생물 학적 시스템에서 이온 농도의 측정을위한 형광 Nanoparticles

다음 실험의 전반적인 목적은 인비트로(in vitro) 및 인비보(in vivo) 응용을 위한 나트륨 나노센서를 제작하는 것입니다. 이는 나노센서의 센서 성분을 포함하는 옵토(opto) 혼합물을 준비함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계로, 수용액 내에서 계면활성제를 초음파 처리하여 균일하게 분산시키며, 이후 옵토를 첨가하면 나노센서가 형성됩니다.

다음으로, 용액 상태의 나노센서를 형성하기 위해 초음파 처리 하에 수성 계면활성제 혼합물에 광학 혼합물을 첨가합니다. 이 영상은 센서 응답이 조절 가능함을 보여줍니다. 센서는 심근세포에 미세 주입할 수 있으며, 마우스의 피하로도 주입할 수 있습니다.

형광 지시약 염료와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 센서를 생리학적 환경에 맞는 동적 범위로 조정할 수 있고, 더 넓은 범위의 분석물을 측정하며, 정량 분석을 위한 비례 측정(ratiometric measurements)을 수행할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 센서를 제작한 후 이를 생물학적 환경에 도입하는 과정에서 어려움을 겪을 수 있습니다. 옵토센서(opto-sensor)를 제작하기 전, 작성된 프로토콜에 따라 건조된 sodium ion four x, 건조된 sodium TFPB 및 chromo four three의 스톡 용액을 미리 준비해야 합니다.

흄 후드 내에서 모든 재료를 1.5 milliliter 유리 바이알에 혼합합니다. 테플론 코팅 스크류 캡을 닫고, 모든 PVC가 용해될 때까지 바이알을 가볍게 볼텍싱합니다. 용액은 붉은색으로 보여야 합니다.

4 g 유리 바이알에 10 mg/mL PEG 지질 100 µL를 넣어 나노센서 제작을 시작합니다. 그다음, 10 mM HEPES와 같은 원하는 수용액 4 mL를 추가합니다.

실험실 잭을 사용하여 초음파 처리 팁을 바이알 안으로 7 mm 깊이까지 삽입하고, 30초 동안 낮은 출력으로 초음파 처리를 수행합니다. 0.6 mL 튜브에 옵토 재료 50 µL와 디클로로메탄 50 µL를 넣고 피펫을 사용하여 고르게 혼합합니다. 다음으로, 3분 동안 초음파 처리를 시작합니다.

초음파 처리를 시작하면서, 피펫 팁을 담근 후 100 µL의 opto 혼합물을 한 번에 빠르고 균일하게 주입하십시오. pH가 7 이상으로 상승하거나, 용액에서 잔류 THF 및 di chloro methane을 제거할 나트륨이 없는 경우 용액이 파란색으로 변합니다. 소니케이터 팁을 2 mm 깊이로 이동시키십시오.

남은 3분이 지나면 용액이 불투명해집니다. 초음파 처리가 완료되면, 5mL 시린지로 나노센서 용액을 빨아들입니다. 필터를 부착하고 나노센서 용액을 스크류 캡이 있는 유리 바이알에 분주합니다.

나노센서의 민감도를 측정하기 위해 나트륨 농도를 점진적으로 높인 10가지 용액을 만드는 것부터 시작합니다. 50 milliliter 원뿔형 튜브에 0 M 및 1 M 나트륨 스톡 용액을 혼합합니다. 이제 광학 바닥 96웰 플레이트의 한 열에 있는 3개의 웰에 각 농도의 나트륨 용액을 100 microliters씩 첨가합니다.

그 후, 각 웰에 갓 준비한 나노센서 100 µL를 첨가하고 플레이트를 마이크로플레이트 형광 광도계에 넣은 다음, 사용 중인 발색단에 최적화된 들뜸, 방출 및 컷오프 파장을 입력합니다. 측정 파장의 선택은 응용 분야에 따라 다릅니다. 이러한 파장들은 세포 내 빠른 역학 측정 또는 노이즈 감소를 가능하게 합니다.

알파 값을 구하려면 570 nm에서의 강도 비율을 670 nm 또는 680 nm에서의 강도로 나눕니다. 알파 값을 나트륨 농도의 로그 값에 대해 도식화합니다. 이때 나트륨 농도가 0일 때의 로그 값은 -1로 설정합니다.

