Name: 랫 뇌 조각의 GABA 활성화된 단일 채널 및 토닉 해류 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-17T14:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 학습하세요 패치 클램프 기법을 이용하여 랫 뇌 조각의 GABA 활성화된 단일 채널 및 토닉 해류를 기록하는 방법을 배우세요. 이 기술은 시냅스와 시냅스 외 GABAA 채널을 구분하여 신경 흥분성 조절 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 스웨덴 연구위원회, 웁살라 대학과 프레드릭와 잉그리드 Thurings 재단에 의해 투자되었다. ZJ는 EXODIAB 및 Svenska Sällskapet에 대한 Medicinsk Forskning에서 박사 후 교제를 개최. 우리는 기술 지원을위한 프랭크 리 주셔서 감사합니다.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

전체 셀 전류는 세포의 활성 채널에 의해 생성된 전류의 앙상블을 나타냅니다. 특정 약리학과 GABAA 채널의 염화물 침투성이 채널과 연관된 전류를 식별하는 것이 가능합니다. 시냅스 채널과 extrasynaptic 채널 토닉 활성화의 활성화의 과도 특성은 신경 세포로 표현 GABAA 채널이 두 인구 사이에 쉽게 차별화 수 있습니다. 단, 단일 채널 녹음이 하나는 토닉 전류를 생성하는 채널 분자의 운동 특성을 공부할 수 있습니다. 100 μs 이내에 활성화 시냅스 채널 달리 토닉 GABAA 채널 GABA는 4,7,15,16,17,18을 적용하는 시간에서 분 범위에서 대기로 활성화됩니다. 많은 채널 등록 정보의 채널이 결과의 지연 활성화는 전체 세포 녹음을 사용하여 공부하실 수 없습니다. 단일 채널 수준에서 GABAA 채널의 다른 하위 인구는 기능성과 약리 특성을 변화에 따라 확인할 수 있습니다. 따라서, 다른 패치 - 클램프 구성 제공하는 것을 활용하여, 그것은 상세히 뉴런에있는 토닉과 시냅스 전류를 생성하는 GABA 활성화된 채널의 분자 기능과 약리학을 공부하는 것이 가능합니다.

몇 가지 패치 - 클램프 하드웨어 및 소프트웨어 시스템을 사용할 수 있습니다 그리고 그들은 모두 동일한 기본 원칙을 사용하여 운영하고 있습니다. 저희 연구실에 우리는 우리의 실험을 기록하고 분석하는 Axoclamp 앰프와 PClamp 소프트웨어 (분자 디바이스, 미국)를 사용합니다. 또 다른 인기있는 브랜드는 HEKA 앰프 및 소프트웨어 (HEKA Elektronik, 독일)입니다 Microforge : Narishige MF - 830 (일본), Vibrotome : 예 Leica VT1200S (독일) 또는 캠덴 악기 vibrotome (영국) 현미경 : 니콘 이클립스 E600FN, 물 목욕, Micromanipulators : 사용자 정의 만든 Narishige의 micromanipulators (일본), 풀러 : DMZ - 보편적인 (독일) 또는 Narishige PC - 10 (일본). 전극 유리 : GC150F - 15 (하버드 장치, 영국).

랫 뇌 조각의 gaba 활성화된 단일 채널 및 토닉 해류

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

GABA 채널은 모든 뉴런에 존재하고 그들이 4,5,6,7 GABA 채널 pentameric GABA - 게이 티드 염화물 채널입니다 각각 phasic와 토닉 전류를 생성하는 위치를 모두 시냅스의 시냅스와 외부에 위치하고 있습니다. 채널 subunits는 8 가족 (α1 - 6, β1 - 3, γ1 - 3, δ, ε, θ, π와 ρ)로 분류됩니다. 두 알파, 두 베타 한 제 3의 subunit의 기능 채널 8을 형성. GABA의 모든 인구가 신경 세포의 채널을 포함하여 연구와 하위 유형의 특정 GABA 활성화된 단일 채널 분자의 연구를 결합하여 그것은 기본의 연결 억제의 메커니즘과 방법은 약리 에이전트에 의해 변조된을 이해하는 것이 가능하게됩니다. 우리는 hippocampal 뇌 조각의 살아있는 뉴런에서 GABA 채널의 기능적 특성을 연구하고 단일 채널 및 전체 세포 전류를 기록하기 위해 패치 - 클램프 기법 9,10를 사용합니다. 우리는 더 이상 채널이 다른 GABA 농도, 다른 마약과 내부 및 세포외 요인에 의해 영향을받는 방법을 확인합니다. 패치 - 클램프 방법의 상세한 이론 및 실용적인 설명을 보려면 B Sakman 및 E Neher 10 편집 단일 채널 레코딩을 참조하시기 바랍니다.

