Name: ReAsH / 플래시 라벨링 및 전지 Tetracysteine 센서 단백질의 이미지 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 학습하세요 생세포에서 테트라시스테인 태그 단백질을 FlAsH 및 ReAsH로 라벨링하고 공초점 현미경으로 이미지를 수집한 후 ImageJ로 정량 분석하는 방법을. 이 기술은 단백질 구조 변화와 올리고머 상태를 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 DMH와 TDM (NHMRC 프로젝트 보​​조금)에 부여로 투자했다. DMH는 미건야 트러스트에 의해 자금을 그림 웨이드 연구원입니다.

1. ReAsH / 플래시 라벨에 대한 세포의 준비 <ol><li> 관심의 세포 라인에 대한 표준 세포 배양 방법을 사용하여 직접 transfection 준비 라이브 셀 이미징 슬라이드에 자기편 세포의 문화를 준비합니다. </li><li> 선택의 transfection 방법에 따라 관심의 플라스미드가 포함된 TC - 태그 유전자를 Transfect. </li></ol> TC 태그에 특정 바인딩의 범위를 평가하고 공촛점 micrographs를 수집하면 채널 사이에 형광 bleedthrough에 대한 평가에 긍정적이고 부정적인 컨트롤을 사용하는 것이 중요합니다. 따라서, 두 색상 (예 : 플래시 / 체리 또는 ReAsH / CFP 또는 ReAsH / GFP 조합)에 대한 샘플은 단일 색상 (예 : 형광 단백질 혼자 또는 가능한 경우없이 형광등 플래시 / ReAsH 이에 바운드 TC - 태그 단백질에 대한 준비가되어 확인 단백질) <ol start="3"><li> 하나하는 데 이틀이 transfection 후 부드럽게 HBSS (37 ° C에서) 300 μL 사전 예열로 세포를 씻어. </li><li> 부드럽게 prewarmed HBSS와 10 μm의 1,2 - ethanedithiol (동부 서머 타임) 300 μL 1 μm의 플래시 (또는 ReAsH)로 세포를 잠그다. </li></ol> 세포에 추가하기 위해 플래시 / ReAsH를 추가하기 전에 동부 서머 타임을 추가하고 방금 전에 버퍼를 만드는 것이 중요합니다. 37 ° 조직에서 C 문화 인큐베이터에서 정확히 30 분 알을 품다. 우리의 경험을 더 이상 배양 시간이 크게 배경 형광을 증가시킵니다. 새로운 구조는 또한 시간 및 Flash / ReAsH 농도 (0.5-2 μm의) 라벨에 최적화된해야합니다. <ol start="5"><li> 부드럽게 300 μL prewarmed HBSS + 250 μm의 37 15 분에 대한 2,​​3 - dimercaptopropanol (BAL) ° C.로 교체 후 세포에서 솔루션을 라벨링 기음과 </li><li> 부드러운 열망으로 솔루션을 씻고 300 μL prewarmed HBSS로 교체 제거합니다. </li></ol> 우리가이가 아닌 특정 biarsenical 염료의 형광을 증가시킬 수있다는 것을 발견했지만이 세척 후, 세포는 paraformaldehyde (3.2 %의 솔루션으로 15 분)에 고정 수 있습니다. 따라서 우리는 일반적으로 이미지 세포는 실온에서 살고있다. (라벨이 biarsenical 염료 바인딩을 방지하기 전에 세포의 고정을합니다.) 2. 공촛점 현미경의 영상은 세포 <ol><li> 공촛점 현미경에서 이미징 개별 fluorophores (표 1 참조)에 대한 매개 변수를 설정하고 채널 간의 무시할 bleedthrough이있다는 것을 확인하십시오. 이것은 형광 각각 다른 형광 수집 설정에 대한 개별 fluorophores을 (제어 샘플)를 선택하여 얻을 수 있습니다. 방출 파장 범위를 조정하면 (이것은 또한 신호 / 잡음을 줄일 수 있지만) bleedthrough을 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다. </li><li> 또한 예제에서 최대 형광이 탐지기를 포화하지 않도록 photomultiplier 설정을 조정합니다. (이것은 SP2 Leica 공촛점에있는 Q - LUT 설정을 사용하여 감지 수 있습니다.) 일단 최고의 영상 설정이 결정되며, 샘플 간의 그들 중 하나를 변경하지 마십시오. </li><li> 우리가 일반적으로 사용하는 다른 설정 (이가 최적화할 수 있지만) 200 Hz의 스캔 속도이며, 4 린 평균 1 에어리 단위의 핀홀 직경를 수집합니다. 핀홀 직경은 신호 / 노이즈가 문제가있다면하지만,이 영상의 일부 손실을 초래할 수 확장 될 수 있습니다. </li><li> 가능하면 12 비트 (또는 이상) 형식으로 공촛점 이미지를 수집합니다. 