Name: 생식기 장애와 인간에서 확인된 GC 풍부한 KISS1 수용체 유전자 시퀀스에 돌연변이 돌연변이 유발 및 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: 학습하세요 KISS1R의 단백질체 분해 경로와 생식기 장애 관련 돌연변이의 기능적 영향을 분석하는 방법을. 사이트 특이적 돌연변이 유발과 면역침전, 웨스턴 블롯 기법을 활용하여 막 수용체 분해 메커니즘을 규명합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

그리고 찰스 H. 후드 재단 영 인베스티게이터 아동 건강 연구 수상 (보스톤, MA)에 의해 -이 작품은 부분적으로 아동 보건 인간 발달의 국립 연구소 (R21 HD059015 NICHD)의 생식 도서관에 의해 투자되었다.

1. 높은 GC 풍부한 KISS1R 유전자 시퀀스의 사이트 이동 돌연변이 유발 <ol><li> 템플릿 : 자사의 N - 말단에 융합 Myc 태그와 인간 KISS1R의 전체 cDNA 시퀀스. 이 순서는 이후 transfections에 사용되는 포유 동물 세포 라인과 호환되는 pCS2 + 발현 벡터로 복제됩니다. 이 발현 벡터는 pCS2 + Myc KISS1R로 여기라고합니다. </li><li> 뇌관 디자인 : primers이 Quikchange 사이트 감독 돌연변이 유발 키트 (Stratagene)의 지시에 따라, 원하는 돌연변이 들고하도록 설계되었습니다. 요약 : <ul><li> 모두 (순방향 및 역방향) primers 원하는 변이를 포함하여 플라스미드의 반대 가닥에서 동일한 순서로 어닐링해야합니다 (예 : 순방향 및 역방향 primers 서로 보완) <img src="/files/ftp_upload/2897/step1.jpg" alt="1단계" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="1 단계"></li><li> Primers는 하나 이상의 C 또는 G 기지에서 25-45 기지 긴 주말이 될 <img src="/files/ftp_upload/2897/step2.jpg" alt="2단계" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="2 단계"> <img src="files/ftp_upload/2897/step3.jpg" alt="3 단계"></li><li> 도입 돌연변이 (들)은 프라이머의 한가운데에와 양쪽에 올바른 순서 ~ 10-15 기지 둘러싸인해야 </li><li> primers의 용해 온도 (TM)는 같거나 78 ° C.보다 커야한다 TM을 추정하기 위해 다음 수식을 사용하여 <ul><li> 변이를 소개하는 경우 : TM = 81.5 + 0.41 (% GC) - 675 / N - % 불일치 (N은 기지의 뇌관 길이입니다) </li><li> 삽입 또는 삭제를 소개하는 경우 : TM = 81.5 + 0.41 (% GC) - 675 / N (N은 삽입 또는 삭제되는 기지 포함되지 않습니다) </li><li> desalted primers를 (넘어올 purifications 필요)를 사용합니다. <img src="/files/ftp_upload/2897/step4.jpg" alt="4단계" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="4 단계"></li></ul></li></ul></li><li> 최고의 증폭 조건은 PCRx 향상제 용액 (Invitrogen)와 DMSO를 추가할 수 있습니다. 이러한 4퍼센트 8 %로 DMSO의 최소한 2 농도는, 테스트해야합니다. 그리고 pCS2 + MycKISS1R의 대표적인 PCR 증폭 결과 그림 2에 표시됩니다, PCR 조건은 I 및 그림 1에서이 테이블에 표시됩니다. </li><li> 37 1 시간 30 분 대한 DpnI과 methylated DNA의 소화에 의해 증폭 제품에 대한 부모의 DNA를 제거 ° C : 10X NEBuffer의 2μl 4 DpnI의 0.5μl (10U, 뉴 잉글랜드 Biolabs)로 PCR 제품의 원심 분리기 튜브 17.5μl에 섞는다. </li><li> XL10 - 골드 Ultracompetent E.의 45μl와 DpnI - 치료 DNA의 믹스 2μl : 변환 PCR 제품을 DpnI - 대우 사전 냉장 15 ML의 세포 배양 튜브에 대장균 (Stratagene). β - 메르 캅 토 에탄올의 2μl을 추가하고 Stratagene 지침을 따르십시오. 플레이트 37 100μg/ml 암피실린 및 부화를 포함한 LB - 한천 플레이트의 변형 박테리아 100 - 400μl ° C. </li><li> Miniprep 2-4 각 식민지는 플라스미드 DNA를 분리합니다. 