룹화 및 외과를 사용하여 정렬됩니다. BrdU 통합 세포의 분석은 또한 분자 분석 2,8,9 다음 BrdU - 라벨 DNA의 자기 비드 immunocapture를 사용하여보고되었습니다. 후자 방법 중 하나는 제한이 다른 활동 수준의 세포를 구별하기 위해 못하는 것입니다. 이 경우에는 분석 (그림 1, LIS) 물 샘플에서 원주민 DOC를 사용하여 약간 활성 상태로 유지 세포를 포함하게됩니다. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> BrdU </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> B5002 - 5G </td><td></td></tr><tr><td> 라이 소 자임 </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> L6876 - 5G </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> 시약 </td><td> 시그마 </td><td> P2308 - 25MG </td><td></td></tr><tr><td> 현장 세포 확산 키트, FLUOS에서 </td><td> 키트 </td><td> 로체 </td><td> 11810740001 </td><td> 안티 BrdU - FLUOS와 제조 업체가 제안보다 반응마다 부화 버퍼 더 소비합니다. </td></tr><tr><td> 프레임 시일 배양 챔버 </td><td> 자료 </td><td> 바이오 래드 </td><td> SLF - 1201 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 카보 네이트 멤브레인 필터 (142 - mm - 직경 1.0 μm의 - 구멍 크기) </td><td> 자료 </td><td> Millipore </td><td> FALP14250 </td><td></td></tr><tr><td> 폴리 카보 네이트 막 필터 (25 - mm - 직경 0.2 μm의 - 구멍 크기) </td><td> 자료 </td><td> Millipore </td><td> FGLP02500 </td><td></td></tr><tr><td> illustra PuReTaq 즉시 이동 PCR 비즈 </td><td> 키트 </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 27-9559-01 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick 겔 추출 키트 </td><td> 키트 </td><td> QIAGEN </td><td> 28,704 </td><td></td></tr><tr><td> 안전 장치 ​​PCR 시스템 </td><td> 키트 </td><td> EPICENTRE </td><td> FS99060 </td><td></td></tr></tbody></table>

bromodeoxyuridine (brdu) 레이블과 녹아 유기 문화 독립적인 확인을위한 후속 형광 활성 세포 정렬 탄소 굴욕 bacterioplankton

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

미생물이 수중 환경에서 다수의 용해 유기 탄소 (DOC) 기판의 저하를 중재 주요 수단이된다. 그러나, 자연 DOC의 특정 풀을 변형 박테리아 taxa의 식별은 기술적인 도전을 포즈. 여기서 우리는 접근 방식을 설명하는 것을 커플 bromodeoxyuridine (BrdU) 정관, 형광 활성 세포 분류 (외과), 그리고 16 수생 환경에서 굴욕 특정 DOC 화합물 가능한 bacterioplankton 문화 독립적인 식별이 가능 rRNA 유전자 기반의 분자 분석. 세중의의 bacterioplankton의 microcosms은 BrdU와 모델 DOC 화합물 (DOC 개정) 또는 전용 BrdU (노 또한 컨트롤)를 모두 받도록 설정되었습니다. 새로 합성된 박테리아 DNA와 BrdU - 라벨 DNA의 thymidine의 BrdU의 대용품이 순위는 쉽게 immunodetected 1,2 수 있습니다. 추가 DOC 화합물을 선택적으로 활성화 될 것으로 예상하고, 따라서에서 노 DOC의 개정과 세포에 비 응답 전지보다 BrdU의 설립 높은 수준의 (HI 세포)를 가지고 있습니다 사용할 수 있습니다 24 시간 보육, bacterioplankton 통해 또한 컨트롤 (낮은 BrdU의 설립 세포, LI 전지). 형광 면역 후, HI 전지는 구별하고 육체적으로 형광 활성 세포 분류 (외과) 3 LI 세포 분리. 정렬 DOC - 반응 전지 (HI 세포)의 DNA가 추출 taxonomically PCR, 클론 라이브러리 구축 및 시퀀싱을 포함하여 rRNA 유전자 기반의 분석 이후 16를 통해 식별됩니다.

