활성 세포 배양을위한 형상 기억 폴리머

이 절차의 전반적인 목표는 시간이 지남에 따라 변하는 지형을 가진 기질에서 세포를 배양하는 것입니다. 이는 먼저 형상 기억 폴리머를 기억할 수 있는 영구적인 형태로 프로그래밍하여 수행됩니다. 그런 다음 형상 기억 폴리머는 세포가 나중에 도금되는 임시 모양으로 프로그래밍됩니다.

절차의 마지막 단계는 온도를 높여 형상 기억 폴리머가 영구적인 형태로 돌아가도록 하는 것이며, 궁극적으로 형광 현미경 검사를 통해 세포 거동의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 제 이름은 팻 매더입니다. 저는 시라큐스 대학의 생물의학 및 화학 공학 교수이자 시러큐스 생체 재료 연구소(Syracuse Biomaterials Institute)의 소장입니다.

세포를 늘리기 위한 상용 또는 맞춤형 장치에 비해 이 기술의 주요 장점은 단일 고분자 시스템에서 세포에 다양한 복합 균주를 적용할 수 있다는 것입니다. 제 이름은 제이 헨더슨입니다. 저는 생물의학 및 화학공학과 조교수이자 시러큐스 바이오머티리얼 연구소(Syracuse Biomaterials Institute)의 회원입니다.

이 방법은 세포가 물리적 환경의 동적 변화에 어떻게 반응하는지와 같은 기계생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 제 이름은 Kevin Davis이고 Syracuse University의 생물 의학 공학 및 화학 공학과 박사 과정 학생입니다. 이 방법은 2D 기계 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 조직 공학을 위한 3D 형상 변경 스캐폴드와 같은 다른 시스템에도 사용할 수 있습니다.

이 절차를 시작하기 전에 유리 슬라이드, 1mm 두께의 테프론 스페이서 및 알루미늄 플레이트를 사용하여 맞춤형 경화 챔버를 준비하십시오. 시작하려면 작은 바인더 클립을 사용하여 챔버를 고정하고 18 게이지 바늘을 사용하여 테프론 스페이서의 구멍을 통해 NOA 63을 챔버에 주입합니다. 그런 다음 챔버를 섭씨 125도로 설정된 핫 플레이트에 놓습니다.

챔버 가열 후 5분 동안 챔버를 균일한 온도로 가열합니다. 유리 표면에서 63cm 떨어진 곳에 UV 램프를 배치하여 20분 동안 NOA 6.5을 조달합니다. 면도날을 사용하여 여전히 따뜻한 상태에서 챔버에서 NOA 63을 제거합니다.

그런 다음 섭씨 125도의 열판에 직접 3시간 40분 동안 자외선 아래에서 형상 기억 폴리머를 사후 경화합니다. NOA 63의 형상 기억을 특성화하려면 맞춤형 펀치로 경화 필름을 핫 프레스하여 덤벨 표본을 준비합니다. 마지막으로, 인장 고정 장치가 있는 동적 기계 분석기로 표본을 혐오합니다.

기기를 강제 제어 모드로 설정하고 이 비디오와 함께 제공되는 서면 프로토콜에 있는 대로 테스트 절차를 프로그래밍합니다. 이 절차의 결과는 등온 경화, 형상 메모리, 폴리머 또는 SMP 필름, CSMP를 핫 플레이트에 놓고 유리 전이 온도보다 높게 설정하여 계수를 줄이고 절단을 용이하게 하는 것입니다. 등온으로 경화된 s 및 p 필름으로부터 개별 시료를 제조한다.

면도기로 S 및 P 필름을 원하는 샘플 크기로 자릅니다. 임시 모양은 여러 가지 방법으로 고정할 수 있습니다. 여기. 가열 및 냉각이 가능한 플레이트가 있는 탁상용 유압 프레스는 임시 지형을 엠보싱하는 데 사용됩니다.

먼저 PLA의 온도를 tg보다 높은 온도로 설정합니다. 이 시연을 위해 엠보서는 비닐 레코드에 에폭시를 경화하여 평행 홈의 임시 모양을 만들어 만들었습니다. 엠보서는 다른 재료와 다른 지형으로 만들 수 있지만 NOA 63보다 더 단단해야 합니다.

엠보싱 온도에서 s와 p 샘플을 엠보서에 앞면이 아래를 향하도록 놓습니다. 그런 다음 샘플과 엠보서를 프레스에 넣습니다. 약 100 킬로 파스칼의 예압을 가하여 가열 PLA와 샘플 사이를 접촉시키고 샘플이 균일 한 온도에 도달 할 수 있도록 약 5 분 동안 유지합니다.

균일한 온도에 도달하면 샘플에 1-6메가파스칼을 바르고 1분 동안 유지합니다. SMP가 파손됩니다. 더 큰 응력이 가해지는 경우.

더 작은 응력을 적용하여 더 작은 진폭을 가진 지형을 도입합니다. 압력이 가해진 후 프레스 플레이트의 수냉 기능을 사용하여 온도를 TG 이하로 낮추십시오. 온도가 tg 미만이면 활성 세포 배양 실험을 시작하기 전에 가해진 힘을 제거합니다.