절연 DNA의 시퀀싱과 분석에 의해 원하는 돌연변이의 성공적인 도입을 확인합니다. </li></ol> 2. HEK - 293 세포에 transfection MycKISS1R의 과도 <ol><li> 다음 실험은 37 CO 2 배양기 (5 % CO 2)에서 교양 인간의 배아 신장 세포 (HEK - 293)에서 수행되는 ° DMEM에서 C 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보완. </li><li> 시드 HEK - 293 6 - 잘 접시에 2.5x10 5 셀 / ML에서 세포들을 37 밤새기를 ° transfection 전에 C. 참고 : (I) 각 실험 조건에 대한 세중의의 우물을 사용하고, (ii) transfection 시에 이상적인 셀 합류 30 % -50 %입니다. </li><li> Transfect HEK - 293 제조 업체의 지침에 따라 GenePorter의 Transfection 시약 (Genlantis)를 사용하여 셀과 함께 혈청없는 DMEM의 혼합 절반 0.5μg pCS2 + MycKISS1R 플러스 0.5μg 제어 (빈) DNA / 음의 1μg 정리하다 벡터. transfected DNA의 μg 당 10μl transfection 시약과 나머지 절반을 섞는다. 참고 : 이상적인 플라스미드 DNA 농도는 다를 수 있습니다. </li></ol> 3. 세포 치료 및 용해 <ol><li> transfection 후 24 시간, 1ml DMEM 2.5 % FBS를 (세포 신진 대사를 감소)이있는 세포와 매체를 교체하십시오. 참고 : 혈청에있는이 감소는 촉진 및 / 또는 결과의 검색을 증폭 수도 있습니다. </li><li> 직접 한 전체 6 - 잘 플레이트의 각 우물에 lysosome 억제제 (100μg / 잘 류펩틴의) 추가합니다. ° C 6 H 16 (또는 다른 원하는 시간) 37에 품어 </li><li> 바로이 전체 6 - 잘 접시의 우물에 신선한 proteasome 억제제 (10μM / 물론 MG132의) 추가합니다. ° C 2, 4, 6 또는 16h (또는 원하는 시간)에 37 알을 품다. 네 번째 6 자 플레이트 (0 시간 시점)의 우물에 차량을 추가하고 37 품어 ° 16h에 대한 C </li><li> 배양이 끝난 때, 얼음 접시를 이동하고 단백질 저하를 방지하기 위해 얼음이 전체 용해 절차를 수행 : <ul><li> 단백질 수율을 증가하기 위해, 단일 centr 6 - 잘 접시에 triplicates을 결합ifuge 튜브 </li><li> 얼음처럼 차가운 인산의 1ml로 한 중간 및 세척 세포를 대기음 호수 (PBS)는 버퍼 </li><li> 단백 분해 효소 억제제 (100mM AEBSF - HCL, 80μM aprotinin, 5mM bestatin을 포함 1X 칵테일을 포함하는 얼음처럼 차가운 용해 버퍼의 100μl를 (20mM HEPES, pH를 7.4, 1 % NP - 40, 150mM NaCl, 1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.25 %의 나트륨 deoxycholate) 추가 각 잘하는 1.5mM E - 64, 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 2mM 류펩틴 및 1mM pepstatin, 플러스 2mM PMSF) </li><li> 휴대 스크레이퍼 및 전송 세포와 세포가 제거 튜브를 원심 분리기에 lysates </li><li> 20 게이지 바늘을 통해 세포에게 ~ 10 번 패스. 참고 : 막 단백질 서양 얼룩 검출을위한 샘플을 sonicate하지 마십시오. Sonication는 전기 영동하는 동안 제대로 마이 그 레이션되지 않습니다 막 단백질의 집합에 연결 </li><li> 락을 플랫폼 4 ° C에서 1 시간에 대한 세포 lysates을 품어 </li><li> 4 원심 분리기 세포 lysates ° 10,000 X의 RPM과 새로운 튜브로 전송 supernatants 10 분 C. 참고 :이 단계에서 알약을 방해하지 마십시오 </li><li> BCA 방법을 사용 supernatants의 10μl의 단백질 농도 (피어스)을 결정 </li><li> 단백 분해 효소 억제제를 포함하는 용해 버퍼 1mg/ml에 lysates을 희석. </li></ul></li></ol> 4. Immunoprecipitation 및 MycKISS1R 서양 얼룩 검출 <ol><li> 얼음에서 다음 immunoprecipitation 단계 (또는 4 ° C)를 수행 : <ul><li> 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 아가로 오스 - 복합 백신 myc 항체 (2.5μg / 샘플)의 적절한 금액을 씻고 lysate의 단백질 400μg 이것을 추가합니다. </li><li> lysates에 MycKISS1R을 Immunoprecipitate 4 박 ° 부드러운 교반과 락을 플랫폼에서 C. </li><li> 4 펄스 원심 분리에 의해 아가로 오스 비즈를 스핀 ° C (최대 10,000 X RPM) </li><li> supernatants를 (알약을 방해하지 않고) 대기음 및 폐기 </li><li> 얼음처럼 차가운 용해 버퍼와 두 번 얼음처럼 차가운 PBS로 한번 구슬 씻으십시오. 