우리는 GABA 활성화된 단일 채널 전류 (GABAA 채널, GABAA 수용체)와 그들이 뉴런의 시냅스 생성과 토닉 전류를 측정하는 패치 - 클램프 기법을 사용합니다. 채널의 활성화는 건강과 질병에의 연결을 흥분을 감소<sup&gt; 1,2,3,4</sup&gt;.

랫 뇌 조각의 GABA 활성화된 단일 채널 및 토닉 해류

GABAA 채널은 모든 뉴런에 존재하며 시냅스와 시냅스 외부 모두에 위치하여 위상성 전류와 강직성 전류를 생성하며, ...

다음 실험의 전반적인 목표는 단일 분자에 의해 생성되는 GABA 활성 전류(단일 채널 전류) 및 시냅스 내부 또는 외부에 위치한 특정 채널 집단에 의한 전류를 기록하는 것입니다. 이를 위해 먼저 쥐의 해마 뇌 절편을 준비하고 패치 클램핑에 사용할 피펫을 제작합니다. 그 다음 단계로, 피펫을 뉴런 막에 부착합니다.기가 씰(giga seal)이 형성되면, 세포 부착 패치 클램프 구성이 완료됩니다. 다음으로 피펫에 흡입력을 가합니다. 막이 파열되어 세포 내부로 진입하면, 전세포 패치 클램프 구성이 확립됩니다.시냅스 및 시냅스 외 gabaa 채널을 구분하는 결과가 얻어집니다. emit과 같은 기존 방법과 비교하여 패치 클램프 기술의 주요 장점은 채널의 기능적 특성을 연구할 수 있다는 점입니다. 패치 클램프 방법은 신경세포의 흥분성을 결정하는 요인이 무엇인지, 그리고 이것이 어떻게 조절되고 미세하게 조정되는지와 같은 신경과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.모든 살아있는 세포는 생존과 특수한 세포 기능을 위해 이온 통로의 적절한 작동에 의존하므로, 이 기술의 영향은 많은 질병의 치료 및 진단으로까지 확장됩니다. 이 절차는 연구실의 박사후 연구원인 giant postdoctoral fellow와 대학원생인 young yin이 시연합니다. 본 절차를 시작하기 위해, 생후 16~22일 된 Wistar 쥐를 참수하여 희생시키고 스패튤러를 이용해 빠르게 뇌를 제거합니다. 수술용 칼로 뇌를 정중선에 따라 절개합니다.다음으로, 각 반구를 절단면이 종이를 향하도록 하여 watman 여과지에 놓습니다. 시편 디스크에 순간접착제를 한 방울 떨어뜨리고, 절단면이 아래로 향하게 하여 그 위에 반구를 배치합니다. 그런 다음, 시편 디스크를 얼음물로 채워진 진동 절편기의 절단 챔버에 넣습니다.CSF를 준비합니다. 절편 두께를 400 µm로 설정하고 뇌 절단을 시작합니다. 해마에 도달할 때까지 뇌 조직을 약 2 mm 정도 잘라냅니다.다음으로, CSF가 채워진 유리 페트리 접시에 해마 슬라이스를 넣습니다. 해마를 쉽게 시각화할 수 있도록 접시를 검은색 배경 위에 놓습니다. 다음 단계는 날카로운 수술용 칼날을 사용하여 주변 조직으로부터 해마를 분리하는 것입니다.그 이후에는 조직을 밀거나 당기지 않도록 주의하십시오. 절편과 A CSF 용액을 37 °C에서 1시간 동안 배양한 후, 실험이 완료될 때까지 상온에서 유지하십시오. 패치 피펫으로는 붕규산 유리 모세관을 사용합니다.자동 또는 수동 피펫 풀러를 사용하여 패치 피펫을 당겨, 전체 세포 기록(whole cell recording)의 경우 2~4 MΩ, 단일 채널 기록(single channel recording)의 경우 8~20 MΩ의 저항값이 되도록 합니다. 단일 채널 기록을 위해서는 동일한 붕규산 유리로 피펫을 연마합니다. 마이크로 포지(micro forge)를 사용하여 백금 와이어 위의 붕규산 유리를 녹여 팁을 더 매끄럽게 만듭니다.이러한 방식으로 피펫을 폴리싱하면 코팅되지 않은 와이어의 열이나 자동 퓰러(puller)의 폴리싱 단계를 통해 폴리싱한 피펫에 비해 더 안정적이고 저항력이 높은 씰(seal)을 형성하는 피펫을 만들 수 있습니다. 패치 클램프 장비는 플로팅 테이블 위에 놓여 있고 패러데이 케이지(faraday cage)로 둘러싸인 현미경, 앰프, 디지타이저 및 컴퓨터로 구성됩니다. 이들 장비 전체를 흔히 패치 클램프 리그(patch clamp rig)라고 합니다.이제 피펫 홀더에 피펫을 삽입하고 캡을 조여 피펫을 고정합니다. 패치 클램핑 소프트웨어로는 P clamp를 사용합니다. OC clamp amplifier 200 B를 V clamp로 설정하고, gain은 2, 필터는 2 kHz, 유지 전위(holding potential)는 0 mV로 설정하십시오. 피펫 내부에 양압을 형성하기 위해 피펫 홀더와 연결된 튜브에 부착된 마우스피스에 공기를 불어넣습니다.그런 다음 마우스피스와 튜브 사이의 밸브를 잠급니다. 공기가 새지 않는지 확인하십시오. 다음으로, 피펫을 배양액 속으로 내립니다.피펫 저항이 측정되는 컴퓨터 화면에는 5 mV 펄스 트레인에 의해 생성된 펄스와 피펫의 저항값을 나타내는 숫자가 표시됩니다. 