Name: 베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 학습하세요 베로 세포 배양 분석을 이용해 야외 수집 모기에서 다양한 바이러스 감염을 검출하는 방법을. 이 기술은 4개 분류군에서 9종 바이러스를 확인하여 모기 매개 바이러스 생태학 연구에 활용됩니다.

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우리는 기꺼이 DRS의 중요한 기여를 인정합니다. 존 앤더슨, 앤드류 메인이 공부 셜리 티렐. 이 작품은 질병 통제 및 예방 (U50/CCU116806-01-1)와 농업의 미국학과 (58-6615-1-218, CONH00768 및 CONH00773)의 센터에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다.

1. 모기 분류 및 식별 <ol><li> 다음 절차는 라이브 모기와 함께 작동하도록 훈련 직원 전용 biosafety 레벨 2 (BSL - 2) 실험실에서 열린 실험실 벤치에서 수행됩니다. &quot;차가운 체인은&quot;절차를 통해 유지됩니다. </li><li> 5 분 -20 °의 냉장고 안에 모기 수집 봉투를 배치하여 성인 모기에 살고 마취. 드라이 아이스가 들어있는 절연 컨테이너로 전송 수거 봉투. 뚜껑을 닫고 노크 다운 완료 확인으로 1-3 분 탄소 이산화탄소로 모기를 노출. </li><li> 드라이 아이스의 침대에 배치 미리 차게 냄비에 anesthetized 모기를 누릅니다. 좋은 포셉 및 플라스틱 부분 컵에서 개최를 사용하여 별도의 개별 여성 모기. 서부 유럽 표준시 얼음 덮개 및 장소 컵을 함께 커버. </li><li> 스테레오 해부 현미경 (10 - 60X 줌)의 도움으로 외부 모기 형태에 따라 설명 taxonomic 키를 사용하여 수종으로 모기를 적어 전자 진정 테이블에 장착. </li><li> 구리 BB를 포함하는 두 ML 스냅 캡 튜브 안에 ≤ 50 개인 수영장에 모기 종을 확인 결합합니다. 튜브는 고유 식별자로 표시됩니다. </li><li> 모든 모기의 식별 다음, 유리병이 표시 봉지에 배치하고 드라이 아이스가 들어있는 스티로폼 쿨러에서 개최. </li><li> 바이러스 검사 전까지 -80 ° C 냉동고에 모기 풀을 저장합니다. </li></ol> 2. 모기로부터 바이러스를 분리하기 위해 Biosafety 고려 사항 <ol><li> 다음 절차는 억제 1이 수준에서 작동하도록 훈련 직원에 의해 biosafety 레벨 3 (BSL - 3) 실험실에서 수행됩니다. 연구소 시설, 장비, 절차 및 관행, 제도적 주, 그리고 연방 정부 감독 및 검사에 따라 달라질 수 있습니다. 다음과 같은 프로토콜을 시도하기 전에 적절한 교육 및 승인을 추구합니다. </li><li> 일회용 가운, 장갑, 얼굴 방패, 그리고 호흡기 등 각 절차에 대해 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오. </li><li> 작성 절차 이전과 이후 70 %의 알코올로 작업 표면을 소독. </li><li> 세포 문화와 잠재적으로 전염성이 자료는 클래스 II biosafety 캐비닛 (BSC)에 처리됩니다. </li><li> 모기 수영장은 BSC 안에있는 믹서 - 공장에서 균질하고 있습니다. </li><li> 모기 homogenates는 에어로졸 - 꽉 microcentrifuge에 centrifuged 있습니다. 이 절차는 BSC 내에 수행할 수없는 경우에는 원심에서 샘플을 운영하고 검색할 때 연산자는 인공 호흡기를 착용해야합니다. </li><li> Pipets과 BSC (biosafety 캐비닛)의 자료를 처리 pipet 팁 전에 autoclaving 10 %의 표백제에 배어있다. 모든 실험실 폐기물은 처리하기 전에 autoclaving하여 소독합니다. </li></ol> 3. 베로 세포의 준비 <ol><li> 표백제를 포함하는 폐기물의 비커에 합류 베로 세포 (클론 E6) 중 하나 큰 조직 문화 플라스크 (175cm 2)에서 가만히 따르다 문화 미디어. </li><li> 5 ML의 PBS의 나누어지는과 세포의 층 이상의 철저하게 전체 monolayer를 커버해야하고 플라스크의 면을 따라 소용돌이를 추가하여 베로 세포를 씻으십시오. </li><li> 폐기물 비커에 가만히 따르다 PBS. </li><li> 2.5 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) ML 철저 전체 monolayer를 커버해야하는 세포의 층 이상의 소용돌이를 추가합니다. </li><li> 37 5 분 배양기에서 술병을 품어 ° C, 5 % CO 2. </li><li> 천천히 바닥 표면의 세포를 제거하는 흔들 소용돌이 술병. 