ReAsH / 플래시 라벨링 및 전지 Tetracysteine​​ 센서 단백질의 이미지 분석

이 절차의 전반적인 목표는 테트라 시스테인과 형광 표지 단백질을 발현하는 세포에 염료 플래시 또는 회분으로 표지하고 결과를 정량적으로 분석하는 것입니다. 이는 형광 단백질을 운반하는 플라스미드와 테트라 시스테인 태그를 포함하는 표적 단백질을 관심 세포주에 먼저 transection하여 수행됩니다. 다음으로, 발현된 단백질을 R 또는 플래시로 표지하고, 비특이적으로 결합된 다이어트는 BAL로 세척하여 제거하여 현미경 이미징을 준비합니다.

그런 다음 컨포칼 현미경을 사용하여 재 또는 섬광 및 형광 단백질 채널이 있는 세포의 형광 이미지를 수집합니다. 마지막으로, 표적 단백질에 대한 회분 또는 플래시의 결합을 정량화하기 위해 이미지 J를 사용하여 이미지를 분석합니다. 궁극적으로, 회분 형광과 형광 단백질 형광의 상관관계를 통해 세포의 표적 단백질에 대한 회분 또는 플래시 결합의 정도를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다.

단순히 GFP를 가진 표적 단백질을 가지고 가기 같이 기존하는 방법에 이 기술의 주요 이점은, 그것 이외에 구조상 변화와 같은 단백질의 두번째 재산을 지역화 이외에 추적할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 회분 또는 섬광을 금지하는 TAC의 능력을 변경하는 변화 이벤트, 구조적 변화 및 LI 결합 이벤트와 같은 단백질 하부구조 및 기능 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 세포에서 어떻게 작은 미세한 이하의 헌팅턴(Huntington)이 일부다처제를 형성하는지 평가하고 싶었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다.

데이터 분석 단계는 기술적으로 복잡하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 실험 절차를 시연합니다. 첫 번째부터 세 번째 단계까지는 우리 연구실의 연구 조교인 Yasmin Ranson이 데이터 분석을 시연합니다. 4단계는 관심 세포주에 표준 세포 배양 방법을 사용하는 당사 연구실의 대학원생인 Sevki GaN과 transfection을 위한 라이브 셀 이미징 슬라이드입니다.

관심 있는 TC 태그 유전자를 포함하는 플라스미드를 transfection하는 부착 세포 배양을 준비합니다. 선택한 transfection 방법에 따르면, 컨포칼 현미경 사진을 수집할 때 채널 간 플루언스의 표백 흐름을 평가할 뿐만 아니라 TC 태그에 대한 특정 결합 정도를 평가하기 위해 positive 및 negative control을 갖는 것이 중요합니다. 따라서 두 가지 색상의 경우 형광 단백질 자체와 가능한 경우 다육에 결합된 T ctech 단백질 또는 형광 단백질이 없는 단색에 대해 샘플이 준비되었는지 확인하십시오

. 형질주입 1-2일 후, 300마이크로리터의 전쟁 전 행크 밸런스 염 용액 또는 HBSS로 세포를 부드럽게 헹구고, 10마이크로몰, 1, 2, et Ethan 디아 티올 또는 EDT 및 1마이크로몰 플래시 또는 재로 신선하고 예열 HBSS를 준비합니다. 그리고 세포에서 HBSS를 제거한 후 조직 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 정확히 30분 동안 300마이크로리터의 회분 배지 인큐베이트로 부드럽게 교체합니다.

우리의 경험에 따르면 배양 시간이 길면 배경 형광이 크게 증가합니다. 세포에서 라벨링 용액을 부드럽게 흡인하고 섭씨 37도에서 15분 동안 250마이크로몰, 2개의 3이량체, 캡 프로판올 또는 BAL이 있는 300마이크로리터의 예열 HBSS로 교체합니다. 부드러운 흡인으로 세척 용액을 제거하고 300마이크로리터의 예열 HBSS로 교체합니다.

이 세척 후, 세포는 파라폼 높이로 고정될 수 있지만, 이는 비특이적 냉소성 형광을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 따라서 우리는 일반적으로 실온에서 살아있는 세포를 이미지화합니다. 또한, 라벨링 전에 세포를 고정하면 bial dye 결합을 방지할

컨포칼 현미경에서 세포 이미징을 시작하려면 개별 형광단을 이미징하기 위한 매개변수를 설정하고 채널 사이에 무시할 수 있는 수준의 블리드가 있는지 확인합니다. 다음으로, 샘플의 최대 형광이 검출기를 포화시키지 않도록 사진 승수 설정을 조정합니다. 최상의 이미징 설정이 결정되면 샘플 간에 어떤 설정도 변경하지 마십시오.

200Hz의 스캔 속도를 사용하고, 4개의 라인 평균을 수집하고, 핀홀 직경을 1개 면적 단위로 설정합니다. 신호 대 잡음비가 문제가 되는 경우 핀홀 직경을 확장할 수 있습니다. 그러나 이로 인해 이미징 해상도가 약간 손실될 수 있습니다.

가능한 경우 12비트 이상의 형식으로 컨포칼 이미지를 수집합니다. 정량적 데이터 분석의 품질을 극대화합니다. 모든 샘플에 대한 형광 단백질 채널 및 BI 무기고 다이 채널에 대한 이미지를 수집합니다.

데이터를 분석하려면 다음 플러그인과 함께 Image J 소프트웨어를 사용하십시오. 버전 1.32 C 이전의 Image J 버전을 사용하는 경우 다음 옵션을 클릭합니다. 한 번에 여러 이미지를 열 수 있도록 하려면 옵션 입력 슬래시 출력을 편집하고 상자를 클릭하여 j 파일 선택기를 사용하여 슬래시 공유를 엽니다.