생물 안전 캐비닛의 자외선은 샘플을 살균하는 데 사용됩니다. 뚜껑이 없는 멸균 접시에 샘플을 뒤집어 놓고 UV 광선을 6시간 동안 켭니다. 그런 다음 샘플을 앞면이 위로 향하게 한 새 멸균 접시로 뒤집습니다.

UV 광선을 6시간 더 켭니다. 샘플은 세포로 도금하기 전에 비교적 안정적인 상태로 평형을 이루어야 합니다. 샘플을 96웰 플레이트에 넣고 150마이크로리터의 완전 성장을 추가합니다.

웰당 중간. 원하는 부분 회수에 도달할 때까지 30%CO5의 섭씨 2도 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 이 시연을 위해 샘플을 30시간 동안 배양하여 세포를 정렬하기에 충분한 큰 진폭을 생성합니다.

부분 회수가 달성되면 샘플을 셀로 도금할 수 있습니다. 샘플을 새 96웰 플레이트에 넣습니다. 그런 다음 여기에 있는 각 샘플에 150마이크로리터의 세포 용액을 추가합니다(C3 H 10t 및 반).

대부분의 배아 섬유아세포는 밀리리터 당 20, 000 세포에 이용된다. 고립된 세포를 얻으려면 세포가 섭씨 30도에서 9.5시간 동안 배양하여 임시 지형에 부착되고 확산되도록 합니다. 다음으로 샘플을 제거하고 샘플의 염색 및 형광 이미징을 수행하여 전이 전에 세포 형태를 분석합니다.

이 물질은 Alexa Fluor 6 47과 같은 스펙트럼의 원적색 끝에서 대부분의 UV 및 가시 범위 형광 4를 통해 자가형광을 나타내며 샘플을 복구하기 위해 배경을 줄이고 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터로 이동하고 19시간 동안 배양을 계속하는 것이 좋습니다. 이를 통해 물질이 회복되고 세포가 새로운 지형에 형태를 적응할 수 있습니다. 배양 후 사상액틴 이미징을 위해 fallin과 같은 적절한 염색을 적용합니다.

마지막 단계로, 여기에 표시된 새로운 지형에서 세포를 이미지화할 수 있는 것은 단일 NOA 63 경화의 벌크 단방향 형상 메모리입니다. 세 번 반복되며 별표는 실험 시작이 치료되었음을 나타냅니다. NOA 63은 형상 기억 특성이 뛰어난 투명한 유리 같은 고체입니다.

이 경우, 재료는 경화되었으며 저장 탄성률 강하가 시작될 때 결정된 바와 같이 섭씨 51.1도의 균일한 TG를 보여줍니다. 여기에서 볼 수 있는 변형률의 감소는 측정된 tg에서 발생합니다. 섭씨 20도의 고착 후 89.3%의 고정률에 해당하는 4.7%의 변형률이 가해진 변형률의 상당 부분을 고정한 후 가열시 비교적 작은 온도 범위에서 84.4%의 비율로 회수하였다.

형상 기억 성능은 거의 정확히 동일한 경로를 따르는 모든 곡선에서 알 수 있듯이 최대 3주기까지 저하되지 않았습니다. 임시 지형의 진폭은 섭씨 30도에서 시간이 지남에 따라 30시간씩 감소합니다. 섭씨 30도에서.

진폭이 시간 0에서 여기에 표시된 약 50% 감소했습니다. 다음 10시간 동안 9.5%를 더 줄입니다. 온도를 섭씨 37도로 상승시켜 회복을 트리거하면 사용된 엠보서의 경우 9.5시간 이내에 진폭이 초기 진폭의 0.5%로 감소하고 4.9메가파스칼의 엠보싱 응력이 발생합니다.

이는 13마이크로미터 홈이 거의 평평한 표면으로 기능적으로 변경되는 것에 해당합니다. 이 폴리머는 세포 배양 조건에서 30-37도의 온도 범위에서 회수됩니다. 이는 배양 매체의 수분 흡수로 인해 물 플라스틱이 폴리머 크기를 조정하여 tg를 낮추어 건조 TG 51도 미만의 온도에서 회수할 수 있기 때문입니다.

활성 세포 배양 기질의 사용을 통해 제어되는 세포 거동의 예로는 임시 홈이 있는 기질에서 세포골격 조직의 변화가 있습니다. 회복이 시작되기 전에 액틴 마이크로 필라멘트는 홈의 방향을 따라 정렬됩니다. 온도 상승에 의한 회복 후, 마이크로 필라멘트는 재편성되어 무작위로 배향됩니다.

반대로, 정적, 편평함 또는 정적 홈이 있는 대조군 샘플은 온도 상승 후 재편성되지 않습니다. 이 절차를 시도하는 동안 경화 챔버의 형상, 폴리머의 전이 온도, 변형 고정 방법 및 폴리머 자체의 조성이 모두 이 절차에 따라 자신의 실험에서 원하는 전이를 달성하도록 조정될 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 실시간 PCR과 같은 다른 방법은 유전자 발현이 개발 후 기질의 기계적 자극에 대한 응답으로 어떻게 변화하는지와 같은 추가 질문에 응답하는 데 사용할 수 있습니다.

이 기술은 세포 기계생물학 분야의 연구자들이 세포 골격계, 재배열 및 연질 물질 물리학을 2차원으로 조사할 수 있는 길을 열었습니다. 저희 작업에 관심을 가져주셔서 감사드리며, 시청해주셔서 감사합니다.