12 비트 포맷은 8 비트 (0-255)보다 각 픽셀 강도에 대한 값 (0-4095)의 큰 다이나믹 레인지를 캡처합니다. 이것은 가장 부유한 데이터 세트가 정량 데이터 분석의 품질을 극대화하는, 기록 확보하는 것이 중요합니다. </li><li> 형광 단백질 채널 (체리, GFP 또는 CFP)와 또한 모든 샘플에 대한 biarsenical 염료 채널 (플래시 또는 ReAsH)에 대한 이미지를 수집합니다. </li></ol> 3. 데이터의 분석 <ol><li> 컴퓨터 8 소프트웨어 ImageJ를 설치합니다. <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </li><li> ImageJ의 버전은 다음과 같은 플러그인이 있는지 확인합니다 : <ul><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/file-opener.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/image_correlator.html</a> </li><li> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lut-editor.html</a> </li></ul></li><li> 오픈 ImageJ 및 v1.32c보다 오래된 버전을 사용하는 경우, 여러 개의 이미지를 한 번 (당신이 다른 파일을 클릭하면서 어떤이 컨트롤 버튼을 누른하여 수행할 수 있습니다)에서 열 수 있도록 다음과 같은 옵션을 클릭합니다 : <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"></li><li> ImageJ에 대한 관심의 이미지를 엽니다. ImageJ는 자동으로 별도로 각각의 이미지를 화면에 표시되는 최대 및 최소 픽셀 농도를 정의합니다. 서로 다른 이미지가 D가됩니다 감안할 때ifferent 픽셀 농도,이 조회로 표시된 이미지가 비교되지 않습니다 것을 의미합니다. </li><li> 열린 이미지가 같은 규모의 모든 있도록하기 위해서는 물리적으로 상부를 정의할 수 있으며, 낮은 픽셀 농도는 (이것은 다른 소프트웨어의 경우 것입니다 같은 이미지의 실제 데이터 내용을 변경하지 않습니다) 볼 수 있습니다. 이러한 값은 다음과 같은 메뉴에서 설정할 수 있습니다 : <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"></li><li> 다른 접근 방식은 같은 규모로 스택에 (볼) 모든 이미지를 하나의 파일에 모두 함께 이미지를두고 자동으로 규모 것입니다 스택에서 작동하는 것입니다. 데이터 작업하는 가장 쉬운 방법은 스택 각 채널을 변환하는 것입니다. 따라서, 형광 단백질 채널과 같이 스택에 대한 모든 변환합니다. 당신은 쉽게 제목에 일반적인 이름 (예 : "ch00")가 포함된 모든 이미지를 쌓아하여 하나의 채널을 선택할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"></li><li> 이제 분석을 위해 8 비트로 열려있는 모든 이미지를 변환합니다. 이것은 실제로 0-255 범위 (8 비트를 정의하는)에 조회 범위를 rescale 것입니다. 중요 : 원래 12 비트 (또는 이상) 형식을 통해 저장하거나 정보 콘텐츠를 잃게됩니다하지 마십시오. 이 형식은 그림 등을 만드는 데 유용합니다 때문에 일부 소프트웨어 패키지는 8 비트 이미지를 표시할 수 있습니다 <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"></li><li> 옵션 "으로 ... 저장"을 사용하여 "8 비트 변환"라는 새 폴더에 복사본을 저장합니다. </li><li> 전체 이미지 biarsenical 염색 바인딩의 범위를 조사하는 한 가지 방법은 픽셀 강도 상관 계획을 수행하는 것입니다. 두 번째 채널에 해당 픽셀의 가치에 상대적으로 하나의 채널이 플롯은 모든 픽셀 값. 고친이있다면 따라서 CFP 형광 높은 픽셀 위치도 ReAsH의 형광 높은 것입니다. </li><li> 공동 상관 픽셀을 분석하기 위해 8 비트 ReAsH 및 세룰리안 / GFP 이미지 ImageJ에서 열려 있는지 확인하십시오. </li><li> 아래 표시된대로 '이미지 상관기 "플러그인을 엽니다. ReAsH 또는 Flash 스택과 형광 단백질 스택으로 "Image2"로 "Image1"를 선택하십시오. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step5.jpg" alt="그림 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"></li><li> 그 결과 스택은 모든 자세한 정보를 표시하지 않을 수 있습니다 -이 정상입니다. "Scatterplots"라는 새 폴더에 스택을 저장하고 그것을 그것이 참조하는 샘플과 동일한 파일 이름을 지정 (예 : "플래시 - 체리 상관 줄거리") </li><li> 데이터를 보려면 의미 당신은 두 가지 옵션 중 하나를 할 수 있습니다. 