회전하기 전에 부드럽게 튜브를 반전 </li><li> 10% β - 메르 캅 토 에탄올을 포함하는 2X 샘플 로딩 버퍼 항체 - 바운드 MycKISS1R을 포함 Ressuspend 비즈. </li></ul></li><li> MycKISS1R의 immunocomplexes 서양 얼룩 : <ul><li> 37 30 분 ° C. 참고를위한 열 샘플 : 멤브레인 단백질 서양 얼룩 검출을위한 샘플을 끓여하지 마십시오. sonication 마찬가지로, 끓는 또한 이러한 단백질의 집합에 연결 </li><li> 5 분 얼음으로 즉시 튜브로 이동 </li><li> 4-15% 기울기 젤의 SDS - PAGE에 의해 분리 단백질. </li><li> 바이오 - 래드 세미 드라이 전송을 사용하여 전송 버퍼에서 30 분 (48mM 트리스베이스, 39mM 글리신, 1.2mM SDS, 20 % 메탄올, 산도 9.2)에 대한 25V에서 Immobilon - FL PVDF 막 (적외선 감지)로 전송 기구 </li><li> 로 상온에서 5 분 세포막을 씻으 트리스 버퍼 살린 (TBS)과 락을 플랫폼 (또는 TBS에 5 %의 우유가 아닌 특정 바인딩을 차단하는 데 사용할 수있는)에 차단 Licor 오딧세이와 함께 실온에서 1 시간을위한 블록. </li><li> 4 밤새 품어 세포막 ° 0.1 % 트윈 - 20을 포함 차단 솔루션 토끼 안티 - myc 항체 (1:500)와 C </li><li> 기본 항체를 제거하고 각 TBS와 0.1 % 트윈 - 20 (TBST)를 포함하는 5 분 중 세포막에게 3 회 씻어 </li><li> 0.1 % 트윈 - 20 0.01 % SDS를 포함하는 버퍼를 차단에서 염소 인프라 RedDye ® 800CW - 레이블 안티 토끼 IgG (1:10,000)와 실온에서 1 시간을위한 세포막을 품어 </li><li> 이차 항체를 제거합니다 (트윈 - 20 남은 제거) 만 TBS와 TBST 그리고 마지막으로 각 5 분의 세포막에게 3 회 씻어 </li></ul></li><li> 이미징 및 LI - COR 오딧세이 적외선 이미지 전송을 사용하여 MycKISS1R의 부량 : <ul><li> 안정에 MycKISS1R은 LI - COR 오딧세이 적외선 이미지 전송을 사용하여 몇 군데 것입니다. 시작하려면, 격자로 정렬, 오딧세이 스캐너의 왼쪽 하단 모서리에있는 멤브레인를 놓으십시오. 고무 매트와 커버, 롤러와 거품을 부드럽고 뚜껑을 닫습니다 </li><li> 컴퓨터에 새 프로젝트 파일을 만듭니다. 파일 이름을 "완료"를 클릭, 다음 "검색"에 스캐너 로그인을 입력합니다. 크기 스캐너 콘솔 사용자 막에 맞게 상자에 다음은 169μm 해상도와 중간 이미지 품질을 선택 </li><li> 각 신호의 강도에 따라 예상되는 700 (적색) 800 (녹색) 채널에 대한 강도 설정을 선택하십시오. 이것은 신호 시각화 목적으로하고 부량 영향을받지 않습니다. "검사 시작"을 클릭하십시오 </li><li> 스캔의 이름을 지정하고 저장 후, 부량위한 새로운 창을 열어 "확인"을 클릭합니다. MycKISS1R의 단량체는 약 43kD에 표시해야 </li><li> '상자'도구 (왼쪽 사이드바에서)를 사용하여 첫 번째 밴드 주위에 상자를 그립니다. 모든 밴드를 통해 "복사"와 "붙여넣기"상자에 다음 모든 밴드에 적합하도록 주변의 상자를 드래그 </li><li> 사용하여 모든 확인란을 선택하고 'Ctrl + A는 "그리고 중간 배경을 빼야하는 옵션을 선택합니다. 상단 메뉴에서 "보고서"및 부량 가치와 스프레드 시트가 나타납니다를 클릭합니다. 여기에 표시된 대표 결과가 represe 아르(시간 제로) 치료 세포를 통해 접이식 증가로 nted </li></ul></li></ol> 5. 대표 결과 : <ol><li> 높은 GC 풍부한 KISS1R 유전자 시퀀스의 사이트 감독 돌연변이 유발 : 표 1. KISS1R 증폭의 효율을 개선하기 위해 시약의 조합을 보여줍니다. 이 조합은 성공적으로 여러 KISS1R cDNA 시퀀스의 고유 영역에 대한 감독 돌연변이뿐만 아니라이 높은 GC 풍부한 유전자의 증폭에 대한 소개를하는 데 사용되고있다. 그림 1은 KISS1R의 돌연변이 유발을위한 사이클링 및 증폭 조건을 보여줍니다. 이러한 조건은 QuikChange 사이트 감독 돌연변이 유발 키트 (Stratagene)에서 수정되었습니다. 그림 2.이 최적화된 프로토콜을 사용하여 대표적인 결과를 보여줍니다. PCRx 확장기와 함께 4% 또는 8% DMSO의 또한 GC 풍부한 KISS1R cDNA 함유 플라스미드의 증폭의 수율을 크게 향상시킵니다. 이 대표 실험에서는 4 % DMSO는 8 % DMSO에 비해 약간 더 증폭 조건을 제공했습니다. ultracompetent E. 함께 DpnI - 대우 증폭 제품의 변형 대장균은 일반적으로 1000 식민지로 100을 산출하고, DNA 시퀀싱에 의해 결정 원하는대로 돌연변이의 성공적인 도입 율은 80-90%입니다. </li><li> 수용체의 생리를 공부 MycKISS1R 구조의 사용 : 이 대표 실험에서, 야생의 유형 pCS2 + MycKISS1R은 최적화된 프로토콜을 여기에 설명된 transiently MycKISS1R을 표현 관련 세포주에서 생체내 KISS1 수용체 저하 (HEK - 293)에서 공부하는 데 사용됩니다에 따라 증폭. 