Name: 원자 힘 현미경에 의해 영상에 대한 세균 고정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 배우세요 원자력현미경을 이용해 젤라틴 코팅 마이카 표면에 살아있는 그람음성 및 그람양성 세균을 고정하고 액체 환경에서 고해상도 영상을 획득하는 방법을. 이 기술은 세균 표면 구조와 형태학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 생물학과 환경 연구의 사무실, 에너지 미국학과로와 버지니아 연방 보건 연구위원회에서 부여 기금을 후원합니다. 오크 리지 국립 연구소는 계약 번호 DE - AC05 - 00OR22725에 따라 에너지의 미국학과에 대한 UT - 바텔, LLC에 의해 관리됩니다.

1. 미카 준비 : <ol><li> AFM 현미경 (약 22 × 30mm)에 맞게 필요한 크기로 가위로 운모를 (전자 현미경 과학) 잘라. </li><li> 클리브가 양쪽에있는 미카가 일반적으로 바깥쪽 레이어를 제거하는 테이프를 사용하는 것은 부드럽고 깨지지 레이어가 남을 때까지. </li></ol> 2. 젤라틴 용액의 준비 : <ol><li> 실험실 병에 증류수 100 ML을 추가합니다. </li><li> 물이 끓기 시작할 때까지 전자 레인지에 병을 열. (전자 레인지를 사용할 수없는 경우, 물은 뜨거운 접시에 비커에 가열 수 있습니다.) </li><li> 젤라틴 0.5 g (를 시그마 G - 6144, G - 2625 또는 G - 2500)가 무게와 뜨거운 증류수에 추가할 수 있습니다. </li><li> 부드럽게 소용돌이는 젤라틴까지 병이 완전히 녹아있다. </li><li> 60-70 ° C.에 젤라틴 용액을 쿨 </li><li> 컷 죽습 미카가 담근 수있는에 작은 비커 (20 ML)에 약 15 ML 하거라. </li></ol> 3. 미카 코팅 : <ol><li> 예열 젤라틴 용액에 잠수함 미카 사각형과 운모가 (그림 1A) 코팅되어 신속하게 철회 등. </li><li> 코팅 후 (그림 1B의) 주변 공기의 건조에 종이 타월에 가장자리에 즉시 운모를 지원합니다. 젤라틴 코팅 운모는 최소 2 주 동안 사용할 수 있습니다. 초과 젤라틴 솔루션은 냉장 보관 간단 60-70 사이 ° C.에 대한 재고 솔루션을 재가열하여 약 한 달 동안 사용할 수 있습니다 케어는 젤라틴이 재가열하는 동안 삶은 아니라는 것을 보장하기 위해 이동해야합니다. </li></ol> 4. 젤라틴 코팅 운모에 박테리아를 장착 : <ol><li> 펠렛 세균성 문화 1 ML (0.5-600 nm의에서 1.0 OD) 800 4500 RCF에서. 세균에 따라 최소 RCF를 사용하는 것이 펠렛이 ~ 5 분 안에 세포 것입니다. </li><li> 필터링 탈이온수 또는 버퍼의 같은 볼륨에서 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 원심 분리하여 다시 세포를 수집합니다. </li><li> nanopure 탈이온수 또는 버퍼 500 μL에 즉시 펠렛을 Resuspend. (세균성 정지 가시 AFM 이미징을위한 세포의 적절한 농도를하기 위해 흐린해야합니다.) </li><li> 피펫 팁 (그림 1C)를 사용하여 표면에 젤라틴 - 코팅 운모 및 확산에 세포 현탁액 (10-20 μL)를 적용합니다. 치료는 세균 솔루션을 적용하거나 유포하는 동안 물리적으로 피펫 팁로 젤라틴 표면을 만지지로 이동해야합니다. </li><li> 표면이 10 분 정도 휴식과 물 또는 버퍼 (그림 1 CD)의 흐름과 함께 씻어 수 있습니다. 절차 전반에 걸쳐, 샘플이 건조 허용되지 않도록하는데주의를 기울여야. </li></ol> 5. 대표 결과 : 그림 2는 젤라틴 - 코팅 운모에 장착된와 AFM에 의해 몇 군데있다 세균성 세포의 예제 이미지를 보여줍니다. 우리 실험실에서는 샘플은 일반적으로 100 μm의 검사 머리 복 PicoPlus 원자 힘 현미경을 (애질런트 테크놀로지, 템플, AZ)를 사용하여 몇 군데 있습니다. 악기는 0.5-1.0 라인 / s의의 스캔 속도로 라인 스캔 당 128-512 픽셀에서 운영하고 있습니다 일반적으로 사용되는 cantilevers는 0.01에서 0.1 NN / NM에 이르기까지 명목 스프링 상수와 Veeco 실리콘 질화물 프로브 (MLCT - AUHW, Veeco, 산타 바바라, CA)입니다. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 60-70 ° C가 20 ML의 비커에 배치됩니다의 온도에서 다행. 족집게 한 켤레를 사용하면 갓 미카 사각형이 완전히 젤라틴 (A) 철회와 마이크로 원심 분리기 걸이 (B) 기대어 종이 타월에 직립 위치로 포장되어 아르 죽습. 세균성 시료의 비말은 X와 Y 방향 (C) 모두에서 pipet 팁있는 미카와 보급에 위치합니다. 샘플 적어도 10 분 동안 운모 표면에 품어 수 있도록 후, 증류수의 흐름에 샘플을 씻어. 고정이 효과가있다면 당신은 (D)의 오른쪽 패널에서 같이 미카에 불투명 자리를 볼 수 있습니다. 고정 문제가 해결되지 않았다면 당신은 왼쪽 패널에서와 같이 미카의 명확한 부분을 얻을 것이다. 비말에있는 박테리아의 농도에 미카 저울에 불투명 지점 젤라틴 처리된 운모에이 곳 저. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> E.의 그림 2. AFM 이미지 대장균. 패널 (A)에서 세포는 젤라틴 코팅 운모에 탑재하고 0.005 M PBS에서 몇 군데. 비교, 젤라틴 코팅 운모에 장착하고 공중에서 몇 군데 세균성 세포의 이미지를 패널 (B)로 표시됩니다. septa 분명로서 필리 (삽입된 페이지 패널 (B))의 존재로 표시 액체, 높은 해상도,에서 수집된 이미지에 표시되는 공기를 얻을 수 있습니다. 있지만