이 로그 형식으로되어 있도록 먼저 데이터를 변환. 그렇다면 시각적으로 다음과 같이 데이터를 rescale : <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step6.jpg" alt="그림 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 6"></li><li> 또는, 당신은 단지 낮은 값을 표시 (예 : 1-255)과 특수 LUT를 사용하여 데이터를 표시하는 시각 데이터를 rescale 수 있습니다. LUT가 (테이블을 보라) 이미지에서 각 픽셀 값에 할당된 색상의 테이블을 나타냅니다 . 이것은 이미지에 대한 pseudocolor 스키마를 정의하는 데 사용하고 이미지의 특정 기능을 정의하는 데 유용합니다 수 있습니다. "LUT 편집기"에 대한 사용자 정의 LUT 클릭을 만들고 같은 (이것은 저장하고 나중에 사용할 수 있습니다) 그림과 같이 새로 만들 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step7.jpg" alt="그림 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 7"></li><li> 0-255에서 밝기 / 대비 범위 (위의 단계 13에서 설명한) 설정합니다. 화면에 표시된 것과 같은 이미지 "에서 잠금"이미지가 각 픽셀의 빨강, 녹색 및 파랑 색상의 각 8 비트 값을 저장 RGB 형식으로 변환할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step8.jpg" alt="그림 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 8"> 다른 프로그램에 이미지를 복사하여 붙여 넣으려면 먼저 8 비트 또는 16 비트 이미지를 엽니다. 위의 14 단계에서 설명한 이미지 LUT 색 구성표를 지정합니다. CFP 들어, 아래에 설명된 "청록색"LUT를 지정 ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step9.jpg" alt="그림 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 9"></li><li> 이미지를 선택하고 클립 보드에 복사를 선택 ... <img src="/files/ftp_upload/2857/2857step10.jpg"></li></ol> 4. 대표 결과 : biarsenical 염료와 라벨링 세포의 성공은 몇 가지 주요 매개 변수에 따라 달라집니다. 먼저 염료와 라벨의 타이밍이 중요합니다. 우리가 찾은 그 상표의 연장 기간 (이상 30 분) 이외의 구체적인 배경 얼룩 높은 수준의 결과. 그림 1은 이전 7 설명한 것처럼 TC 태그를 포함하는 CFP 파생 세룰리안에 융합 huntingtin 조각의 야생 식 양식 (25Q)에 대한 전형적인 결과를 보여줍니다. 이 샘플은 ReAsH 30 분 스테인드 및 TC 태그를 부족 샘플에서 최소한의 배경이있다했습니다. 우리는 paraformaldehyde 증가의 배경으로 세포를 고정하는 것은 메탄올로 고정하면 형광 단백질 태그의 형광을 abrogates 동안 나타났습니다. 따라서 세포가 가능한 우리가 이미지를 살고 있습니다. 또한 그 전에 고정에 유의하는 것이 중요하다biarsenical 염료와 라벨을하면 TC 모티브로의 변경으로 인해 아마도 그들의 바인딩을 방지합니다. 일관성있는 결과를 또 다른 중요한 요인은 세포의 밀도입니다. 우리는 느슨하게 배포되고 또한 광범위한 clumping 다른 세포에 biarsenical 염료의 고르지 얼룩으로 이어질 수있는 이미지 세포에 중요한 발견했다. <img src="/files/ftp_upload/2857/2857fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Tetracysteine ​​태그와 huntingtin (exon1 - 25Q) 세룰리안 fusions와 함께 살고 transfected 세포 ReAsH 염색법. TC 태그는 huntingtin - 세룰리안 융합합니다 (7 설명)의 교차점에 위치하고 있습니다. 픽셀 강도 상관 줄거리는 세포를 통해 바인딩 ReAsH의 차이에 대한 평가를 가능하게하고 conformational 변경 또는 리간드 상호 작용에 의한 구속력 ReAsH의 변화를지도하는 데 사용할 수 있습니다.

