원자 힘 현미경에 의해 영상에 대한 세균 고정

원자 힘 현미경(Atomic force microscopy) 또는 AFM은 표면을 기계적으로 탐침하여 시료를 화학적으로 처리할 필요 없이 고해상도 이미지를 생성합니다. 본 영상에서는 박테리아를 젤라틴이 코팅된 마이카(mica) 위에 고정시키고 AFM을 사용하여 액체 환경에서 이미징합니다. 먼저 AFM 현미경 플랫폼에 맞게 마이카 사각형을 절단합니다. 마이카의 최상층을 제거한 후 마이카 사각형을 젤라틴으로 코팅합니다.

다음으로, 박테리아 현탁액 한 방울을 젤라틴이 코팅된 마이카 위에 떨어뜨리고 펴 바릅니다. 피펫 팁을 사용하여 샘플을 10분 동안 배양합니다. 그 후, 표면에서 결합하지 않은 박테리아를 세척하여 제거합니다.

샘플을 AFM 습식 셀(wet cell)에 넣고 이미징하여 살아있는 박테리아의 고해상도 이미지를 얻습니다. ISO 다공성 필터 고정화와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 간균과 구균 모두를 안정적으로 고정할 수 있다는 것입니다. 또한, 세포 표면의 더 많은 부분이 AFM 프로브에 노출되어 접근이 가능합니다.

다른 현미경 기법과 비교했을 때 원자간력 현미경의 주요 장점은 단일 세포 연구가 가능하다는 것이며, 이를 통해 세포 형태, 격벽 형성 및 세포질 분열에 대한 조사를 수행할 수 있다는 점입니다. 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 박테리아 고정 효과가 검증되지 않은 젤라틴을 사용하거나, 성분들이 박테리아의 젤라틴 표면 부착을 방해하는 복합 배지에서 배양된 박테리아를 사용하여 어려움을 겪는 경향이 있습니다. 저희는 1970년대에 박테리아를 고정했던 실험에서 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다.

광학 현미경 및 자기 방사법 실험을 위한 젤라틴 코팅 유리 슬라이드입니다. 본 시연에서는 FM 이미징을 위해 살아있는 그람 음성 세균을 고정하지만, 이 방법은 그람 양성 세균에도 적용 가능합니다. MICA를 준비하려면 먼저 가위로 절단하여 AFM 현미경 스테이지에 맞추고 AFM 습식 셀을 수용할 수 있도록 합니다.

다음으로 MICA 표면에 스카치테이프를 붙였다가 떼어내어 절단된 조각에서 MICA의 겉면 층을 벗겨냅니다. 매끄럽고 끊어지지 않은 층만 남을 때까지 양쪽 면에서 겉면 층을 계속해서 제거합니다. 젤라틴 용액을 준비하려면, 실험실용 병에 증류수 100 milliliters를 넣고 전자레인지로 가열합니다.

물이 끓기 시작하면 마이크로웨이브에서 꺼내 0.5 g의 gelatin을 첨가하고, gelatin이 녹을 때까지 병을 부드럽게 흔들어 팽윤시킵니다. bovine gelatin은 이 절차에 적합하지 않으므로 porcine gelatin을 사용하는 것을 권장합니다.

병을 벤치 탑에 놓고 60 to 70 °C까지 식힙니다. 그다음 핀셋을 사용하여 MICA를 완전히 담글 수 있도록 소량의 젤라틴 용액을 작은 비커에 붓습니다. MICA 사각형을 따뜻한 젤라틴 용액에 담갔다가 즉시 빠르게 꺼냅니다.

MICA를 키친 타월 위에 세워 마이크로 원심분리기 랙에 기대어 놓고 하룻밤 동안 상온에서 건조시키십시오. 젤라틴이 코팅된 MICA는 최소 2주 동안 사용할 수 있습니다. 만약 젤라틴이 코팅된 MICA를 몇 주 동안 사용하지 않을 경우

이를 덮개가 있는 페트리 접시 안의 여과지에 놓고 실온에서 보관하십시오. 남은 젤라틴 용액은 냉장 보관하며, 스톡 용액을 60~70 °C 사이로 다시 가열하는 것만으로 약 한 달 동안 사용할 수 있습니다. 재가열하는 동안 젤라틴이 끓지 않도록 주의해야 합니다.

박테리아를 젤라틴 코팅된 MICA에 마운팅하기 전에 박테리아 농도가 적절한지 확인하십시오. 분광광도계를 사용하여 600 nanometers에서 박테리아 샘플의 흡광도(optical density)를 측정합니다. OD 값이 0.5에서 1 사이일 때가 최적입니다.

다음으로, 배양액 1 mL를 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후 원심분리하여 펠릿을 형성시킵니다. 피펫을 사용하여 상층액을 제거한 다음, 1 mL의 여과된 탈이온수 또는 완충액으로 펠릿을 세척합니다. 피펫팅을 부드럽게 반복하여 재부유시킵니다.