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

다양한 요인에 의해 미생물의 AFM 장착 휴대폰 및 이미징에 영향을 미칠 수 있습니다. 코팅에 사용되는 젤라틴은 운모가 중요합니다. 상업 젤라틴은 물고기, 소, 돼지를 포함한 척추 동물의 숫자에서 격리됩니다. 기원과 처리 방법은 모두 고정 세균에 대한 젤라틴의 적합성을 결정합니다. 다양한 소스 및 젤라틴의 종류 immobilizing 박테리아에서 효과에 대한 평가되었다 [1]. 두 가지 가장 효과적인 gelatins는 시그마 G - 6144과 G - 2625로 발견되었다. 돼지 (돼지의)에서 파생이 gelatins는 각각 낮은 블룸와 매체 블룸로 간주됩니다. 젤라틴 - 대우 기판과 공부하는 박테리아의 특정 변형 사이의 호환성을 테스트하는 것이 중요합니다. 중요한 가축에서 유래 젤라틴은 (소) 테스트 박테리아 중 하나를 immobilizing 효과적으로되지 않았습니다. 세포 고정을위한 간단한 테스트는 샘플 물 또는 버퍼 (단계 4.6 이후)와 rinsing 후, 운모에 드라이 수 있도록 포함됩니다. 박테리아가 움직일 수있다면, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 시그마, 세인트 루이스, MO </td><td> G6144, G2625 또는 G2500 </td></tr><tr><td> PicoPlus 원자 포스 현미경 </td><td> 애질런트 테크놀로지 템피, AZ </td><td></td></tr><tr><td> AFM의 cantilevers </td><td> Veeco, 산타 바바라, CA </td><td> MLCT - AUHW </td></tr></tbody></table>