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<li>Adams, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+biarsenical+ligands+and+tetracysteine+motifs+for+protein+labeling+in+vitro+and+in+vivo%3A+Synthesis+and+biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6063-6076 (2002).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat. Meth. 2, 905-909 (2005).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

두 번째 염료와 형광 단백질과 conformational 속성 레이블 단백질 지방화에 대한 접근 방법은 단백질의 다양한 conformations가 세포와 단백질 형태의 역학을 변경 이벤트에 발생한 위치를 매핑에 대한 많은 가능성을 제공합니다. ReAsH / 플래시 먼저 포유 동물 세포 retinoic 산성 바인딩 단백질 I 4 단백질 접힘에 대한의 세포 센서로 사용되었다. 이 예제에서는 TC 태그에 바운드 플래시 제가 펼쳐 양식에 상대적으로 접힌 형태의 형광 수율 감소했다 세포 retinoic 산성 바인딩 단백질로 설계하고, 접는는 E.으로 추적할 수 대장균 세포. 최근에는 단백질 접힘과 자기 협회는 bipartite tetracysteine ​​표시 6 모델 단백질에서 시연되었다. 이 예제에서는 모델 펩티드의 말초 dicysteine​​ 쌍은 dicysteine​​ 쌍을 포함하는이 펩티드의 결합시 또는 바인딩 biarsenical 염료에 대한 기능 tet...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> μ - 슬라이드 8 - 잘 </td><td> Ibidi </td><td> 80,826 </td><td> 우리는이 챔버는 이미징을위한 culturing 세포에 특히 유용하는 슬라이드 찾습니다. </td></tr><tr><td> TC - 플래시 II Tetracysteine​​ 태그 감지 세포에서 키트 * 녹색 형광 * 살 세포 이미징 </td><td> Invitrogen </td><td> T34561 (플래시) 또는 T34562 (ReAsH) </td><td></td></tr><tr><td> 행크스 &#39;밸런스드 소금 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 14175-103 </td><td></td></tr><tr><td> 2,3 - Dimercapto -1 - 프로파놀 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> D1129 - 5ML </td><td></td></tr><tr><td> 1,2 - Ethanedithiol </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> 02390 - 25ML </td><td></td></tr></tbody></table>

reash / 플래시 라벨링 및 전지 tetracysteine​​ 센서 단백질의 이미지 분석

ReAsH/FlAsH Labeling and Image Analysis of Tetracysteine Sensor Proteins in Cells

형광 단백질 및 염료는 세포에있는 단백질 밀매, 현지화 및 기능 연구에 필수적인 도구입니다. 같은 녹색 형광 단백질 (GFP)로 형광 단백질이 광범위 작은 태그는 같은 conformational 변화로 세포 검사로 단백질의 새로운 기능을 활성화와 관심 1 단백질의 속성, 최근 발전을 추적하는 단백질을 융합 파트너로 사용되었습니다 동안 그리고 단백질 협회 2, 3. 작은 태그 시스템은 유전자 biarsenical 염료에 바인딩 대상 단백질에 삽입 tetracysteine의 모티브 (CCXXCC)를 포함, ReAsH (적색 형광) 심지어이 살고 세포에 높은 특이성과 플래시 (녹색 형광). TC / biarsenical 염료 시스템은 conformational 변화와 단백질 - 단백질 상호 작용 4-7를 측정하는 여러 가지 새로운 방법을 사용할 수 있습니다 형광 단백질보다 호스트 단백질을 훨씬 덜 steric 제약을 제공합니다. 우리는 최근에 돌연변이 huntingtin을 표현하는 세포의 oligomerization의 센서로 TC 태그의 소설 응용 프로그램을 개발하는 헌팅턴 질병 7 뉴런에서 집계를 변이된 경우. Huntingtin은 두 개의 형광 염료, 하나 단백질 위치를 추적할 수있는 형광 단백질에만 단량체의 biarsenical 염료를 바인딩 두 번째 TC 태그 적었습니다. 따라서, 단백질과 biarsenical 염료 반응성 사이 colocalization의 변화는 공간 세포 내에서 매핑하는 submicroscopic 올리고머 컨텐츠를 활성화. 여기, 우리는 플래시 또는 ReAsH 라이브 포유 동물 세포와 방법을 두 가지 색상의 형광 (체리 / 플래시, CFP / / 플래시 또는 GFP를 수치와 형광 단백질 (체리, GFP 또는 CFP)로 융합 TC - 태그 단백질을 분류하는 방법에 대해 설명합니다 ReAsH 조합).