숫자가 작을수록 피펫 팁의 개구부가 더 크고 피펫의 크기가 더 큼을 의미합니다. 증폭기의 피펫 오프셋을 0으로 조정하십시오.현미경의 10배 배율 또는 60배 배율을 사용하여 해당 영역을 확인하십시오. 해마 슬라이스에서 패치 클램프를 수행할 파라메탈 뉴런(parametal neuron)을 식별하려면, 치상회 과립 세포, CA1 파라메탈 세포체 영역, 그리고 CA3 파라메탈 세포체 영역이 각각 밝은 띠 형태로 나타나는 것을 확인하십시오. 영역 또는 세포와 피펫이 모두 보이도록 피펫의 초점을 맞추십시오.현미경 접안렌즈를 통해 보면서, 조동 조절기 설정을 사용하여 피펫을 해당 영역의 중앙 위에 배치하고, 피펫이 조직에 닿기 직전까지 내립니다. 이 지점에서 조절기의 미동 조절 설정을 사용하여 피펫을 세포나 영역의 중심부에 매우 부드럽게 내립니다. 동시에 컴퓨터 화면을 관찰하여 피펫의 저항을 계속해서 확인하십시오.피펫의 저항이 커질 때까지 계속해서 피펫을 내립니다. 밸브를 열어 피펫의 양압을 해제합니다. 이렇게 하면 완만한 흡입력이 발생하여 자동으로 기가씰(giga seal)이 형성됩니다.기가 실(giga seal)이 형성되지 않은 경우, 이전에 양압을 가했던 마우스피스에 흡입압을 가하십시오. 이제 소위 세포 부착 패치 클램프(cell attached patch clamp) 구성이 완료되었습니다. 피펫과 피펫 홀더에서 발생하는 과도 응답을 제거하기 위해 fast 및 slow 커패시턴스 보정을 조절하십시오.컴퓨터 화면에 평탄한 전류 추적선이 표시됩니다. GigE 값이 높을수록 셀 부착 패치 클램프(cell attached patch clamp) 구성으로 단일 채널 전류를 기록할 때 단일 채널 기록의 신호 대 잡음비가 더 좋아집니다. 게인(gain)을 500으로 설정하고 데이터 샘플링 속도를 100 microseconds보다 느리지 않게 설정하십시오.그런 다음 전류를 기록합니다. 전체 세포 기록(whole cell recording) 시 기록상의 노이즈를 최소화하기 위해, bath 용액의 부피를 슬라이스가 겨우 잠길 정도로 낮게 유지하십시오. 피펫 전위를 -60 mV 또는 휴지 막 전위에 가깝게 설정하십시오.세포 부착 구성에서 피펫 홀더에 연결된 튜브를 통해 피펫에 흡입력을 가하십시오. 동시에 컴퓨터 화면에서 저항 및 커패시턴스 과도 응답의 변화를 관찰하십시오. 세포막이 파괴될 때까지 이 과정을 수행합니다.이러한 상태가 되면 소위 전체 세포 구성(whole cell configuration) 또는 전체 세포 모드(whole cell mode)에 진입한 것입니다. 피펫 용액이 세포 내부와 평형을 이룰 때까지 5~10분 동안 기다리십시오. 그동안 직렬 저항(series resistance) 값을 계속 확인하십시오.전류는 세포막에 있는 열린 채널의 집단에 의해 전달됩니다. GABA는 세포막을 통과할 수 없으므로, GABA로 활성화된 단일 채널을 입증하기 위해 피펫 용액에 GABA를 첨가합니다. 여기에는 치상회 과립 뉴런의 세포 부착 패치(cell attached patch)에서 20 nanomolar GABA 농도에 의해 활성화된 단일 채널 전류가 나타나 있습니다.패치를 40 millivolts만큼 탈분극시켰습니다. 채널의 최대 전도도는 44 Picos semens였으며, 활성화 잠복기는 2.63 minutes였습니다. 다음은 전류의 위상성(phasic) 및 강직성(tonic) 특성을 통해 gaba, 활성화된 시냅스 및 시냅스 외 전류를 구분하는 방법의 예시입니다.토닉(tonic) 및 페이직(phasic) 전류를 식별하기 위해 전세포 전압 고정법(whole cell voltage clamp method)을 사용하여 쥐의 해마 뉴런 내 채널 집단을 통해 흐르는 전류를 기록하였다. BA에 표시된 대로 치상회 뉴런에, 그리고 BB에 표시된 대로 인슐린 처리된 CA1 피라미드 뉴런에 100 $\mu$M의 $\text{GABA}_{\text{A}}$ 길항제 SR 9 55 31을 처리하였다. SR 9 55 31은 시냅스 외 채널을 차단하여 기선 전류(baseline current)의 변화를 유도하였으며, 이를 통해 토닉 전류를 확인하였다.숙달되면, 세포 부착 패치(cell attached patch)를 얻은 후 세포 내부로 진입하여 전체 세포 패치(whole cell patch)를 형성하는 과정을 2분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 익히면 온전한 췌장 섬(pancreatic eyelets)과 같은 다른 조직이나 림프구 또는 배양 세포와 같은 분리된 세포에도 패치 작업을 수행할 수 있습니다.