세포는 쉽게 밀어해야한다 세포가 쉽게 밀어하지 않으면 추가 1~5분을 품어. </li><li> 5 최소 에센셜 미디어 ML (멤) 5 % 태아 소 혈청 (FBS), serological pipet을 사용하고 pipet 추가 위쪽 및 다운 세포의 대단히 짧은 시간을 해산시키기 위해 평균의 10 배에서 20 배를. </li><li> 22.5 ML 총 볼륨에 대한 추가 15 ML 멤 5 % FBS를 추가하고 잘 섞는다. </li><li> 직립이 랙 (20 flasks / 랙)에 넣어 40 작은 조직 문화 flasks (25cm 2). </li><li> biosafety 캐비닛 내부 flasks가 들어있는 랙에를 놓고 직접 flasks 앞에서 모자를 배​​치, 플라스크의 뚜껑을 제거합니다. </li><li> serological pipet을 사용하여 각 플라스크에 멤 5 % FBS 4 ML 하는걸. </li><li> 각 플라스크 (~ 1시 6분 분할 비율) 플라스크의 뚜껑을 교체로 0.5 ML 정지 세포를 분배. </li><li> 나머지 세포 현탁액 (~ 2.5 MLS)를 포함하는 원래 큰 조직 문화 플라스크로 5 % FBS를 멤 50 ML를 추가하고 배양기에 술병을 반환합니다. 같은 큰 조직 문화 플라스크 5 구절까지 다시 사용할 수 있습니다 그리고 새로운 플라스크 그것을 대체하는 설정해야합니다. </li><li> 플레이스 작은 조직 문화는 트레이에 스택에 flasks. 미디어 균일 flaks의 바닥을 커버 있는지 확인 소용돌이 트레이. </li><li> 37 보육 작은 flasks를 삽입 ° C, 5 % CO 2 80~90%의 합류하기 전까지 밤새 성장. </li></ol> 4. 모기 수영장의 준비 <ol><li> 시험 절차 동안 모기 수영장 감기 유지. 사전 냉장 사용냉동고 랙에 및 믹서 - 밀 카세트, 얼음처럼 차가운 시약 및 냉장 원심 분리기 모기 수영장 처리. </li><li> 플레이스 튜브는 미리 냉장 냉동고 걸이에 모기가 포함된 추가 1 - 1.5 ML PBS - G를 모기 각 튜브 수 있습니다. </li><li> 냉동고에서 믹서 - 밀 카세트를 검색합니다. 믹서 - 공장에서 안전하게 다음 각 카세트로 24 튜브를 삽입합니다. </li><li> 25 사이클 / 초 4 분 동안 샘플을 균질. 믹서 밀 모기 조직을 방해 각 관 내부에 고속 및 금속 BB에서 튜브를 쉐이크. </li><li> 7,000 RPM 6 분 튜브를 원심 분리기. </li><li> 다시 냉동실 랙에에 플레이스 튜브는 베로 세포에 주사까지. </li></ol> 5. 모기 수영장 homogenates와 베로 세포의 접종 <ol><li> 적절한 confluency과 세포의 건강을 보장하기 위해 거꾸로 현미경으로 각 시리즈에서 하나 이상의 조직 문화 플라스크를 확인, 80~90% 보도에 대해 기대하고 있습니다. </li><li> 서 각 모기 수영장에서 해당 가입 번호와 랙 및 레이블 flasks 20 작은 조직 문화 flasks합니다. </li><li> 모자 및 폐기물 비커에 조직 문화 flasks에서 미디어를 가만히 따르다 대부분을 풀어. 완전히 외투 세포 monolayer에 술병 충분한 미디어를 둡니다. </li><li> 해당 조직 문화 플라스크에 각각의 처리 모기 수영장에서 뜨는의 나누어지는의 100μL. </li><li> 교체 및 문화 술병 뚜껑을 조입니다. </li><li> 35-40 RPM에서 5 분 (실온)에 대한 쉐이크에 문화 flasks는 평평하다. </li><li> BSC의 랙과 장소에 수직으로 위치 20 조직 문화 flasks를 반환합니다. </li><li> 한 번에 세 조직 문화 flasks을 Uncapping, serological 피펫을 사용하여 각 플라스크에 4 ML 성장 미디어를 분배, 모자를 교체하십시오. </li><li> 피펫 팁의 문화 술병 넥이나 입술에 문의하지 있는지 확인하십시오. 연락이 술병으로 만든 경우 필요에 따라 피펫 팁을 변경합니다. </li><li> 37 품어 조직 문화 flasks ° C 5 % CO 2. </li></ol> 6. 바이러스 성장 베로 세포 검사 <ol><li> 화면 3-7일 이후 접종에서 바이러스 감염의 징후, cytopathic 효과 (CPE)에 대한 조직 문화 flasks을 주사. </li><li> 시각 틸팅 flasks로 CPE 및 / 또는 오염 물질에 대한 세포 문화를 검사하고 미디어를 검사 술병의 하단에있는 수영장. 세포 CPE 동안 저하 또는 효모, 균류, 또는 세균 오염의 증가로 인해 같은 미디어 뿌연 나타납니다. </li><li> 거꾸로 현미경 흐림 미디어를 전시 셀 문화를 다시 확인합니다. 바이러스는 세포가 변형되기와 문화 flasks에서 풀어 휴식합니다 발생할 것입니다. 눈에 보이는 오염 물질, 예를 들어 효모, 다른 박테리아, 균류 또는 무거운 모기 부스러기와 세포 문화는 0.22μM 주사기 필터를 통해 원래 모기 풀을 통과하여 다시 테스트합니다. </li><li> 무균 serological 피펫을 사용하여 레이블 cryotubes에 바이러스 양성 세포 배양에서 미디어 1-2 MLS 하는걸. </li><li> 바이러스 문화가 -80에 저장됩니다 ° C 적절한 진단 assays를 사용하여 확인하기 전까지. </li></ol> 7. 시약의 준비 <ol><li> 멤 5 % FBS. DD H 2 0 4 패의 최종 볼륨 가루 멤의 37.6 g을 디졸브. 미디어 병 및 압력솥 500 ML aliquots에 솔루션을 분배. 