biarsenical 염료 플래시와 ReAsH 단백질의 tetracysteine​​ 주제에 구체적으로 바인딩하고 선택적으로 살 세포에 단백질을 분류하실 수 있습니다. 최근에이 상표 전략은 다른 단백질 conformations 또는 oligomeric 상태에 대한 센서를 개발하는 데 사용되었습니다. 우리는 라벨 접근 방식을 설명하고 방법은 양적 바인딩을 분석합니다.

ReAsH / 플래시 라벨링 및 전지 Tetracysteine​​ 센서 단백질의 이미지 분석

형광 단백질과 염료는 세포 내 단백질 수송, 국소화 및 기능을 연구하는 데 필수적인 도구입니다. 형광 단백질은...

본 실험 절차의 전반적인 목적은 tetra cysteine 및 형광 표지가 된 단백질을 발현하는 세포를 flash 또는 ash 염료로 표지하고, 그 결과를 정량적으로 분석하는 것입니다. 이를 위해 우선 형광 단백질과 tetra cysteine 태그가 포함된 표적 단백질을 운반하는 플라스미드를 대상 세포주에 형질전환합니다. 그 다음, 발현된 단백질을 R 또는 flash로 표지하고, BAL로 세척하여 비특이적으로 결합된 염료를 제거함으로써 현미경 이미징을 준비합니다.그 다음 공초점 현미경을 사용하여 ash 또는 flash 및 형광 단백질 채널의 세포 형광 이미지를 수집합니다. 마지막으로, Image J를 사용하여 이미지를 분석함으로써 표적 단백질에 대한 ash 또는 flash의 결합 정도를 정량화합니다. 최종적으로, ash 형광과 형광 단백질 형광의 상관관계를 통해 세포 내 표적 단백질에 대한 ash 또는 flash의 결합 정도를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.단순히 GFP를 표적 단백질과 함께 발현시키는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 단백질의 국소화뿐만 아니라 구조적 변화와 같은 단백질의 두 번째 특성을 추적할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 TAC의 결합 또는 해리 능력을 변화시키는 층판 형성 이벤트, 구조적 변화 및 LI 결합 이벤트와 같이 단백질 하부 구조 및 기능 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저희는 세포 내에서 헌팅틴(Huntington) 단백질의 미세한 하위 현미경적 다량체(polygamous)가 어떻게 형성되는지 평가하고자 했을 때 처음으로 이 방법 아이디어를 얻었습니다.데이터 분석 단계는 기술적으로 복잡하여 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 실험 절차를 시연하겠습니다. 1단계부터 3단계까지는 저희 연구실의 연구 보조원인 Yasmin Ranson이 데이터 분석을 시연할 것입니다. 4단계는 저희 연구실의 대학원생인 Sevki GaN이 진행하겠습니다. 관심 있는 세포주에 대해 표준 세포 배양법을 사용하고, 형질전환 준비가 된 살아있는 세포 이미징 슬라이드를 사용하십시오.관심 있는 TC 태그 유전자를 포함하는 플라스미드를 트랜스펙션할 부착 세포 배양액을 준비하십시오. 선택한 트랜스펙션 방법에 따라 진행합니다. TC 태그에 대한 특이적 결합 정도를 평가하고, 공초점 현미경 사진을 수집할 때 채널 간의 형광 누설(bleed-through)을 평가하기 위해 양성 및 음성 대조군을 설정하는 것이 중요합니다. 따라서 두 가지 색상을 사용하는 경우, 형광 단백질 단독 또는 가능한 경우 형광 물질에 결합된 T ctech 단백질 등 단일 색상에 대한 샘플이 준비되었는지 확인하십시오.단, 형광 단백질은 제외합니다. transfection 1~2일 후, 미리 데워둔 300 µL의 Hank's balanced salt solution 또는 HBSS로 세포를 부드럽게 헹굽니다. 10 µM의 1,2-ethanedithiol(EDT)과 1 µM의 ASH가 포함된 신선한 prewarm HBSS를 준비하십시오. 