펠렛을 원심분리한 후 즉시 재현탁하십시오. 500 µL의 nanopure 탈이온수에 재현탁하며, FM 이미징을 위해 적절한 세포 농도를 확보하려면 세균 현탁액이 시각적으로 탁해야 합니다.

삼투압 충격이 우려되는 경우, 이미징 용액에 0.25 molar sucrose를 추가할 수 있습니다. 본 실험에서는 이 박테리아를 물에 재현탁시켰으나, 다른 액체를 시도해 보셔도 좋습니다. 예를 들어, 0.25%sucrose를 사용하여 수행한 사례가 있으므로, 다른 액체들을 시도하여 동일하게 작동하는지 확인해 보십시오.

각 샘플당 두 개의 슬라이드를 준비합니다. 마이크로 피펫을 사용하여 젤라틴이 코팅된 표면에 세포 현탁액 10~20 µL를 첨가합니다. 그 다음, 형광(FM) 이미징을 위해 충분한 영역을 덮을 수 있도록 마이크로 피펫 팁을 사용하여 액적을 X축과 Y축 방향으로 펼쳐줍니다.

피펫 팁이 젤라틴 표면에 직접 닿지 않도록 주의하며, 샘플을 상온에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 흐르는 물로 헹구고 샘플의 가장자리를 종이 타월이나 여과지에 대어 과잉 액체를 제거합니다. 질소 가스 제트를 사용하여 슬라이드 하나를 빠르게 건조시킵니다.

그 다음 슬라이드를 육안으로 확인하십시오. 불투명한 반점이 보인다면 세척 단계에서 박테리아가 제거되지 않았음을 나타냅니다. 이제 이미징에 사용할 다른 슬라이드는 건조되지 않도록 주의해야 합니다.

시료를 AFM 습식 스테이지에 놓고 클립을 사용하여 고정시킨 후, 마이크로 피펫을 사용하여 습식 스테이지에 물을 추가합니다. 액체 내 이미징을 수행하기 전에 원자 힘 현미경을 미리 준비하는 것이 좋습니다. 액체 내 이미징용 캔틸레버가 AFM에 장착되어 있고 레이저와 정렬되었는지 확인하십시오.

100 micron 스캐닝 헤드와 공칭 스프링 상수가 0.01에서 0.1 nano newton per nanometer 범위인 vico silicon nitride 프로브가 장착된 pico plus 원자 힘 현미경을 사용하여 원자 힘 현미경 이미징을 진행합니다. 현미경 준비가 완료되면, FM 스캐너와 스테이지를 현미경에 삽입합니다. 일반적으로 이미징 속도는 초당 0.5 라인에서 1 라인으로 시작하며, 해상도는 라인당 128개에서 512개의 데이터 포인트로 설정합니다.

기기를 라인당 128에서 512 픽셀을 사용하여 이미지를 수집하도록 설정하십시오. 초당 0.5에서 1라인의 스캔 속도로 스캔하십시오. 그런 다음 필요한 경우, 최적의 이미지를 얻기 위해 A FM의 설정점과 게인을 조정하십시오.

마지막으로 이미지를 수집합니다. 이 비디오에서 설명한 대로 E coli 박테리아를 젤라틴 코팅된 MICA 위에 고정시킨 다음, 0.005 molar PVS 내에서 이미지를 촬영하였습니다. 이 방법을 사용합니다.

수집된 이미지에서 Scepter가 명확하게 보이며, 세포 표면은 매끄럽고 탈수 징후가 나타나지 않습니다. 이와 대조적으로, 여기에 표시된 것처럼 동일한 e coli를 공기 중에서 촬영한 이미지는 액체 중에서 보이지 않는 구조가 자주 관찰됩니다. 이 경우, 세포는 탈수로 인해 고리 모양(ringold appearance)을 띠며 FIA와 같은 박테리아 부속기관이 관찰될 수 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 액체 환경에서의 FM 이미징을 위한 박테리아 샘플 준비 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 젤라틴 코팅된 마이크로 표면이 미리 준비되어 있다면, 이 기술을 숙달했을 때 약 1시간 내에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 적절한 젤라틴을 선택하고, 절차에 따른 적절한 박테리아 농도를 유지하는 것이 중요합니다.

박테리아 표면의 힘 측정을 유지하기 위해 FN 캔틸레버를 힘 감지 도구로 사용하는 것과 같은 다른 측정들도 수행할 수 있습니다. 또한, 박테리아 표면의 특정 표적과 상호작용하여 상호작용 힘을 식별하고 측정하기 위해 특정 프로브 분자를 A FM 팁에 결합할 수 있습니다. 일반적으로 병원성 박테리아를 다루는 경우, 이 방법을 사용할 때는 항상 주의를 기울여야 함을 잊지 마십시오.