솔루션 냉각되면, 무균 각 병 26 ML 열 - inactivated 태아 소 혈청, 5.2 ML L - 글루타민, 5.2 ML의 anti-biotic/mycotic, 그리고 10.4 ML 7.5 % 나트륨 중탄산염를 추가합니다. 4 스토어 ° C. </li><li> PBS - G. 16g NaCl, 0.4 g KCl 2.3 g 나 2 HPO 4 0.4 g KH 2 PO 4, 0.5 % 페놀 레드의 4 ML 1000 ML DD H 2 0으로를 해산. 2 N NaOH (필요한 경우)을 7.1-7.4로 산도를 조정합니다. 별도의 비이커에서 물에 H 2 0 열 600 ML. 핫 플레이트에서 제거, 10g 젤라틴을 추가하고, 디졸브. PBS 용액에 녹아 젤라틴 솔루션을 추가하고 DD H 2 O. 2 L로 최종 음량을 조절 병 및 압력솥으로 솔루션의 100 ML 하는걸. 솔루션 냉각되면, 무균 42.8 ML 열 inactivated 토끼 혈청과 1.4 ML의 anti-biotic/mycotic를 추가합니다. 4 스토어 ° C. </li><li> PBS 셀 씻으십시오. 400 ML DD H 2 O. 50 ML 10X Dulbecco의 PBS를 추가 2 N NaOH와 7.1 산도를 조정합니다. DD H 2 O. 500 ML에 마지막으로 볼륨을 조정 0.2uM 진공 필터 유닛으로 필터 솔루션입니다. 8 ML 나사 캡 튜브 5 ML aliquots로 분배. 4 스토어 ° C. </li></ol> 8. 대표 결과 4 taxonomic 가정에서 바이러스의 아홉 가지는 1997년에서 2010년까지 (표 1)에서 코네티컷에서 지속적인 감시를 통해 수집된 주 내의 모기로부터 복구되었습니다. 이러한 바이러스의 다섯 인간 질병, 웨스트 나일 바이러스와 동부 에콰인 뇌염 바이러스되고있는 가장 중요한 병원체를 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 새로운 발견은 다음과 같습니다 수집 모기에서 WNV의 첫 절연을1999 2 북미, 2005 4 2000 3 북동부 미국의 포토 바이러스 첫 분리 및 뉴잉글랜드에 라 크로스 바이러스의 첫 고립. <table border="1"><tbody><tr><td> 바이러스 </td><td> 가족 </td><td> 번호 격리 </td><td> 번호 위치 </td><td> 번호 년이 감지 </td><td> 인간 질병 </td><td> 심판. </td></tr><tr><td> 웨스트 나일 바이러스 </td><td> Flaviviridae </td><td> 1002 </td><td> 94 </td><td> 12 </td><td> 심한, 발열, 뇌염을 검토 </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> 동부 에콰인 뇌염 바이러스 </td><td> Togaviridae </td><td> 292 </td><td> 41 </td><td> 10 </td><td> 심한, 뇌염 </td><td> 6,7 </td></tr><tr><td> 히글란즈 J 바이러스 </td><td> Togaviridae </td><td> 178 </td><td> 39 </td><td> 11 </td><td> 알 수없는 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 제임스 타운 캐년 바이러스 </td><td> Bunyaviridae </td><td> 305 </td><td> 74 </td><td> 14 </td><td> 중간에 가벼운, 발열, 수막염 </td><td> 8 </td></tr><tr><td> 포토 바이러스 </td><td> Bunyaviridae </td><td> 259 </td><td> 76 </td><td> 4 </td><td> 알 수없는 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> 캐쉬 밸리 바이러스 </td><td> Bunyaviridae </td><td> 114 </td><td> 51 </td><td> 8 </td><td> 이 문서의 경우 심한, 발열, 신경 질환에 약한 </td><td></td></tr><tr><td> Trivittatus 바이러스 </td><td> Bunyaviridae </td><td> 83 </td><td> 21 </td><td> 11 </td><td> 알 수없는 </td><td></td></tr><tr><td> 라 크로스 바이러스 </td><td> Bunyaviridae </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 심각한, 뇌염을 검토 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 플랜더스 바이러스 </td><td> Rhabdoviridae </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> 알 수없는 </td><td></td></tr></tbody></table> 표 1. 바이러스는 베로 세포 배양 분석하여 현장 수집 모기에서 발견했습니다. 모기는 1997년부터 2010년까지에서 코네티컷에있는 주 내의 감시 수집된되었습니다.