환경 bacterioplankton는 유기 탄소 (DOC) 화합물과 DNA 라벨 시약, bromodeoxyuridine (BrdU)를 해산 모델 incubated 있습니다. 그 후, DOC - 굴욕적인 세포는 형광 활성 세포 분류 (외과)를 사용하여 고가 BrdU의 설립에 따라 대량 지​​역 사회에서 분리됩니다. 이러한 전지는 다음 이후의 분자 분석에 의해 식별됩니다.

Bromodeoxyuridine (BrdU) 레이블과 녹아 유기 문화 독립적인 확인을위한 후속 형광 활성 세포 정렬 탄소 굴욕 Bacterioplankton

미생물은 수생 환경에서 수많은 용존 유기 탄소(DOC) 기질의 분해를 매개하는 주요 인자입니다. 하지만...

미생물은 수생 환경과 같은 곳에서 수많은 용존 유기 탄소 기질 또는 DOC 화합물의 분해를 매개합니다. DOC 변환에서 미생물의 역할을 완전히 이해하기 위해서는 이들의 분류학과 기능에 대한 동시 식별이 필요합니다. 본 영상에서는 수생 환경에서 특정 DOC 풀을 변환하는 유리 생활 박테리아 또는 박테리아 플랑크톤의 분류학적 식별 절차를 시연합니다.테스트 환경에서 수집한 수중 시료를 처리하고, 관심 화합물 및 신생 DNA와 활성 성장 세포에 통합되는 bromo deoxy uridine(BRDU)과 함께 배양합니다. 다음으로 BRDU가 표지된 박테리아 플랑크톤을 ZI가 결합된 anti BRDU 항체로 표지합니다. BRDU 표지 수준이 높은 박테리아 플랑크톤을 형광 활성 세포 분류법으로 분리합니다.그 후 분류된 세포에서 DNA를 추출하고, PCR 기반 16 s ribosomal RNA 유전자 분석 결과를 바탕으로 분류학적 동정을 수행합니다. 안녕하세요, 저는 켄트 주립대학교 생물과학과의 Chen Mao 교수님 연구실의 Steven Robbins입니다. 오늘 저와 동료는 수생 환경에서 DOC 분해 박테리아 플랑크톤을 동정하기 위한 배양 독립적 방법을 보여드리겠습니다.영양분 보충 후 박테리아 군집 DNA를 분석하는 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은, 매우 활성도가 높은 박테리아에 분석을 집중하고 휴면 상태이거나 성장이 느린 세포는 배제한다는 점입니다. 본 연구에서는 특정 DOC 화합물을 사용하는 박테리아 플랑크톤의 식별 과정을 보여줍니다. 하지만 이 방법은 다른 단일 DOC 화합물이나 조류 삼출물과 같은 DLC 그룹을 사용하는 박테리아 플랑크톤을 연구하는 데에도 적용될 수 있습니다.그럼 수중 샘플을 준비하여 시작하겠습니다. DOC 분해 박테리아 플랑크톤을 분석하기 전, 수중 샘플을 적절하게 처리해야 합니다. 여기에 표시된 샘플은 조지아 해안에서 채집되었으며, 수중 샘플에서 큰 입자와 ER VRE를 제거하는 과정이 필요합니다.연동 펌프를 사용하여 수집 카보이에서 1 µm 공극 크기의 필터가 장착된 여과 장치로 물을 옮깁니다. 그다음, 여과액 36 mL씩을 멸균된 50 mL 폴리프로필렌 튜브 3개에 각각 분주합니다. 각 튜브에는 새로 준비한 10% Paraformaldehyde 용액 4 mL가 들어 있어야 합니다. 배양 후 세포를 보존하기 위해 상온에서 2시간 동안 배양합니다.0.22 µm 공극 크기의 흰색 멤브레

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

그들은 kHz에서 속도 저렴 picoliter, 자기들에게만 혈관을 생성할 수 있기 때문에 비말 기반 microfluidic 플랫폼은 높은 처리량 실험을위한 유망한 후보자 있습니다. 빠르고, 민감하고 고해상도 형광 spectroscopic 방법과의 통합을 통해 이러한 시스템 내에서 발생하는 정보의 다량은 효율적으로 추출 무력화하고 이용하실 수 있습니다.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

세포주기 단계의 진행과 속도론의 추적 미묘한 변화는 Propidium 요오드화물의를 통해 BrdU 및 전체 게놈의 DNA의 염색법과 핵산의 대사 라벨링의 조합을 사용하여 수행할 수 있습니다. 이 방법은이를 차례로 세포주기의 진행에 영향을 미치는가 아닌 특정의 DNA 손상의 도입을 방지, 자전거 전지의 화학 동기화의 필요성을 방지합니다.