원자 힘 현미경에 의해 영상에 대한 세균 고정

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM은 이미징 도구를 기계적으로 프로브 표면 고해상도 (NM 규모)입니다. 그것은 화학 샘플을 치료하기 위해 필요없이, 액체 환경에서, 이미지 세포 biomolecules 수있는 능력이 있습니다. 이러한 목표를 달성하기 위해 예제는 충분히 스캔 AFM의 캔틸레버 팁 의해 끼쳤다 힘에 의해 제거를 방지하기 위해 장착 표면을 준수해야합니다. 많은 경우에, 성공적인 영상이 장착 표면에 시료의 고정에 따라 달라집니다. 최적 고정은 신진 대사 프로세스와 기능 특성이 손상되지 않습니다 같은 샘플을 법으로서해야합니다. 돼지의 (돼지) 젤라틴과 코팅 갓 죽습 운모 표면에 의해 부정 청구 박테리아가 표면에 고정화 수 있으며 AFM에 의해 액체에 몇 군데. 젤라틴 - 코팅 운모에 세균 세포의 고정은 부정 청구 세균과 긍정적인 혐의 젤라틴 사이의 정전 기적 상호 작용에 의한 가능성이 높습니다. 여러 가지 요인은 박테리아가 일시 중지되는 액체, 세균 긴장과 세균이 몇 군데있는 매체의 젤라틴 코팅 운모, 표면 특성에 박테리아의 배양 시간의 화학 성분을 포함하여 세균의 고정과 방해할 수 있습니다. 전반적으로, 젤라틴 코팅 운모의 사용은 이미지의 미생물 세포에 대해 일반적으로 적용할 수 발견됩니다.

라이브 그람 음성 및 그람 양성 세균은 젤라틴 코팅 운모에 고정화 및 원자 힘 현미경 (AFM)을 사용하여 액체에 몇 군데 있습니다.

AFM은 표면을 기계적으로 탐색하는 고해상도(nm 스케일) 이미징 도구입니다. 이는 액체 상태에서 세포와 생체 분자를 이미징할 수 있는 능력을 갖추고 있으며...