세포에서 HBSS를 제거한 후, 300 µL의 ASH 배지로 조심스럽게 교체하고 조직 배양 인큐베이터에서 37 °C로 정확히 30분 동안 배양합니다.저희의 경험에 따르면, 배양 시간이 길어질수록 배경 형광이 상당히 증가합니다. 세포에서 라벨링 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 250 µM의 two three dimer, cap propanol 또는 BAL이 포함된 37 °C로 예열된 HBSS 300 µL로 교체하여 15분 동안 처리합니다. 세척 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거한 후, 예열된 HBSS 300 µL로 교체합니다.이 세척 단계 이후에 세포를 파라포름알데히드로 고정할 수 있으나, 이 경우 비특이적 배경 형광이 증가하는 것을 확인하였습니다. 따라서 당사는 보통 상온에서 살아있는 세포를 이미징합니다. 또한, 표지 전 세포를 고정하면 dye 결합이 방해됩니다.공초점 현미경으로 세포 이미징을 시작하려면, 개별 형광 표지를 이미징하기 위한 파라미터를 설정하고 채널 간의 블리드스루(bleed through)가 거의 없는지 확인하십시오. 다음으로, 시료의 최대 형광 강도가 검출기를 포화시키지 않도록 광전자 증배관(photo multiplier) 설정을 조정하십시오. 최적의 이미징 설정이 결정되면, 시료 간에 설정을 변경하지 마십시오.스캔 속도는 200 hertz로 설정하고, 4회의 라인 평균값을 수집하며, 핀홀 직경은 1 area unit으로 설정합니다. 신호 대 잡음비가 문제가 될 경우 핀홀 직경을 확장할 수 있습니다. 다만, 이로 인해 이미지 해상도가 일부 저하될 수 있습니다.가능한 경우 컨포컬 이미지를 12비트 이상의 형식으로 수집하십시오. 이는 정량적 데이터 분석의 품질을 극대화하기 위함입니다. 모든 샘플에 대해 형광 단백질 채널과 BI arsenal 염색 채널의 이미지를 각각 수집하십시오.데이터를 분석하려면 다음 플러그인이 포함된 Image J 소프트웨어를 사용하십시오. 1.32 C 이전 버전의 Image J를 사용하는 경우 다음 옵션을 클릭하십시오. 여러 이미지를 동시에 열 수 있도록 하려면, edit options input slash output에서 j file chooser to open slash share 사용 확인란을 클릭하십시오.확인을 클릭하십시오. 분석할 이미지를 엽니다. 이미지마다 픽셀 강도가 다르기 때문에, Image J는 각 이미지에 대해 화면에 표시될 최대 및 최소 픽셀 강도를 자동으로 정의합니다.이는 표시된 이미지들을 보는 그대로 비교할 수 없음을 의미합니다. 열린 이미지들이 모두 동일한 척도로 표시되도록 하려면, 볼 이미지의 상한 및 하한 픽셀 강도를 물리적으로 정의하십시오. 이 값들을 설정하려면, image 메뉴에서 brightness/contrast를 조정하십시오.Set을 클릭하고, 표시될 최소값과 최대값을 정의하십시오. 그런 다음 'propagate to all open images'를 선택하고 확인을 클릭하십시오. 또는 특정 채널의 모든 이미지를 하나의 파일이나 스택으로 함께 배치하십시오.그 후 Image J가 모든 이미지의 배율을 동일하게 자동으로 조정합니다. 이를 위해 'image stacks'에서 'images to stack'을 선택하고, 각 파일에 공통으로 적용될 이름을 입력한 후 'used titles as labels'를 선택하십시오. 확인을 클릭합니다.분석을 위해 열려 있는 모든 이미지를 8비트로 변환하십시오. 이미지 유형을 8비트로 선택하면 표시 범위가 0에서 255 사이의 구간으로 재조정됩니다. 정보 손실이 발생하므로 기존의 12비트 이상의 고해상도 형식 위에 그대로 저장하지 않는 것이 중요합니다.'다른 이름으로 저장' 옵션을 사용하여 'eight bit converted'라는 새 폴더에 복사본을 저장하십시오. 전체 이미지에서 bi arsal dye 결합 정도를 조사하는 한 가지 방법은 픽셀 강도 상관관계 플롯(pixel intensity correlation plot)을 수행하는 것입니다. 