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<li>Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+North+American+eastern+and+western+equine+encephalitis+viruses+by+nucleic+acid+amplification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays.</a> J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

베로 세포 배양 분석은 바이러스의 다양성을위한 화면 필드 수집 모기에 효과적인 방법으로 제공하고 있습니다. 이것은 구체적으로 목표 하나 또는 관심있는 몇 가지 바이러스 분자 방법 대조를 이룹니다. 또한, 우리는 베로 세포 배양 분석이 똑같이 RT - PCR 7보다 민감한 경우가 아니므로 미래 연구를위한 참조 컬렉션에 저장된 바이러스 격리 우리에게 제공하는 것으로 나타났습니다. 그럼에도 불구하고, 세포 배양 시스템은 많은 경우에 적합하지 않을 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 추가적인 비용과 BSL - 3 실험실에서 바이러스를 성장하는 데 필요한 훈련을 incurs 있지만, 이러한 비용은 세포 배양에 대해 상대적으로 저렴한 공급에 의해 상쇄 수 있습니다. 그것은 또한 대부분의 전부는 아니지만 모기가 전파되는 바이러스가 베로 세포 배양 9,10의 CPE를 생산 협조할 것입니다. 뎅그열 바이러스는 다른 진단 검사에 의해 검사를해야 하나 주목할만한 예외입니다. 이상적으로, 분자 및 세포 모두 문...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 / 장비 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16,140 </td></tr><tr><td> Anti-biotic/mycotic </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15,240 </td></tr><tr><td> 나트륨 중탄산염 NaHCO 3, 7.5 % Soln. </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25,080 </td></tr><tr><td> L - 글루타민 200mM 100x </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 25,030 </td></tr><tr><td> 가루 최소한의 필수적인 매체 (멤) </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 11,700 </td></tr><tr><td> 10X Dulbecco의 PBS </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 14,080 </td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 15,400 </td></tr><tr><td> 토끼 혈청 </td><td> Gibco - Invitrogen </td><td> 16,120 </td></tr><tr><td> 베로 세포 (클론 E6) </td><td> ATCC </td><td> CRL - 1586 </td></tr><tr><td> 작은 조직 문화 flasks, 통풍 모자, 25cm이 </td><td> 팔콘 - 백톤 디킨슨 </td><td> 353112 </td></tr><tr><td> 대형 조직 문화 flasks, 통풍 모자, 175cm 2 </td><td> 팔콘 - 백톤 디킨슨 </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> 구리 코팅 BB의 4.5 mm </td><td> Crosman </td><td> 0767 </td></tr><tr><td> 믹서 밀 </td><td> Retsch </td><td> MM300 </td></tr><tr><td> Isopack 냉동기 랙에 </td><td> Eppendorf </td><td> 022510240 </td></tr></tbody></table>