신진 대사 레이블 및 유동세포계측법와 세포주기 진행의 동력학 측정

염색체 복제 타이밍 분석을위한 정량 방법 설명되어 있습니다. 방법은 형광와 함께 BrdU의 설립을...

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

이 동영상은 세포 증식을 측정하기 위해 브로모데옥시우리딘(BrdU)을 사용한 포유류 세포의 단계적 펄스 라벨링 분석에 대해 설명합니다. BrdU 흡수를 통해 세포를 동기화할 필요 없이 특정 시점에 합성 단계에 있던 세포를 시간적으로 추적할 수 있습니다.

Bromodeoxyuridine 펄스 라벨링 분석: 세포 증식을 측정하는 기법

이 동영상은 BrdU 면역형광 염색 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술을 사용하면 세포주기의 여러 단계에서 세포를 식별 할 수 있습니다. DNA 염료 및 항체 표지를 추가하면 나중에 S기 세포의 운명을 자세히 분석할 수 있습니다.

BrdU 면역형광 염색: 세포 주기의 여러 단계에서 세포를 식별하는 기술

이 프로토콜은 특정 시점에서 S 상에 있었던 셀의 시간 추적을 허용 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 흡수의 사용을 설명한다. DNA 염료 및 표지 항체의 첨가는 이후 시간에 S 상 세포의 운명의 상세한 분석을 용이하게한다.

동기화를 필요로하지 않고 유동 세포 계측법을 사용하여 세포주기 진행의 시간적 추적

레이저는 자주 DNA 손상에 대한 세포 반응의 연구에 사용된다. 그러나, 이들은 그 공간, 주파수 및 복제 충돌 포크 거의없는 것을 특징으로 병변을 생성한다. 여기서, 우리는 레이저의 국소 interstrand 가교 이러한 매개 변수의 결정을 가능하게하는 방법을 설명한다.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

여기에 제시된 것은 높은 정밀도와 분류학적 분해능으로 수생 약탈 진핵생물의 방목 속도를 정량화하는 단일 세포, epifluorescence 현미경 기반 기술에 대한 프로토콜입니다.

수생 생태계에서 유기 탄소 흐름의 새로운 경로를 밝히기 위해 추적자로 형광으로 분류 된 박테리아

이 프로토콜은D2O대사의 단일 세포 자극 라만 산란 이미징에 의해 2.5시간 이내에 신속한 항균 감수성 테스트(AST) 분석을 제공합니다. 이 방법은 소변 또는 전혈 환경의 박테리아에 적용되며, 이는 클리닉에서 신속한 단일 세포 표현형 AST를 변형시킵니다.

단일 박테리아에 혼입된 중수소의 자극된 라만 산란 이미징에 의한 신속한 항균 감수성 테스트

본 프로토콜에서, 우리는 면역 형광 기지를 둔 방법을 사용하여 세포 주기의 S/G2 단계 도중 DNA 이중 가닥 말 절제술을 구상하는 방법을 보여줍니다.

세포 주기 차별 화상 진찰과 결합된 BrdU DNA 라벨링을 사용하여 글로벌 DNA 이중 가닥 끝 절제술의 평가

여기서 우리는 단일 세포에서 다중 노화 관련 마커의 시각화 및 정량화를 위한 유세포 측정 기반 방법을 제시한다.

치료 유도 노인성 암 세포에서 다중 형광 노화 마커의 동시 이미징 및 유동 세포 측정 기반 검출

배우세요 BrdU 레이블링과 FACS를 이용한 수중 환경에서 용존 유기탄소 분해 세균 동정 방법. 이 기술은 활성 세균을 분리하여 미생물 생태학 및 탄소 순환 연구에 활용됩니다.

Bromodeoxyuridine (BrdU) 레이블과 녹아 유기 문화 독립적인 확인을위한 후속 형광 활성 세포 정렬 탄소 굴욕 Bacterioplankton

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