방법에서 설명하는 프로토콜에 따라 lysosome (류펩틴) 또는 proteasome (MG132) 억제제와 transfected HEK - 293 세포를 치료 후 세포가 lysed하고 서부 얼룩에 대한 처리. 하단 패널 상단 패널에 표시된 밴드의 부량를 보여줍니다 반면에 그림 3의 상단 패널 MycKISS1R의 단량체의 스캔을 보여줍니다. 밴드의 부량는 류펩틴 치료 6h이나 16h도가 MycKISS1R 단백질 수준에 영향을 나타냅니다. 반대로, MG132 MG132과 함께 치료와 부화 16h 후 수용체의 45 배 축적과 culminates 이러한 세포 MycKISS1R 단백질의 시간 의존 증가 결과. 이러한 관찰은 대부분의 G 단백질 결합 수용체 달리 KISS1R는 proteasome (오히려 lysosome 이상)에 의해 타락, 그 나타냅니다. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td> DMSO </td><td></td></tr><tr><td> 시약 </td><td> 0 </td><td> 4퍼센트 </td><td> 8퍼센트 </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 35 </td><td> 33 </td><td> 31 </td></tr><tr><td> 10X Pfu DNA 형성 촉매 울트라 버퍼 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> dNTP 혼합 (10mM) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 프리머 감각 (25pmol/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 프리머 안티 센스 (25pmol/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 10X PCRx 향상제 솔루션 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Pfu 울트라 DNA 형성 촉매 효소 (2.5U/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 플라스미드 DNA (20ng/μl) </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> 표 1. 성공적으로 GC 풍부한 KISS1R을 변형되기하고 증폭하는 데 사용되는 시약의 조합 <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. GC 풍부한 KISS1R의 성공적인 돌연변이 유발과 증폭의 사이클 조건 : 2min 뜨거운 시작은 95 30 초 용해의 18주기에 의해 미행했는데 ° C, 55 ° C에서 68과 6 분 연장에서 어닐링 1 분 ° C. 68시 10 분 추가 확장 ° C는 마지막주기의 끝에 추가되었습니다. 이러한 설정은 QuikChange II XL - 사이트 - 감독 돌연변이 유발 키트 (Stratagene)의 원래 돌연변이 유발 프로토콜에서 조정되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. GC 풍부한 pCS2 DMSO의 존재 또는 부재의 증폭 + Myc KISS1R의 시각화 : 0의 존재에서 증폭 pCS2의 다섯 μl aliquots + Myc의 KISS1R는 4 8% DMSO는 ethidium 물들일이 대표 1퍼센트 아가로 오스 겔에로드되었습니다 브로마이드와 시각을 사용 UV 라이트. 6Kb의 플라스미드 밴드는 PCR 4 %의 존재에서 증폭 제품과 8 % DMSO와 함께 로드된 두 차선을 볼 수 있습니다,하지만 첫 번째 차선에, 어떤은 PCR이 장전되어 있었어제품은 DMSO의 부재에서 증폭. <img src="/files/ftp_upload/2897/2897fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. HEK - 293 세포에서 Myc KISS1R 단백질의 수준에 류펩틴 또는 MG132의 효과 : Myc KISS1R을 표현 HEK - 293 세포는 37 100μg/ml 류펩틴 또는 10μM MG132 대우했다 ° 지정된 번 C. 세포 lysate의 400μg에 Myc KISS1R는 아가로 오스 - 복합 방지 myc 항체의 2.5μg과 immunoprecipitated과 서양 얼룩에 의해 분석되었다. (B) Myc KISS1R 밴드의 부량는 표시 (A)를 사용하여, IRDye가 800CW - 표시 방지 토끼로 부화 다음 토끼 방지 Myc 태그 항체와 immunoblots의 부화 후 Myc KISS1R의 (A) LI - COR 오딧세이 검출 LI - COR의 오딧세이 부량 소프트웨어. 치료 세포 (시간 0)를 통해 접이식 증가와 같은 결과가 표시됩니다.