베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

모기는 웨스트 나일 바이러스, 뎅그열 바이러스 및 chickungunya 바이러스와 같은 중요한 인간 병원균을 포함하여 별개의 바이러스의 숫자를 전송. 이 바이러스의 대부분은 자신의 발병 범위의 강화와 새로운 영역을 확장, 이러한 위협에 대응하는 효과적인 감시 및 제어 프로그램을 necessitating 있습니다. 바이러스 활동을 모니터링하는 한 가지 전략은 발병 사이트 모기의 대규모 번호를 수집하고 바이러스 감염을 테스트 포함됩니다. 이 문서에서는, 우리는 처리하는 방법을 과정을 설명하고, 베로 세포 배양 분석하여 전염성 바이러스에 모기를 현장 수집 화면. 모기가 트랩 위치와 수종별로 분류하고, ≤ 50 개인가 들어있는 수영장으로 분류됩니다. 풀링 표본은 믹서 - 공장 및 수성 단계가 합류 베로 세포 배양 (복제 E6)에 주사됩니다를 사용하여 버퍼 호수에 균질하고 있습니다. 세포 배양은 3-7 이후 접종 및 세포 배양 재배 바이러스가 적절한 진단 assays에 의해 식별됩니다 시절부터 cytopathic 효과에 대한 모니터링입니다. 이 방법을 이용하여, 우리는 코네티컷, 미국에서 수집한 모기에서 9 가지 바이러스를 격리 있고,이 중에서 5 인​​간의 질병을 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 이러한 바이러스의 세 (웨스트 나일 바이러스, 포토 바이러스와 라 크로스 바이러스) 북미 또는 1999 년 이후 뉴잉글랜드 지역에 대한 새로운 기록을 나타냅니다. 바이러스의 광범위한 다양성을 감지하는 능력은 모두 모기가 인구에 설립하고 최근 새로운 바이러스 모니터링하는 것이 중요합니다.

우리는 처리 방법을 설명하고 화면의 필드 수집 베로 세포 배양 분석에 의해 바이러스의 다양성을 위해 모기. 이 기술을 채용함으로써, 우리는 코네티컷에서 수집한 모기 4 taxonomic 가정에서 9 가지 바이러스를 감지했습니다.