이제 반응 결과에 시그모이드 곡선을 맞추고, 해당 곡선에서 알파 값이 0.5가 되는 나트륨 농도를 계산하십시오. 이는 센서가 최적으로 반응하는 나트륨 농도를 나타냅니다. 이 정보를 사용하여 opto 내의 sodium iono four x sodium TFPB와 chromo iono four three의 비율을 조정함으로써 최적의 나트륨 농도를 가진 나노센서를 제작하십시오.

예를 들어, 네 가지 10의 나트륨 양만 다르게 하여 서로 다른 광학 제형을 나타내는 다섯 가지 서로 다른 나노센서 세트의 히어로 응답 곡선을 보여줍니다. 세포 내 이미징을 위해서는 세포 배지를 Tyro 용액과 같은 투명한 배지로 교체하고 세포를 이미징 챔버로 옮깁니다. 이제 당겨진 유리 피펫을 물에 녹인 5 mg/mL 포도당으로 제조한 나노센서 용액으로 다시 채웁니다.

그 다음 피펫을 마이크로 조작기에 장착하고 압력 제어 주입 시스템에 연결합니다. 피펫을 세포 위로 내려 세포질 내부로 진입시킵니다. 때로는 막을 관통시키기 위해 조작기 홀더를 가볍게 두드려야 할 수도 있습니다.

수백 picoliter의 나노센서 용액을 주입한 후 피펫을 빠르게 제거합니다. 마취 챔버를 사용하여 isof fluorine으로 CD one 누드 마우스를 마취합니다. 마취가 되면 마우스를 소독된 이미징 챔버에 넣습니다.

다음으로, 10 mM PBS에 적절한 KD 값으로 희석된 나노센서 10 µL를 멸균된 31 gauge 인슐린 주사기에 채웁니다. 핀셋을 사용하여 모든 기포를 반드시 제거하십시오. 주사하려는 부위에서 마우스 등의 피부를 가볍게 잡아 들어 올립니다.

바늘의 사면(bevel)이 위를 향하게 하고 피부와 평행하게 하여 주사기를 피부에 삽입합니다. 그런 다음 주사기 플런저를 뒤로 당겨 바늘이 혈관에 삽입되지 않았는지 확인합니다. 배압을 최소화하기 위해 바늘을 좌우로 부드럽게 움직여 피부 내에 공간을 만듭니다.

그 다음 센서를 주입하고 주사기를 천천히 제거합니다. 주입 부위를 가볍게 압박하고, 주입 부위에서 흘러나왔을 수 있는 용액을 닦아냅니다. 일반적으로 등 부위를 따라 일정한 간격으로 6회 주입합니다.

다른 마우스에 실험을 수행하는 경우, 질병 전파 및 교차 오염을 최소화하기 위해 바늘을 교체하십시오. 주입 후, 나노센서의 들뜸-방출 스펙트럼(excitation emission spectrum)과 밀접하게 일치하는 필터 세트를 사용하여 명시야 및 형광 이미지를 획득하십시오. 이는 피부의 자가 형광을 최소화하는 효과도 있습니다.

이 신생아 심근세포들은 커버글라스 위에서 배양되었으며 나트륨 나노센서가 주입되었습니다. 이 형광 이미지는 639 nanometer 여기 파장에서 촬영되었습니다. 이것은 동일한 세포의 명시야 이미지이며, 마지막은 두 이미지를 중첩한 것입니다.

일부 센서 응집이 발생하지만, 세포는 정상적인 형태를 유지하고 있습니다. 센서는 세포질 전체로 확산되었으며 핵으로의 유입은 관찰되지 않습니다. 이 명시야 및 형광 이미지 중첩 사진은 누드 마우스의 피하 공간에 나트륨 나노센서를 아홉 번 서로 다르게 피하 주사한 모습을 보여줍니다.

Masten 나노센서 제작은 적절히 수행될 경우 단 몇 분 만에 완료될 수 있으며, 가역적인 실시간 분석물 유속을 측정하는 모든 연구에 적용 가능합니다. 이 영상을 시청한 후에는 생물학적 환경에서 정량적 측정을 위해 세포 내 또는 피하 공간에 나노센서를 로딩하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.