<ol><li>Seminara, S. B., Messager, S., Chatzidaki, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GPR54+Gene+as+a+Regulator+of+Puberty%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">The GPR54 Gene as a Regulator of Puberty.</a> N Engl J Med. 349, 1614-1627 (2003).</li>
<li>de Roux, N., Genin, E., Carel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypogonadotropic+Hypogonadism+Due+to+Loss+of+Function+of+the+KiSS1-Derived+Peptide+Receptor+GPR54%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypogonadotropic Hypogonadism Due to Loss of Function of the KiSS1-Derived Peptide Receptor GPR54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 10972-10976 (2003).</li>
<li>Messager, S., Chatzidaki, E. E., Ma, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kisspeptin+Directly+Stimulates+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Release+via+G+Protein-Coupled+Receptor+54%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Kisspeptin Directly Stimulates Gonadotropin-Releasing Hormone Release via G Protein-Coupled Receptor 54.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1761-1766 (2005).</li>
<li>Teles, M. G., Bianco, S. D., Brito, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GPR54-Activating+Mutation+in+a+Patient+with+Central+Precocious+Puberty%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">A GPR54-Activating Mutation in a Patient with Central Precocious Puberty.</a> N Engl J Med. 358, 709-715 (2008).</li>
<li>Tenenbaum-Rakover, Y., Commenges-Ducos, M., Iovane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroendocrine+Phenotype+Analysis+in+Five+Patients+with+Isolated+Hypogonadotropic+Hypogonadism+due+to+a+L102P+Inactivating+Mutation+of+GPR54%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuroendocrine Phenotype Analysis in Five Patients with Isolated Hypogonadotropic Hypogonadism due to a L102P Inactivating Mutation of GPR54.</a> J Clin Endocrinol Metab. 92, 1137-1144 (2007).</li>
<li>Semple, R. K., Achermann, J. C., Ellery, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Novel+Missense+Mutations+in+G+Protein-Coupled+Receptor+54+in+a+Patient+with+Hypogonadotropic+Hypogonadism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Two Novel Missense Mutations in G Protein-Coupled Receptor 54 in a Patient with Hypogonadotropic Hypogonadism.</a> J Clin Endocrinol Metab. 90, 1849-1855 (2005).</li>
<li>Wacker, J. L., Feller, D. B., Tang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-Causing+Mutation+in+GPR54+Reveals+the+Importance+of+the+Second+Intracellular+Loop+for+Class+A+G-Protein-Coupled+Receptor+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Disease-Causing Mutation in GPR54 Reveals the Importance of the Second Intracellular Loop for Class A G-Protein-Coupled Receptor Function.</a> J Biol Chem. 283, 31068-31078 (2008).</li>
<li>Szereszewski, J. M., Pampillo, M., Ahow, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR54+regulates+ERK1%2F2+activity+and+hypothalamic+gene+expression+in+a+Galpha%28q%2F11%29+and+beta-arrestin-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">GPR54 regulates ERK1/2 activity and hypothalamic gene expression in a Galpha(q/11) and beta-arrestin-dependent manner.</a> PLoS One. 5, e12964-e12964 (2010).</li>
<li>Bianco, S. D. C., Vandepas, L., Correa-Medina, M., Gereben, B., Mukherjee, A., Kuohung, W., Carroll, R., Teles, M. G., Latronico, A. C., Kaiser, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KISS1R+Intracellular+Trafficking+and+Degradation%3A+Effect+of+the+Arg386Pro+Disease-Associated+Mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">KISS1R Intracellular Trafficking and Degradation: Effect of the Arg386Pro Disease-Associated Mutation.</a> Endocrinology. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Hutchison, C. A., Phillips, S., Edgell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+at+a+Specific+Position+in+a+DNA+Sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis at a Specific Position in a DNA Sequence.</a> J Biol Chem. 253, 6551-6560 (1978).</li>
<li>Mullis, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Unusual+Origin+of+the+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Am%22%5BJournal%5D)">The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction.</a> Sci Am. 262, 56-61 (1990).</li>
<li>Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaine+improves+the+PCR+amplification+of+GC-rich+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3957-3958 (1997).</li>
<li>Sahdev, S., Saini, S., Tiwari, P., Saxena, S., Singh Saini, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+GC-rich+genes+by+following+a+combination+strategy+of+primer+design%2C+enhancers+and+modified+PCR+cycle+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Probes%22%5BJournal%5D)">Amplification of GC-rich genes by following a combination strategy of primer design, enhancers and modified PCR cycle conditions.</a> Mol Cell Probes. 21, 303-307 (2007).</li>
<li>Kong, K. C. Chapter 10. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKong%2C+KC+%22MSTA.+in+G+Protein-Coupled+Receptors%3A+Essential+Methods%22">MSTA. in G Protein-Coupled Receptors: Essential Methods</a>. Poyner, D. R., Wheatly, M. , Wiley-Blackwell. 197-204 (2010).</li>
<li>Hall, R. A. Chapter 9. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHall%2C+RA+%22G+protein-Coupled+Receptor-Protein+Interactions%22">G protein-Coupled Receptor-Protein Interactions</a>. George, S. R., O'Dowd, B. F. , John Wiley & Sons, Inc. 170-171 (2005).</li>
<li>Chaturvedi, K., Bandari, P., Chinen, N., Howells, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+Involvement+in+Agonist-Induced+Down-Regulation+of+Mu+and+Delta+Opioid+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteasome Involvement in Agonist-Induced Down-Regulation of Mu and Delta Opioid Receptors.</a> J Biol Chem. 276, 12345-12355 (2001).</li>
<li>Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Receptor+Fate+by+Ubiquitination+of+Activated+Beta+2-Adrenergic+Receptor+and+Beta-Arrestin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of Receptor Fate by Ubiquitination of Activated Beta 2-Adrenergic Receptor and Beta-Arrestin.</a> Science. 294, 1307-1313 (2001).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