확인을 클릭합니다. 관심 있는 이미지를 엽니다. 이미지 J는 각 이미지에 대해 개별적으로 화면에 표시되는 최대 및 최소 픽셀 강도를 자동으로 정의하는데, 이는 서로 다른 이미지가 서로 다른 픽셀 강도를 갖기 때문입니다.

이는 표시된 이미지가 본 것과 비교할 수 없음을 의미합니다. 열린 이미지가 모두 동일한 축척에 있도록 하려면 볼 상부 및 하부 픽셀 강도를 물리적으로 정의합니다. 이 값을 설정하려면 이미지를 선택하고 밝기 슬래시 대비를 조정합니다.

세트를 클릭하고 표시된 최소 및 최대 값을 정의합니다. 그런 다음 열려 있는 모든 이미지에 전파를 선택하고 확인을 클릭합니다. 또는 특정 채널의 모든 이미지를 단일 파일 또는 스택에 함께 배치합니다.

그러면 이미지 J가 모든 이미지를 동일한 배율로 자동 조정합니다. 이렇게 하려면 스택할 이미지 스택을 선택하고, 각 파일에 공통된 이름을 입력하고, 사용된 제목을 레이블로 선택합니다. 확인을 클릭합니다.

분석을 위해 열려 있는 모든 이미지를 8비트로 변환합니다. 이미지 유형 8비트를 선택하면 본 범위가 0에서 255 간격으로 다시 조정됩니다. 원래 12비트 이상 형식으로 저장하면 정보 콘텐츠가 손실되므로 저장하지 않는 것이 중요합니다.

save as 옵션을 사용하여 8bit converted라는 새 폴더에 복사본을 저장합니다. 전체 이미지에서 bi-arsal 다이 바인딩의 정도를 검사하는 한 가지 방법은 픽셀 강도 상관 관계 플롯을 수행하는 것입니다. 이 플롯은 두 번째 채널의 해당 픽셀 값을 기준으로 한 채널의 모든 픽셀 값을 기준으로 합니다.

따라서 GFP 형광이 높은 픽셀 위치는 결합이 높은 경우 ash 형광에서도 높습니다. 픽셀 공동 상관 관계를 분석하려면 8비트 REA 및 GFP 이미지가 이미지 J에서 열려 있는지 확인합니다.그런 다음 플러그인 이미지 상관기를 선택하여 이미지 상관기 플러그인을 엽니다. 이미지 파일을 이미지 1과 이미지 2에 할당합니다.

그런 다음 확인을 클릭합니다. 결과 스택에는 자세한 정보가 표시되지 않을 수 있습니다. 이것은 정상입니다.

스택을 scatterplots라는 새 폴더에 저장하고 참조하는 샘플과 동일한 파일 이름을 지정합니다. 예를 들어, Ash GFP 상관 그림이 있습니다. 데이터를 보려면 두 가지 옵션 중 하나를 선택합니다.

먼저 process math log auto를 선택하여 데이터를 로그 형식으로 변환합니다. 그런 다음 데이터를 시각적으로 다시 스케일링하려면 이미지를 클릭하고, 밝기를 조정하고, 대비를 슬래시하고, 자동을 선택합니다. 둘째, 낮은 값만 표시하도록 데이터의 크기를 시각적으로 다시 조정하고 특수 조회 테이블 또는 LUT를 사용하여 데이터를 표시하여 사용자 지정 LUT를 만듭니다.

이미지 색상 편집 LUT를 클릭하면 매우 간단한 LUT를 얻을 수 있습니다. 왼쪽 상단 픽셀을 클릭하고 검은색을 선택합니다. 그런 다음 오른쪽에 있는 다음 픽셀을 선택하고 빨간색을 선택합니다.

그런 다음 세 번째 픽셀을 클릭하고 마우스 버튼을 누른 상태에서 선택 항목을 오른쪽 하단 픽셀로 드래그합니다. 빨간색을 선택하고 확인을 클릭한 다음 흰색을 선택하고 확인을 클릭합니다. 앞에서 설명한 대로 밝기 슬래시 대비 범위를 0에서 255 사이로 선택하여 이미지를 화면에 표시된 이미지로 고정합니다.

RGB 형식으로 변환하여 이미지를 복사하여 다른 프로그램에 붙여넣습니다. 먼저 앞에서 설명한 대로 8비트 또는 16비트 이미지를 엽니다. GFP에 대한 이미지에 LUT 색 구성표를 할당합니다.

이미지를 클릭하여 녹색 LUT를 할당합니다. 녹색 테이블을 찾습니다. 마지막으로 복사할 이미지를 선택하고 클립보드에 복사합니다.이 그림은 시스템에 복사본 편집을 선택하면 30분 동안 염색된 kinase sock 융합, GFP 및 TC 태그에 대한 일반적인 결과를 보여줍니다.

HEC 2 9 3 세포에 회분이 있으면 ASH가 높은 친화력으로 TC 태그를 운반하는 표적 단백질에 효율적으로 결합하는 것으로 보입니다. 대조적으로, 이 그림은 GFP에 융합된 SARK의 해당 대조군 샘플을 보여주지만, TC 태그의 특이성과 배경 염색 수준을 모두 확인하는 데 필수적인 TC 태그가 없습니다. 이 결과는 RH가 타겟 단백질과 반응성이 없으며 SSH 바인딩에 대한 TC 태그의 특이성을 나타내는 TC 태그가 없음을 보여줍니다.

이 절차를 시도하는 동안 세포의 V 결합에 영향을 미치므로 세포가 합류하고 차분하지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 단순히 데이터를 정량적으로 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것이며, 이러한 방법을 개선하여 데이터 시각화를 위한 고유한 IUTS를 개발할 수 있습니다.