원자 힘 현미경(Atomic force microscopy) 또는 AFM은 표면을 기계적으로 탐침하여 시료를 화학적으로 처리할 필요 없이 고해상도 이미지를 생성합니다. 본 영상에서는 박테리아를 젤라틴이 코팅된 마이카(mica) 위에 고정시키고 AFM을 사용하여 액체 환경에서 이미징합니다. 먼저 AFM 현미경 플랫폼에 맞게 마이카 사각형을 절단합니다. 마이카의 최상층을 제거한 후 마이카 사각형을 젤라틴으로 코팅합니다.다음으로, 박테리아 현탁액 한 방울을 젤라틴이 코팅된 마이카 위에 떨어뜨리고 펴 바릅니다. 피펫 팁을 사용하여 샘플을 10분 동안 배양합니다. 그 후, 표면에서 결합하지 않은 박테리아를 세척하여 제거합니다.샘플을 AFM 습식 셀(wet cell)에 넣고 이미징하여 살아있는 박테리아의 고해상도 이미지를 얻습니다. ISO 다공성 필터 고정화와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 간균과 구균 모두를 안정적으로 고정할 수 있다는 것입니다. 또한, 세포 표면의 더 많은 부분이 AFM 프로브에 노출되어 접근이 가능합니다.다른 현미경 기법과 비교했을 때 원자간력 현미경의 주요 장점은 단일 세포 연구가 가능하다는 것이며, 이를 통해 세포 형태, 격벽 형성 및 세포질 분열에 대한 조사를 수행할 수 있다는 점입니다. 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 박테리아 고정 효과가 검증되지 않은 젤라틴을 사용하거나, 성분들이 박테리아의 젤라틴 표면 부착을 방해하는 복합 배지에서 배양된 박테리아를 사용하여 어려움을 겪는 경향이 있습니다. 저희는 1970년대에 박테리아를 고정했던 실험에서 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다.광학 현미경 및 자기 방사법 실험을 위한 젤라틴 코팅 유리 슬라이드입니다. 본 시연에서는 FM 이미징을 위해 살아있는 그람 음성 세균을 고정하지만, 이 방법은 그람 양성 세균에도 적용 가능합니다. MICA를 준비하려면 먼저 가위로 절단하여 AFM 현미경 스테이지에 맞추고 AFM 습식 셀을 수용할 수 있도록 합니다.다음으로 MICA 표면에 스카치테이프를 붙였다가 떼어내어 절단된 조각에서 MICA의 겉면 층을 벗겨냅니다. 매끄럽고 끊어지지 않은 층만 남을 때까지 양쪽 면에서 겉면 층을 계속해서 제거합니다. 젤라틴 용액을 준비하려면, 실험실용 병에 증류수 100 milliliters를 넣고 전자레인지로 가열합니다.물이 끓기 시작하면 마이크로웨이브에서 꺼내 0.5 g의 gelatin을 첨가하고, gelatin이 녹을 때까지 병을 부드럽게 흔들어 팽윤시킵니다. bovine gelatin은 이 절차에 적합하지 않으므로 porcine gelatin을 사용하는 것을 권장합니다.병을 벤치 탑에 놓고 60 to 70 °C까지 식힙니다. 그다음 핀셋을 사용하여 MICA를 완전히 담글 수 있도록 소량의 젤라틴 용액을 작은 비커에 붓습니다. MICA 사각형을 따뜻한 젤라틴 용액에 담갔다가 즉시 빠르게 꺼냅니다.MICA를 키친 타월 위에 세워 마이크로 원심분리기 랙에 기대어 놓고 하룻밤 동안 상온에서 건조시키십시오. 젤라틴이 코팅된 MICA는 최소 2주 동안 사용할 수 있습니다. 만약 젤라틴이 코팅된 MICA를 몇 주 동안 사용하지 않을 경우이를 덮개가 있는 페트리 접시 안의 여과지에 놓고 실온에서 보관하십시오. 남은 젤라틴 용액은 냉장 보관하며, 스톡 용액을 60~70 °C 사이로 다시 가열하는 것만으로 약 한 달 동안 사용할 수 있습니다. 재가열하는 동안 젤라틴이 끓지 않도록 주의해야 합니다.박테리아를 젤라틴 코팅된 MICA에 마운팅하기 전에 박테리아 농도가 적절한지 확인하십시오. 분광광도계를 사용하여 600 nanometers에서 박테리아 샘플의 흡광도(optical density)를 측정합니다. OD 값이 0.5에서 1 사이일 때가 최적입니다.다음으로, 배양액 1 mL를 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후 원심분리하여 펠릿을 형성시킵니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거한 다음, 1 mL의 여과된 탈이온수 또는 완충액으로 펠릿을 세척합니다. 피펫팅을 부드럽게 반복하여 재부유시킵니다.펠렛을 원심분리한 후 즉시 재현탁하십시오. 500 µL의 nanopure 탈이온수에 재현탁하며, FM 이미징을 위해 적절한 세포 농도를 확보하려면 세균 현탁액이 시각적으로 탁해야 합니다.삼투압 충격이 우려되는 경우, 이미징 용액에 0.25 molar sucrose를 추가할 수 있습니다. 본 실험에서는 이 박테리아를 물에 재현탁시켰으나, 다른 액체를 시도해 보셔도 좋습니다. 예를 들어, 0.25%sucrose를 사용하여 수행한 사례가 있으므로, 다른 액체들을 시도하여 동일하게 작동하는지 확인해 보십시오.각 샘플당 두 개의 슬라이드를 준비합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 젤라틴이 코팅된 표면에 세포 현탁액 10~20 µL를 첨가합니다. 그 다음, 형광(FM) 이미징을 위해 충분한 영역을 덮을 수 있도록 마이크로 피펫 팁을 사용하여 액적을 X축과 Y축 방향으로 펼쳐줍니다.피펫 팁이 젤라틴 표면에 직접 닿지 않도록 주의하며, 샘플을 상온에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 흐르는 물로 헹구고 샘플의 가장자리를 종이 타월이나 여과지에 대어 과잉 액체를 제거합니다. 질소 가스 제트를 사용하여 슬라이드 하나를 빠르게 건조시킵니다.그 다음 슬라이드를 육안으로 확인하십시오. 불투명한 반점이 보인다면 세척 단계에서 박테리아가 제거되지 않았음을 나타냅니다. 이제 이미징에 사용할 다른 슬라이드는 건조되지 않도록 주의해야 합니다.시료를 AFM 습식 스테이지에 놓고 클립을 사용하여 고정시킨 후, 마이크로 피펫을 사용하여 습식 스테이지에 물을 추가합니다. 액체 내 이미징을 수행하기 전에 원자 힘 현미경을 미리 준비하는 것이 좋습니다. 액체 내 이미징용 캔틸레버가 AFM에 장착되어 있고 레이저와 정렬되었는지 확인하십시오.100 micron 스캐닝 헤드와 공칭 스프링 상수가 0.01에서 0.1 nano newton per nanometer 범위인 vico silicon nitride 프로브가 장착된 pico plus 원자 힘 현미경을 사용하여 원자 힘 현미경 이미징을 진행합니다. 현미경 준비가 완료되면, FM 스캐너와 스테이지를 현미경에 삽입합니다. 일반적으로 이미징 속도는 초당 0.5 라인에서 1 라인으로 시작하며, 해상도는 라인당 128개에서 512개의 데이터 포인트로 설정합니다.기기를 라인당 128에서 512 픽셀을 사용하여 이미지를 수집하도록 설정하십시오. 초당 0.5에서 1라인의 스캔 속도로 스캔하십시오. 그런 다음 필요한 경우, 최적의 이미지를 얻기 위해 A FM의 설정점과 게인을 조정하십시오.마지막으로 이미지를 수집합니다. 이 비디오에서 설명한 대로 E coli 박테리아를 젤라틴 코팅된 MICA 위에 고정시킨 다음, 0.005 molar PVS 내에서 이미지를 촬영하였습니다. 이 방법을 사용합니다.수집된 이미지에서 Scepter가 명확하게 보이며, 세포 표면은 매끄럽고 탈수 징후가 나타나지 않습니다. 이와 대조적으로, 여기에 표시된 것처럼 동일한 e coli를 공기 중에서 촬영한 이미지는 액체 중에서 보이지 않는 구조가 자주 관찰됩니다. 이 경우, 세포는 탈수로 인해 고리 모양(ringold appearance)을 띠며 FIA와 같은 박테리아 부속기관이 관찰될 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 액체 환경에서의 FM 이미징을 위한 박테리아 샘플 준비 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 젤라틴 코팅된 마이크로 표면이 미리 준비되어 있다면, 이 기술을 숙달했을 때 약 1시간 내에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 적절한 젤라틴을 선택하고, 절차에 따른 적절한 박테리아 농도를 유지하는 것이 중요합니다.박테리아 표면의 힘 측정을 유지하기 위해 FN 캔틸레버를 힘 감지 도구로 사용하는 것과 같은 다른 측정들도 수행할 수 있습니다. 또한, 박테리아 표면의 특정 표적과 상호작용하여 상호작용 힘을 식별하고 측정하기 위해 특정 프로브 분자를 A FM 팁에 결합할 수 있습니다. 일반적으로 병원성 박테리아를 다루는 경우, 이 방법을 사용할 때는 항상 주의를 기울여야 함을 잊지 마십시오.