gaba-activated-single-channel-and-tonic-currents-in-rat-brain-slices

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 보고서는 첨부 presynaptic 부튼스을 유지 가능한 개별 뉴런의 기계적 분리를위한 기술을 보여줍니다. Vibrodissociated 뉴런은 빠른 생산, 뛰어난 약리 제어 및 인접 세포의 영향없이 향상된 공간 클램프의 장점이 있습니다. 이 방법은 시냅스 요소 및 패치 - 클램프 녹화 영상에 사용될 수 있습니다.

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

이 비디오는 쥐의 전전두엽 피질 뇌 절편에서 감마 아미노부티르산(GABA)에 의해 유도된 전체 세포 전류를 기록하는 것을 보여줍니다. GABA의 제어된 전달은 시냅스후 뉴런에서 염화물 채널을 열어 억제성 시냅스후 전류 또는 IPSC를 생성합니다. 이러한 IPSC는 GABA 농도가 높을수록 증가하며, 이는 시냅스 전달에 대한 GABA의 억제 활성을 반영합니다.

mouse brain slice에서 GABA Puffing을 사용한 전체 세포 전류 기록

이 비디오는 생쥐의 급성 편도체 뇌 절편을 사용하여 내측 전전두엽 피질(mPFC)과 편도체 뉴런 사이의 시냅스 연결성을 분석하는 절차를 보여줍니다. 이 마우스의 mPFC 뉴런은 형광 단백질에 융합된 채널로돕신을 발현합니다. 채널로돕신은 광 활성화 시 mPFC 뉴런에서 이온 유입 및 활동 전위 생성을 촉진합니다. 결과적으로, mPFC 뉴런은 시냅스후 편도체 뉴런에 결합하는 신경전달물질을 방출하여 mPFC-편도체 연결성을 시각화하기 위해 기록된 시냅스후 전류를 트리거합니다.