모기는 웨스트나일 바이러스, 뎅기 바이러스, 치쿤구니야 바이러스와 같은 주요 인체 병원체를 포함하여 여러 종류의 뚜렷한 바이러스를 전파합니다. 많은...

이 절차의 전반적인 목표는 Vero 세포 배양 분석을 통해 야외에서 수집한 모기의 바이러스 감염 여부를 스크리닝하는 것입니다. 먼저, 야외에서 수집한 모기를 종별로 분류합니다. 그런 다음 믹서 밀(mixer mill)을 사용하여 모기를 균질화합니다.모기 균질액이 준비되면, 바이러스 검사를 위해 Vero 세포를 배양합니다. 각 Vero 세포 배양액에 단일 모기 균질액을 접종한 후 셰이커에서 5분 동안 흔들어 섞고, 바이러스가 증식할 수 있도록 37 °C에서 배양합니다. 최종적으로, 배양액을 육안으로 관찰하여 바이러스로 인한 세포변성효과(cytopathic effects)의 증거가 있는지 확인합니다. RT-PCR과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 세포 배양에서 성장하는 매우 다양한 종류의 바이러스 인자를 대상으로 모기를 스크리닝할 수 있다는 점입니다.이 방법은 다양한 모기 종이 바이러스 전파를 지원하는 데 어떤 역할을 하는지와 같이 의료 곤충학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 다음 절차에는 생물안전 2등급 시설을 사용하십시오. 살아있는 모기가 들어 있는 채집 봉투를 -20°C에서 15분 동안 두어 마취시킵니다.곤충이 마취되면, 봉투를 드라이아이스가 들어 있는 단열 용기로 옮겨 모기를 이산화탄소에 1~3분 동안 노출시켜 완전히 무력화합니다. 다음으로, 드라이아이스 위에 놓인 미리 냉각된 팬 위에 모기를 올립니다. 미세 팁 포셉을 사용하여 암컷 곤충을 식별하고 이를 플라스틱 분할 컵으로 옮깁니다.입틀과 촉각을 검사하여 암컷과 수컷을 구분할 수 있습니다. 컵을 밀폐하고 젖은 얼음 위에 놓으십시오. 전자 냉각 테이블에 설치된 실체 해부 현미경과 분류 키를 사용하십시오.각 모기 풀의 종을 식별하고, 동일한 종의 모기들을 구리 공이 들어 있는 라벨이 부착된 2 mL 스냅 캡 바이알에 넣으십시오. 튜브가 찰 때까지 한 튜브에 최대 50마리까지 풀링할 수 있습니다. 바이알을 라벨이 부착된 봉투에 넣어 드라이아이스가 담긴 스티로폼 용기에 보관하십시오.모든 모기의 동정이 완료되면, 균질화 전까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 이 절차를 위해 생물안전 3등급(BSL-3) 시설을 이용하고, 2등급 생물안전 작업대(class two biosafety cabinet) 내에서 작업하십시오. 튜브당 약 1 mL의 PBSG를 첨가하고, 모기가 담긴 튜브를 미리 냉각된 믹서 밀(mixer mill) 카세트에 넣습니다.적재된 카세트를 믹서 밀(mixer mill)에 고정하고, 초당 25회 사이클로 4분 동안 모기 풀(mosquito pools)을 균질화합니다. 모기가 균질화되면 튜브를 에어로졸 차단 냉장 원심분리기로 옮겨 원심분리합니다. 모기 균질액을 7,000 RPM에서 6분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 바이러스 테스트 전까지 튜브를 -80°C에서 보관할 수 있습니다. 합류(confluent)된 farrow 세포가 담긴 T 175 플라스크에서 배양액을 표백제가 들어 있는 폐기 비커에 따라냅니다. 플라스크에 5 mL의 PBS를 넣고 세포를 고르게 세척한 후, PBS를 폐기 비커에 따라냅니다.