사이트 이동 돌연변이 유발이 세 수십 년 동안 타겟 유전자의 코딩 순서 염기 변화를 도입하여 단백질 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 원래 기술은 영국 - 캐나다 케미과 노벨상 수상자 마이클 스미스 10 1978 설명했다. 마이클 스미스는 카리 뮬리스, 중합 효소의 연쇄 반응 (PCR) 11를 발명한 미국의 생화학과 화학의 1993 노벨상을 공유했습니다. 마이클 스미스가 설명한 원래 메소드는 지난 몇 년 동안 개선되었습니다. 한 PCR 반응에서 원하는 유전자 서열에 돌연변이, 삽입 또는 삭제를 소개하는 능력은 높은 정확성과 성공 요금이 절차의뿐만 아니라 시간의 비교적 짧은 기간에 돌연변이의 생산에 기여하고 있습니다. 같은 KISS1R 같은 높은 GC 풍부한 유전자 시퀀스의 모든 기술 향상, 변이 및 증폭에도 불구하고 특히 골칫거리입니다. 높은 GC 함량 시퀀스의 돌연변이 유발을위한 primers의 크기는 용융 온도가 권...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 10X PCRx 향상제 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 52,391 </td></tr><tr><td> PfuUltra 높은 충실도의 DNA 중합 효소의 대체 세제 </td><td> Stratagene </td><td> 600385 </td></tr><tr><td> Dpn - I </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> R0176 </td></tr><tr><td> XL10 - 골드 Ultracompetent E. 대장균 세포 </td><td> Stratagene </td><td> 200314 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013 - CV </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> 애틀랜타 체액 </td><td> S11550 </td></tr><tr><td> Geneporter의 Transfection 시약 </td><td> Genlantis </td><td> T201007 </td></tr><tr><td> 류펩틴 </td><td> Calbiochem </td><td> 108975 </td></tr><tr><td> MG132 </td><td> Calbiochem </td><td> 47,491 </td></tr><tr><td> 10xPBS </td><td> 앰비온 </td><td> AM9625 </td></tr><tr><td> 단백 분해 효소 저해제 칵테일과 PMSF </td><td> 산타크루즈 생명 공학 </td><td> SC - 24948 </td></tr><tr><td> 피어스 BCA 단백질 분석 키트 </td><td> 써모 과학 </td><td> 23,225 </td></tr><tr><td> 안티 Myc 태그 (클론 4A6) 아가로 오스 공액 </td><td> Millipore </td><td> 16-219 </td></tr><tr><td> 2X 로딩 버퍼 </td><td> BioRad </td><td> 161-0737 </td></tr><tr><td> 기준 트리스 - HCL 프리 캐스트 젤, 4-15% 기울기 </td><td> BioRad </td><td> 345-0028 </td></tr><tr><td> Immobilon - FL PVDF 막 </td><td> Millipore </td><td> IPFL00010 </td></tr><tr><td> 오딧세이 차단 버퍼 </td><td> LI - COR Biosciences </td><td> 927-40000 </td></tr><tr><td> 10xTBS </td><td> BioRad </td><td> 170-6435 </td></tr><tr><td> 토끼 안티 - myc 항체 </td><td> 세포 신호 </td><td> 2272 </td></tr><tr><td> 염소 항 토끼 IRDye 800CW </td><td> LI - COR Biosciences </td><td> 926-32211 </td></tr><tr><td> 오딧세이 이미징 적외선 시스템 </td><td> LI - COR Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> 할트 프로 테아제 억제제 칵테일 (100x) </td><td> 써모 과학 </td><td> 78,430 </td></tr></tbody></table>