이 플롯은 한 채널의 모든 픽셀 값을 두 번째 채널의 해당 픽셀 값과 상대적으로 나타냅니다.따라서 결합도가 높다면 GFP 형광이 강한 픽셀 위치에서 ash 형광 또한 강하게 나타날 것입니다. 픽셀 상호 상관관계를 분석하려면 8비트 REA 및 GFP 이미지가 ImageJ에 열려 있는지 확인하십시오. 그다음, Plugins > Image Correlator를 선택하여 이미지 상관분석 플러그인을 엽니다. 이미지 파일을 각각 Image 1과 Image 2로 지정하십시오.그런 다음 확인을 클릭하십시오. 결과 스택에 상세 정보가 표시되지 않을 수 있으며, 이는 정상입니다.scatterplots라는 새 폴더에 스택을 저장하고, 참조하는 샘플과 동일한 파일 이름을 지정하십시오. 예를 들어, Ash GFP Correlation plot입니다. 데이터를 확인하려면 다음 두 가지 옵션 중 하나를 선택하십시오.먼저, process math log auto를 선택하여 데이터를 로그 형식으로 변환하십시오. 그다음 데이터를 시각적으로 재조정하기 위해 image adjust brightness slash contrast를 클릭하고 auto를 선택하십시오. 둘째, 낮은 값만 표시되도록 데이터를 시각적으로 재조정하고, 특수 룩업 테이블(LUT)을 사용하여 데이터를 표시함으로써 사용자 정의 LUT를 생성하십시오.매우 간단한 LUT를 만들기 위해 이미지 색상 편집 LUT를 클릭하십시오. 왼쪽 상단 픽셀을 클릭하고 검은색을 선택하십시오. 그런 다음 오른쪽의 다음 픽셀을 선택하고 빨간색을 선택하십시오.다음으로, 세 번째 픽셀을 클릭하고 마우스 버튼을 누른 상태에서 선택 영역을 오른쪽 하단 픽셀까지 드래그합니다. 빨간색을 선택하고 확인을 클릭한 후, 흰색을 선택하고 확인을 클릭합니다. 앞서 설명한 대로 밝기/대비 범위를 0에서 255로 설정하여 화면에 표시된 이미지로 고정합니다.다른 프로그램으로 이미지를 복사하여 붙여넣으려면 RGB 형식으로 변환하십시오. 먼저, 앞서 설명한 대로 8비트 또는 16비트 이미지를 엽니다. GFP에 대해 LUT 색상 체계를 이미지에 할당하십시오.이미지를 클릭하여 녹색 LUT를 할당합니다. 룩업 테이블(Look up tables) 녹색을 선택하십시오. 마지막으로 복사할 이미지를 선택하여 클립보드에 복사합니다. '편집 > 시스템으로 복사'를 선택하면, 이 그림은 30분 동안 염색한 GFP 및 TC 태그가 융합된 전형적인 kinase sock 결과를 보여줍니다.HEC 2 9 3 세포에서 ash를 사용했을 때, ASH는 TC 태그가 부착된 표적 단백질에 높은 친화력으로 효율적으로 결합하는 것으로 보입니다. 반면, 이 그림은 GFP와 융합되었으나 TC 태그가 없는 SARK의 해당 대조군 샘플을 보여주며, 이는 TC 태그의 특이성과 배경 염색 수준을 모두 검증하는 데 필수적입니다. 이 결과는 RH가 TC 태그가 없는 표적 단백질과는 반응성이 없음을 보여주며, 이는 SSH 결합에 대한 TC 태그의 특이성을 나타냅니다.이 절차를 수행할 때는 세포가 합류(confluence)되어 정체되지 않도록 하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 세포 내 V 결합에 영향을 줄 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 데이터를 정량적으로 분석하는 간단한 방법을 충분히 이해하게 될 것이며, 이러한 방법들을 개선하여 데이터 시각화를 위한 자신만의 고유한 IUTS를 개발할 수 있습니다.

reashflash-labeling-image-analysis-tetracysteine-sensor-proteins

Research

연구

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Biology

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