세포를 세척한 후, 2.5 mL의 trypsin EDTA를 넣고 플라스크를 37 °C, 5% CO2 조건에서 5분 동안 배양하여 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면 5 mL의 MEM을 넣고 파이펫으로 세포 용액을 여러 번 위아래로 섞어 뭉친 세포 덩어리를 풀어줍니다. 그런 다음 MEM 15 mL를 추가로 넣습니다.생물안전작업대(biosafety cabinet) 내의 랙 두 개에 T 25 플라스크 40개를 배치하고 플라스크 캡을 제거하여 각 플라스크 바로 앞에 둡니다. 멸균 피펫을 사용하여 각 플라스크에 4 mL의 MEM을 분주합니다. 그다음 0.5 mL의 부유된 vari 세포를 첨가하고 플라스크 캡을 닫습니다. 플라스크를 트레이에 쌓고 부드럽게 흔들어 배지가 플라스크 바닥을 균일하게 덮도록 합니다.배양물을 37 °C, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 또는 세포의 밀도가 80~90% confluence가 될 때까지 배양합니다. 인큐베이터에서 소형 플라스크 20개를 꺼내어 각 모기 풀(pool)의 해당 등록 번호로 라벨을 붙입니다. 각 플라스크의 배지를 세포 단층을 덮을 정도의 최소량만 남기고 대부분 폐기 용기에 따라 버립니다.각 모기 균질액의 상층액 100 µL를 해당 라벨이 붙은 플라스크에 옮기고 플라스크를 단단히 밀봉합니다. 상층액 이동이 완료되면, 플라스크를 35~40 RRP M로 설정된 셰이커에 넣고 5분 동안 작동시킵니다. 플라스크를 다시 생물안전작업대(biosafety cabinet)로 옮긴 후, 각 플라스크에 배양액 4 mL를 추가합니다.플라스크의 캡을 닫고 37°C, 5% CO2 조건에서 3~7일 동안 배양합니다. 배양액의 스크리닝 준비가 되면, 먼저 배지를 육안으로 확인합니다. 배지가 혼탁한 것은 바이러스로 인한 세포병변효과(cytopathic effects) 또는 다른 미생물 오염, 혹은 두 가지 모두가 발생했음을 나타내므로, 배지가 혼탁한 배양액을 도립 광학 현미경으로 관찰하십시오.바이러스는 일반적으로 세포의 변형을 유도하며 배양 플라스크에서 세포가 탈락하게 만듭니다. 박테리아, 효모 또는 진균에 의한 오염이 감지되거나 배양액에 모기 잔해물이 많이 포함되어 있는 경우, 0.22 micron 시린지 필터로 여과한 후 원래의 모기 풀을 재검사하십시오. 다른 미생물에 오염되지 않은 바이러스 양성 배양액에서 1~2 mL의 배지를 무균적으로 여과하여 라벨이 부착된 크라이오 튜브에 분주하십시오.본 분석법을 이용한 적절한 진단 분석을 통한 확인 전까지, 바이러스가 포함된 시료를 -80°C에서 보관하십시오. 1997년부터 2010년까지의 지속적인 주 전역 감시 기간 동안 커네티컷에서 수집한 모기에서 4가지 분류학적 과에 속하는 9가지 서로 다른 유형의 바이러스가 회수되었습니다. 동부 말 뇌염 바이러스(Eastern equine encephalitis virus)와 웨스트나일 바이러스(West Nile Virus)를 포함하여 이러한 바이러스 중 일부는 인간 질병을 유발하는 것으로 알려져 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 바이러스 세포 배양 분석법을 통해 바이러스 감염 여부에 따라 모기를 분류, 처리 및 선별하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