생식기 장애와 인간에서 확인된 gc 풍부한 kiss1 수용체 유전자 시퀀스에 돌연변이 돌연변이 유발 및 분석

Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

kisspeptin 수용체 (KISS1R)는 사춘기의 트리거와 성인 1,2,3의 생식 능력의 레귤레이터로 인식 G 단백질 결합 수용체이다. 환자에서 확인된 KISS1R의 운영을 중지시키지 변이는 iodiopathic hypogonadotropic hypogonadism (IHH) 1,2와 조숙한 사춘기 4 연결되어있다. 이러한 돌연변이의 기능 연구는이 수용체에 의해 복제의 규제뿐만 아니라를 기본 메커니즘에 대한 우리의 이해에 대한 중요한 질병 결과를 형성 사람, 비정상적인 KISS1R 신호와 함수에서 어떤 결과를. 그러나, KISS1R 유전자의 높은 GC 풍부한 시퀀스는 다소 어려운 변이를 소개하거나 PCR하여이 수용체를 인코딩 유전자를 증폭 수 있습니다. 여기 우리 연구실에서 십여 KISS1R의 돌연변이를 통해 생성 성공적으로 사용되고 있습니다이 높은 GC 풍부한 순서에 관심이 변이를 도입하는 방법을 설명합니다. 우리는 대체, 삭제 또는 KISS1R 시퀀스의 삽입을 포함 KISS1R의 돌연변이의 범위의 증폭을 촉진하기 위하여 PCR 조건을 최적화합니다. PCR 향상제 솔루션 또한뿐만 DMSO의 작은 비율로 증폭을 개선하기 위해 특히 도움이되었습니다. 이 최적화된 절차뿐만 아니라 다른 GC 풍부한 템플릿을 유용할 수 있습니다. KISS1R 인코딩 발현 벡터는 변이가 KISS1R 기능을 변경하고 관련된 생식 phenotypes가 발생할 수 있습니다 방법을 이해하기 위해서는이 수용체의 신호와 기능을 특성화하는 데 사용되고있다. 따라서, 사이트 감독 돌연변이 유발에 의해 생성된 KISS1R의 돌연변이의 가능성이 응용 프로그램은 많은 연구에 의해 그림 1,4,5,6,7,8 수 있습니다. 예를 들어, 조숙한 사춘기와 관련된 KISS1R (Arg386Pro),에있는 이득의 기능 변이는 KISS1R 9 저하의 속도를 변경하는 리간드 자극 사뿐만 아니라 수용체의 반응을 연장하기 위해 표시되었습니다 . 흥미롭게도, 우리의 연구는 대부분의 G 단백질 결합 수용체 9 설명한 고전 lysosomal 저하에 반대하는, KISS1R은 proteasome에 의해 저하되고있는 것으로 나타났습니다. 여기에 제시된 예제에서 KISS1R의 저하는 transiently Myc - 태그 KISS1R (MycKISS1R)를 표현하는 인간의 배아 신장 세포 (HEK - 293)에서 조사하고 proteasome 억제제 또는 lysosome과 치료. 세포 lysates은 서양 얼룩 분석 뒤에 아가로 오스 - 복합 백신 myc 항체를 사용하여 immunoprecipitated 있습니다. blots에 대한 감지 및 MycKISS1R의 부량는 LI - COR 오딧세이 적외선 시스템을 사용하여 수행됩니다. 이러한 접근 방식뿐만 아니라 관심의 다른 단백질의 저하의 연구에 유용하게 사용될 수 있습니다.

kisspeptin 수용체 (KISS1R)에 돌연변이가 환자의 생식 장애와 관련된 있습니다. 여기 immunoprecipitation과 서양 얼룩에 의한 수용체의 저하 경로를 특성화 KISS1R의 GC 풍부한 순서뿐만 아니라 KISS1R 구조의 사용으로 관심 변이를 소개하는 방법을 설명합니다

생식기 장애와 인간에서 확인된 GC 풍부한 KISS1 수용체 유전자 시퀀스에 돌연변이 돌연변이 유발 및 분석

키스펩틴 수용체(KISS1R)는 사춘기의 촉발제로 알려져 있으며, ...에서 생식 능력의 조절자로 인식되는 G 단백질 결합 수용체입니다.

본 절차의 전반적인 목적은 KISS one 수용체의 분해 경로를 조사하고, 인간 질환과 관련된 유전적 변이가 수용체 기능에 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 첫 번째 단계는 부위 특이적 돌연변이 유발(site directed mutagenesis)을 통해 MT 태그가 붙은 kiss one 수용체에 원하는 돌연변이를 도입한 후, 이를 E. coli에 형질전환시키고 시퀀싱을 통해 원하는 돌연변이가 도입되었는지 확인하는 것입니다. 다음 단계는 Micks one 수용체를 인간 배아 신장 세포에 형질전환하여 리소좀 및 프로테아좀 억제제를 사용하여 KISS one 수용체의 분해를 연구하는 것입니다.그 후, HRP가 결합된 anti-MIC-Ttag 항체를 사용하여 처리된 세포로부터 KISS1 수용체를 면역침전시킵니다. 이 절차의 마지막 단계는 웨스턴 블롯 분석을 통해 면역침전된 KISS1 수용체를 정량화하는 것입니다. 최종적으로, 수용체의 분해 경로를 밝히는 결과를 얻을 수 있습니다.또는, 수용체 거동에 미치는 유전적 변이의 영향을 확인할 수도 있습니다. 오늘 선보이는 기술들은 수용체 기능이 어떻게 조절되는지, 그리고 이러한 수용체의 유전적 변이가 결과적으로 인간의 관련 질병 표현형으로 어떻게 이어지는지와 같이, G-단백질 결합 수용체 연구의 핵심 질문들에 답하는 데 과학자들에게 도움을 줄 수 있습니다. 기존 방법과 비교했을 때 이 용해 및 웨스턴 블롯 기술의 주요 장점은 막 단백질의 무결성을 보존하고 검출 능력을 극대화하도록 최적화되었다는 점입니다.이 기술의 함의는 단백질 결합 수용체의 유전적 돌연변이와 관련된 인간 질병의 치료로 확장될 수 있는데, 이는 질병 표현형의 근저에 있는 메커니즘을 식별하고 특성화할 수 있기 때문입니다. S one R 유전자의 부위 특이적 돌연변이 유발을 위한 템플릿은 N 말단에 MT 태그가 융합된 인간 KISS one R의 전체 CDNA 서열이며, 이는 PCs two plus 발현 벡터에 클로닝됩니다. 프라이머는 원하는 돌연변이를 운반하도록 설계됩니다.이 지침에 따라, 정방향 및 역방향 프라이머 모두 원하는 돌연변이를 포함해야 하며 플라스미드의 반대편 가닥에 있는 동일한 서열에 어닐링되어야 합니다. 프라이머의 길이는 25에서 45 base여야 하며, 하나 이상의 C 또는 G base가 도입된 상태로 끝나야 합니다.돌연변이는 프라이머의 중앙에 위치해야 하며, 양측으로 약 10~15 base의 정

mutagenesis-analysis-genetic-mutations-gc-rich-kiss1-receptor

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 이온 채널의 기능에 대한 단일 지점에서 돌연변이의 효과를 연구하는 방법을 보여줍니다 것입니다.