Visualization and Mapping of Neuronal Pathways in an Amygdala Brain Slice(편도체 뇌 절편에서 신경 경로의 시각화 및 매핑)

이 비디오는 내측 전전두엽 피질(mPFC) 축삭을 광유전학적으로 자극하고 LEC에서 피라미드 뉴런의 반응을 기록하여 외측 내후각 피질(LEC)의 시냅스 효율성을 연구하는 절차를 보여줍니다. 이 방법은 시냅스 가소성을 연구하기 위해 패치 클램프 녹음과 광 자극에 의한 시냅스 활성화를 결합합니다.

쥐 뇌 절편에서 시냅스 사건의 광유전학적 자극 및 전기생리학적 기록

대뇌 피질의 네트워크는 억제의 interneurons의 작지만 다양한 설정에 의해 제어된다. 의 interneurons의 기능 조사 그러므로 표적으로 기록하고 엄격한 확인이 필요합니다. 세포 내 라벨, 사후 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석 신경 세포의 단일 또는 시냅스 결합 쌍에서 전체 셀 녹음을 포함하는 통합 접근 방식은 여기에 설명한다.

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

개체 발생 과정 억제 GABA 성 시냅스의 형성을 좌표 공동 분자 메커니즘은 크게 알려져 있지 않다. 이러한 프로세스를 연구하기 위해, 우리는 기능 GABA의 수용체를 표현 안정적으로 형질 전환 된 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포와 함께 배양 한 배아 매체 가시 GABA 성 신경 세포를 통합하는 공동 문화 모델 시스템을 개발했다.

공동 문화 모델, 설립 GABA 성 중간 가시 신경 세포 및 HEK293 세포에서 억제 시냅스 형성 안정적으로 GABA를 표현 수용체

진동은 기본적인 네트워크 속성이며 질병과 약물에 의해 조절된다. 뇌 슬라이스 진동을 공부하는 것은 통제 된 조건에서 격리 된 네트워크의 특성을 수 있습니다. 프로토콜은 CA1의 γ 진동을 불러 일으키는 급성 뇌 조각의 준비를 위해 제공됩니다.

파상풍의 자극에 의​​해 지역의 CA1 γ 진동의 발생

우리는 약리 시 약 전체 셀 패치 클램프 기록 하는 동안 관리 될 수 및 그것의 성공에 대 한 중요 한 기능의 다양 한 측면을 강조 퍼프 기술을 설명 합니다.

전체 셀 전류 두뇌 분할 영역에서 GABA의 퍼프 응용 프로그램에 의해 유도 된

여기, 선물이 생리학 및 약리학 바인딩에서 GABAA 수용 체에 활성 화합물을 발견 하는 프로토콜.

감마-Aminobutyric 산 성 수용 체 변조 소설 화합물의 발견에 대 한 메서드 있는 Neurotransmission 입력

급성 발작 모델은 epileptiform 이벤트를 기본 메커니즘을 공부 하 고 중요 합니다. 또한, epileptiform 이벤트에 수요를 생성 하는 기능에는 그들의 개시를 기본 이벤트의 정확한 순서를 공부 하 매우 효율적인 방법을 제공 한다. 여기, 우리가 마우스 및 인간의 조직에 급성 4-aminopyridine 대뇌 피 질의 발작 모델을 설명 합니다.

설치류와 인간의 조직에 급성 Ictal 활동의 생성 및 요청 시 개시

이 문서는 마우스에서 수평 해마 뇌 조각을 얻기 위해 체계적인 프로토콜을 설명하는 것을 목표로합니다. 이 방법론의 목적은 천공 경로 및 이끼 섬유장과 같은 해마 섬유 경로의 무결성을 보존하여 규톨염 자이러스 관련 신경학적 과정을 평가하는 것입니다.

마우스 뇌의 수평 해마 조각

학습하세요 패치 클램프 기법을 이용하여 랫 뇌 조각의 GABA 활성화된 단일 채널 및 토닉 해류를 기록하는 방법을 배우세요. 이 기술은 시냅스와 시냅스 외 GABAA 채널을 구분하여 신경 흥분성 조절 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

랫 뇌 조각의 GABA 활성화된 단일 채널 및 토닉 해류

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