bacterial-immobilization-for-imaging-by-atomic-force-microscopy

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

플라스미드 DNA, 세포질 단백질과 DNA - 단백질 단지의 시각화를위한 감청 모드 원자 힘 현미경 (AFM) 방법을 설명합니다. 방법은 다음과 같은 생화 학적 조작 AFM 이미징을위한 샘플을 준비 대체 방법을 제공합니다. 특정 단백질 상호 작용하는 지역을 포함하는 DNA는 거의 physiologic 버퍼 조건에서 관찰됩니다.

원자 힘 현미경을 사용하여 재조합 DNA와 단백질 단지의 시각화

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

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이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

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단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

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수백 개의 알비칸스 세포에 대한 생체 원자력 현미경 측정 자동화

여기에 제시된 Conpokal 기술의 프로토콜은 공초점 및 원자력 현미경 검사를 단일 계측기 플랫폼으로 결합합니다. Conpokal은 살아있는 생물학 견본의 동시 공초점 화상 진찰 및 기계적인 특성에 가까운 동일 세포, 동일 지구를 제공합니다.

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원자력 현미경 검사법은 단일 박테리아 화학을 조사하는 도구로 적외선 분광법과 결합

여기에서는 박테리아 특성 분석을 위한 간단하고 빠른 방법으로 원자력 현미경(AFM)의 적용을 제시하고 박테리아 크기 및 모양, 박테리아 배양 생물막, 살균제로서의 나노 입자의 활성과 같은 세부 사항을 분석합니다.

접촉 모드 형태학적 관찰 및 박테리아 세포 손상 분석을 위한 신속한 기술로서의 원자력 현미경

배우세요 원자력현미경을 이용해 젤라틴 코팅 마이카 표면에 살아있는 그람음성 및 그람양성 세균을 고정하고 액체 환경에서 고해상도 영상을 획득하는 방법을. 이 기술은 세균 표면 구조와 형태학 연구에 활용됩니다.

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