베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출

이 절차의 전반적인 목표는 Vero 세포 배양 분석을 통해 야외에서 수집한 모기의 바이러스 감염 여부를 스크리닝하는 것입니다. 먼저, 야외에서 수집한 모기를 종별로 분류합니다. 그런 다음 믹서 밀(mixer mill)을 사용하여 모기를 균질화합니다.

모기 균질액이 준비되면, 바이러스 검사를 위해 Vero 세포를 배양합니다. 각 Vero 세포 배양액에 단일 모기 균질액을 접종한 후 셰이커에서 5분 동안 흔들어 섞고, 바이러스가 증식할 수 있도록 37 °C에서 배양합니다. 최종적으로, 배양액을 육안으로 관찰하여 바이러스로 인한 세포변성효과(cytopathic effects)의 증거가 있는지 확인합니다. RT-PCR과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 세포 배양에서 성장하는 매우 다양한 종류의 바이러스 인자를 대상으로 모기를 스크리닝할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 다양한 모기 종이 바이러스 전파를 지원하는 데 어떤 역할을 하는지와 같이 의료 곤충학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다음 절차에는 생물안전 2등급 시설을 사용하십시오. 살아있는 모기가 들어 있는 채집 봉투를 -20°C에서 15분 동안 두어 마취시킵니다.

곤충이 마취되면, 봉투를 드라이아이스가 들어 있는 단열 용기로 옮겨 모기를 이산화탄소에 1~3분 동안 노출시켜 완전히 무력화합니다. 다음으로, 드라이아이스 위에 놓인 미리 냉각된 팬 위에 모기를 올립니다. 미세 팁 포셉을 사용하여 암컷 곤충을 식별하고 이를 플라스틱 분할 컵으로 옮깁니다.

입틀과 촉각을 검사하여 암컷과 수컷을 구분할 수 있습니다. 컵을 밀폐하고 젖은 얼음 위에 놓으십시오. 전자 냉각 테이블에 설치된 실체 해부 현미경과 분류 키를 사용하십시오.

각 모기 풀의 종을 식별하고, 동일한 종의 모기들을 구리 공이 들어 있는 라벨이 부착된 2 mL 스냅 캡 바이알에 넣으십시오. 튜브가 찰 때까지 한 튜브에 최대 50마리까지 풀링할 수 있습니다. 바이알을 라벨이 부착된 봉투에 넣어 드라이아이스가 담긴 스티로폼 용기에 보관하십시오.

모든 모기의 동정이 완료되면, 균질화 전까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 이 절차를 위해 생물안전 3등급(BSL-3) 시설을 이용하고, 2등급 생물안전 작업대(class two biosafety cabinet) 내에서 작업하십시오. 튜브당 약 1 mL의 PBSG를 첨가하고, 모기가 담긴 튜브를 미리 냉각된 믹서 밀(mixer mill) 카세트에 넣습니다.

적재된 카세트를 믹서 밀(mixer mill)에 고정하고, 초당 25회 사이클로 4분 동안 모기 풀(mosquito pools)을 균질화합니다. 모기가 균질화되면 튜브를 에어로졸 차단 냉장 원심분리기로 옮겨 원심분리합니다. 모기 균질액을 7,000 RPM에서 6분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후, 바이러스 테스트 전까지 튜브를 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 합류(confluent)된 farrow 세포가 담긴 T 175 플라스크에서 배양액을 표백제가 들어 있는 폐기 비커에 따라냅니다. 플라스크에 5 mL의 PBS를 넣고 세포를 고르게 세척한 후, PBS를 폐기 비커에 따라냅니다.

세포를 세척한 후, 2.5 mL의 trypsin EDTA를 넣고 플라스크를 37 °C, 5% CO2 조건에서 5분 동안 배양하여 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면 5 mL의 MEM을 넣고 파이펫으로 세포 용액을 여러 번 위아래로 섞어 뭉친 세포 덩어리를 풀어줍니다. 그런 다음 MEM 15 mL를 추가로 넣습니다.

생물안전작업대(biosafety cabinet) 내의 랙 두 개에 T 25 플라스크 40개를 배치하고 플라스크 캡을 제거하여 각 플라스크 바로 앞에 둡니다. 멸균 피펫을 사용하여 각 플라스크에 4 mL의 MEM을 분주합니다. 그다음 0.5 mL의 부유된 vari 세포를 첨가하고 플라스크 캡을 닫습니다. 플라스크를 트레이에 쌓고 부드럽게 흔들어 배지가 플라스크 바닥을 균일하게 덮도록 합니다.

배양물을 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 또는 세포의 밀도가 80~90% confluence가 될 때까지 배양합니다. 인큐베이터에서 소형 플라스크 20개를 꺼내어 각 모기 풀(pool)의 해당 등록 번호로 라벨을 붙입니다. 각 플라스크의 배지를 세포 단층을 덮을 정도의 최소량만 남기고 대부분 폐기 용기에 따라 버립니다.

각 모기 균질액의 상층액 100 µL를 해당 라벨이 붙은 플라스크에 옮기고 플라스크를 단단히 밀봉합니다. 상층액 이동이 완료되면, 플라스크를 35~40 RRP M로 설정된 셰이커에 넣고 5분 동안 작동시킵니다. 플라스크를 다시 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮긴 후, 각 플라스크에 배양액 4 mL를 추가합니다.

플라스크의 캡을 닫고 37°C, 5% CO2 조건에서 3~7일 동안 배양합니다. 배양액의 스크리닝 준비가 되면, 먼저 배지를 육안으로 확인합니다. 배지가 혼탁한 것은 바이러스로 인한 세포병변효과(cytopathic effects) 또는 다른 미생물 오염, 혹은 두 가지 모두가 발생했음을 나타내므로, 배지가 혼탁한 배양액을 도립 광학 현미경으로 관찰하십시오.

바이러스는 일반적으로 세포의 변형을 유도하며 배양 플라스크에서 세포가 탈락하게 만듭니다. 박테리아, 효모 또는 진균에 의한 오염이 감지되거나 배양액에 모기 잔해물이 많이 포함되어 있는 경우, 0.22 micron 시린지 필터로 여과한 후 원래의 모기 풀을 재검사하십시오. 다른 미생물에 오염되지 않은 바이러스 양성 배양액에서 1~2 mL의 배지를 무균적으로 여과하여 라벨이 부착된 크라이오 튜브에 분주하십시오.

본 분석법을 이용한 적절한 진단 분석을 통한 확인 전까지, 바이러스가 포함된 시료를 -80°C에서 보관하십시오. 1997년부터 2010년까지의 지속적인 주 전역 감시 기간 동안 커네티컷에서 수집한 모기에서 4가지 분류학적 과에 속하는 9가지 서로 다른 유형의 바이러스가 회수되었습니다. 동부 말 뇌염 바이러스(Eastern equine encephalitis virus)와 웨스트나일 바이러스(West Nile Virus)를 포함하여 이러한 바이러스 중 일부는 인간 질병을 유발하는 것으로 알려져 있습니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 바이러스 세포 배양 분석법을 통해 바이러스 감염 여부에 따라 모기를 분류, 처리 및 선별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.