detection-infectious-virus-from-field-collected-mosquitoes-vero-cell

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

체외에서 성인 모기에 형광 기자를 표현하는 alphavirus transducing 시스템을 사용 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 대신 또는 기자 이외에 관심있는 단백질을 표현하는 적응 수 있습니다.

Alphavirus Transducing 시스템 : 모기 벡터의 감염을 떠올리을위한 도구

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Isolation of Mosquito-Associated Virus from Mosquito Homogenate

이 비디오는 지카 바이러스 회복기 혈청을 사용하여 뎅기열 바이러스 감염의 항체 의존성 향상(ADE)을 측정하는 분석을 보여줍니다. 이 분석은 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 뎅기열 리포터 바이러스 입자(RVP)를 사용합니다. 지카 바이러스에 대한 혈청 항체는 RVP와 교차 반응하여 복합체를 형성합니다. 결합된 항체는 Fc 수용체를 발현하는 세포의 RVP 흡수를 향상시키며, 이는 유세포 분석을 사용하여 검출됩니다.

바이러스 감염의 항체 의존성 증진을 조사하기 위한 In vitro assay

지카 바이러스(ZIKV)는 신종 병원체로, 태아 발달 이상 및 소두증과 관련이 있습니다. 효과적인 감염성 세포 배양 시스템의 구축은 ZIKV 복제 연구와 백신 및 약물 개발에 매우 중요합니다. 본 연구에서는 ZIKV와 관련된 다양한 바이러스 분석을 설명하고 논의합니다.

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

현재 다중화 Zika, chikungunya, 뎅 그 열 바이러스 복잡 한 샘플 준비 및 비싼 장비를 요구 하 고 저 리소스 환경에서 사용 하기 어려운 검출 하는 진단. 우리는 감지 하 여 높은 감도와 특이성이이 바이러스를 차별화 대상 특정 가닥 displaceable 프로브 등온 증폭을 사용 하는 진단을 보여줍니다.

멀티플렉스 등온 증폭 Zika, Chikungunya, 뎅 그 열의 1 감지 진단 플랫폼을 기반으로

여기, 선물이 arbovirus 복제 및 arbovirus 복제를 제한 하는 2) 진 핵 호스트 요인 1) 바이러스 인코딩된 immunomodulators 식별 프로토콜. 이러한 형광 및 발광 기반 방법을 빠르게 낮은 신호 대 잡음 비율 단순한 분석에 arbovirus 복제의 양적 정보를 연구 수 있습니다.

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

제시된 프로토콜은 봉쇄 환경에서 Zika와 같은 주어진 바이러스에 대한 Aedes aegypti 모기 집단의 벡터 역량을 결정할 수 있다.

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

이 프로토콜은 모기에서 타액선 포자석을 검출하기 위한 샌드위치 효소 결합 면역 흡착 분석을 설명합니다. 쉽게 구할 수 있는 단클론 항체를 사용하는 이 방법은 Plasmodium falciparum 또는 Plasmodium vivax를 운반하는 모기를 비용 효율적으로 고처리량으로 검출할 수 있습니다. 이 방법은 매개체 조사를 포함한 말라리아 전염 연구에 적합합니다.

효소 결합 면역 흡착 분석을 사용한 Anopheles 모기의 Plasmodium sporozoites 검출

경구 수유 및 흉강내 주사 감염을 포함하는 이 방법론은 아르보 바이러스 감염에 대한 중장 및/또는 침샘 장벽의 영향을 효과적으로 평가할 수 있습니다.

경구 수유 및 미세 주입에 의한 성인 모기의 실험적 바이러스 감염

수많은 새로운 바이러스 유사 서열이 시퀀싱 기술의 광범위한 사용으로 인해 모기에서 발견되었습니다. 우리는 척추동물 및 모기 세포주를 사용하여 바이러스를 분리하고 증폭하는 효과적인 절차를 제공하며, 이는 모기 매개 및 모기 특이적 바이러스를 포함한 모기 관련 바이러스에 대한 향후 연구의 기초가 될 수 있습니다.

현장에서 채취한 모기로부터 모기 관련 바이러스 분리

본 프로토콜은 베로 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포에서 지카 바이러스(ZIKV)의 증식과 24웰 및 96웰(고처리량) 형식의 세포 기반 비색 면역검출 방법을 사용한 ZIKV의 정량화에 대해 설명합니다.

바이러스 전파 및 세포 기반 비색 정량화

학습하세요 베로 세포 배양 분석을 이용해 야외 수집 모기에서 다양한 바이러스 감염을 검출하는 방법을. 이 기술은 4개 분류군에서 9종 바이러스를 확인하여 모기 매개 바이러스 생태학 연구에 활용됩니다.

베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출

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