이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

우리는 RNAi를 사용하여 세포의 내생 BRCA1 단백질을 파괴하고 코딩 변경을 포함하는 BRCA1 포인트 돌연변로 대체하여 DNA 손상의 동종 재조합의 수리를 위해 조직 문화를 기반으로 분석에서 BRCA1 변종을 테스트하기위한 방법을 제공합니다.

내생 와일드 타입 BRCA1을 표현 세포를 사용하는 동종 재조합에 BRCA1 변이의 효과를 확인

여기서 우리는 LACI 유전자 변형 마우스 모델을 사용하여 정제 조혈 세포의 작은 숫자에 대한 생체 내 돌연변이 분석에 대해 설명합니다. LACI 유전자는 DNA의 돌연변이의 빈도, 위치 및 유형 자발적으로 일어 나 genotoxins에 노출 된 후를 결정하기 위해 분리 할 수있다.

정제 된 조혈 줄기 / 전구 세포에 DNA 돌연변이를 확인

남성 생식계열의 새로운 돌연변이는 다음 세대에서 건강에 해로운 결과에 기여할 수 있습니다. 여기에서는 환경 인자에 의해 유도된 수컷 생식 세포의 돌연변이를 정량화하기 위한 형질전환 설치류 모델의 사용 프로토콜에 대해 설명합니다.

형질 전환 쥐 분석 정량화 남성 생식 세포 돌연변이 주파수에 대한

이진 유전 전략을 활용하여 Cre 매개 재조합 후 상보적 시냅스 경진 추적자를 발현하는 마우스의 신경 회로 추적을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 세포 특이적 추적자 생산은 유전적으로 암호화되기 때문에 당사의 실험적 접근 방식은 단일 세포 해상도에서 쥐 배아 뇌 발달 중 신경 회로의 형성 및 성숙을 연구하는 데 적합합니다.

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

이 프로토콜 편집 시스템 복구에 대 한 포유류 세포에 있는 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9 기반 유전자의 워크플로 설명 합니다. 여기, 우리 유전자 편집 대상 사이트에서 indel 형성을 측정 하기 위한 상세한 후속 실험 전략으로 조합 방식을 사용-본질적으로, 현장 mutagenesis 분석.

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

BRCA1 돌연변이를 가진 사람들은 BRCA1 변이체의 기능의 정확한 평가를 보증하는 암 발전의 고위험이 있습니다. 본명, 우리는 살아있는 세포에서 표적 C:G ~T:A 변환을 가능하게 하는 CRISPR 매개 사이토신 베이스 편집기를 사용하여 BRCA1 변이체의 기능적 평가를 위한 프로토콜을 기술했습니다.

CRISPR 중재 베이스 편집기사용 BRCA1 변종 기능 평가

여기서 우리는 면역 능력 마우스의 피부와 구강에 있는 몇몇 유전자의 기능을 동시에 평가하기 위하여 자궁 배아 렌즈바이러스 주사에서 초음파 유도를 사용하여 생체 내 CRISPR/Cas9 검열 방법론을 기술합니다.

마우스 피부와 구강의 유전자 기능을 동시에 평가하기 위한 Vivo CRISPR/Cas9 스크리닝

여기에 제시된 것은 CD4 프로모터 근처의 이중 가닥 파단 복구와 관련된 돌연변이를 확인하는 데 사용할 수있는 sgRNA/CAS9 엔도뉴클레아제 및 차세대 시퀀싱 프로토콜입니다.

차세대 시퀀싱을 사용하여 CD4 프로모터 근처의 CAS9 유도 이중 가닥 파단의 복구와 관련된 돌연변이 확인

본 프로토콜은 Gja1에서 전장 Connexin43 생성을 유지하지만 더 작은 GJA1-20k 내부 번역 이소형의 번역을 방지하는 단일 M213L 돌연변이를 기술한다.

전장 단백질의 발현을 유지하면서 mRNA로부터 내부 번역 개시 부위의 제거

이 프로토콜은 단일 실험 내에서 35kb만큼 큰 고유한 miRNA 클러스터 부재 결실 조합을 운반하는 유전자 변형 세포주 패널의 신속한 생성을 가능하게 하는 마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 고처리량 클러스터 규칙적인 간격 간 짧은 팰린드로믹 반복(CRISPR) 유전자 편집 워크플로우를 기술합니다.

마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 CRISPR 유전자 편집 도구

학습하세요 KISS1R의 단백질체 분해 경로와 생식기 장애 관련 돌연변이의 기능적 영향을 분석하는 방법을. 사이트 특이적 돌연변이 유발과 면역침전, 웨스턴 블롯 기법을 활용하여 막 수용체 분해 메커니즘을 규명합니다.

생식기 장애와 인간에서 확인된 GC 풍부한 KISS1 수용체 유전자 시퀀스에 돌연변이 돌연변이 유발 및 분석

더 많은 동영상 탐색