활성 세포 배양을위한 형상 기억 폴리머

이 절차의 전체적인 목표는 시간이 지남에 따라 지형이 변화하는 기질에서 세포를 배양하는 것입니다. 이는 먼저 형상 기억 폴리머를 기억될 수 있는 영구적인 형상으로 프로그래밍함으로써 달성됩니다. 그 다음, 형상 기억 폴리머를 일시적인 형상으로 프로그래밍하며, 이후 이 위에 세포를 플레이팅합니다.

절차의 마지막 단계는 온도를 높여 형상 기억 고분자가 영구적인 형상으로 돌아가도록 유도하는 것이며, 최종적으로 형광 현미경을 통해 세포 행동의 변화를 보여주는 결과를 얻을 수 있습니다. 안녕하세요, 저는 시러큐스 대학교의 생의학 및 화학 공학 교수이자 시러큐스 생체재료 연구소 소장인 Pat Mather입니다.

세포 신장을 위해 시판되는 장치나 맞춤형 장치를 사용하는 것보다 이 기술이 갖는 주요 장점은, 단일 고분자 시스템 내에서 세포에 매우 다양하고 복잡한 변형률을 가할 수 있다는 점입니다. 저는 Jay Henderson이며, 의생명 및 화학 공학 조교수이자 Syracuse Biomaterials Institute의 구성원입니다.

이 방법은 세포가 물리적 환경의 역동적인 변화에 어떻게 반응하는지와 같은 기계생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 저는 시러큐스 대학교 의공학 및 화학공학과의 박사 과정 학생인 Kevin Davis입니다. 이 방법은 2D 기계생물학에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 조직 공학을 위한 3D 형상 변경 스캐폴드와 같은 다른 시스템에도 활용될 수 있습니다.

본 절차를 시작하기 전, 유리 슬라이드, 1 mm 두께의 테플론 스페이서 및 알루미늄 플레이트를 사용하여 맞춤형 경화 챔버를 준비하십시오. 소형 바인더 클립으로 챔버를 고정한 후, 18 gauge 바늘을 사용하여 테플론 스페이서의 구멍을 통해 NOA 63을 챔버 내로 주입하십시오. 그런 다음 125 °C로 설정된 핫플레이트에 챔버를 놓으십시오.

챔버 가열 후 5분 동안 챔버가 균일한 온도로 가열되도록 유지합니다. UV 램프를 유리 표면에서 6.5 centimeters 떨어진 곳에 배치하여 NOA 63을 20분 동안 경화시킵니다. 면도날을 사용하여 NOA 63이 아직 따뜻할 때 챔버에서 제거합니다.

그 다음, 125 °C의 핫플레이트 위에서 UV 광원 아래 3시간 40분 동안 형상 기억 폴리머를 후경화시킵니다. NOA 63의 형상 기억 특성을 분석하기 위해, 맞춤형 펀치로 경화된 필름을 열 압착하여 덤벨 모양의 시편을 제작합니다. 마지막으로, 인장 고정 장치가 장착된 동적 기계 분석기(DMA)에 시편을 장착합니다.

기기를 힘 제어 모드로 설정하고, 이 비디오에 제공된 서면 프로토콜에 따라 테스트 절차를 프로그래밍하십시오. 이 절차의 결과물은 등온 경화된 형상 기억 폴리머 또는 SMP 필름입니다. 모듈러스를 낮추어 절단을 쉽게 하기 위해, CSMP를 핫플레이트에 놓고 온도를 유리 전이 온도보다 높게 설정하십시오. 등온 경화된 SMP 필름에서 개별 샘플을 준비하려면 다음과 같이 하십시오.

면도날을 사용하여 s 및 p 필름을 원하는 샘플 크기로 자릅니다. 임시 형상은 여러 가지 다른 방법으로 고정할 수 있습니다. 여기서는 가열 및 냉각이 가능한 플레이트가 장착된 벤치탑 유압 프레스를 사용하여 임시 지형을 엠보싱합니다.

먼저, PLA의 온도를 유리전이온도(tg) 보다 높게 설정하십시오. 본 시연에서는 바이닐 레코드 위에 에폭시를 경화시켜 평행한 홈 모양의 임시 형태를 만들어 엠보서를 제작하였습니다. 엠보서는 다른 재료와 다른 지형 구조로 제작할 수 있으나, 반드시 NOA 63보다 강성이 높아야 합니다.

엠보싱 온도에서 s 및 p 샘플을 엠보서 위에 뒷면이 아래로 향하게 놓습니다. 그다지 샘플과 엠보서를 프레스에 넣습니다. 가열 PLA와 샘플이 접촉하도록 약 100 kilo pascals의 예압을 가하고, 샘플이 균일한 온도에 도달할 때까지 약 5분 동안 유지합니다.

균일한 온도에 도달하면, 샘플에 1~6 megapascals의 압력을 가하고 1분 동안 유지합니다. 그러면 SMP가 파쇄됩니다. 더 큰 응력이 가해지면.

더 작은 진폭의 지형을 형성하려면 더 낮은 응력을 가합니다. 압력을 가한 후, 프레스 플레이트의 수냉 기능을 사용하여 온도를 TG 이하로 낮춥니다. 온도가 tg보다 낮아지면, 활성 세포 배양 실험을 시작하기 전에 가했던 힘을 제거합니다.

생물안전작업대(BSC)의 UV 램프를 사용하여 샘플을 멸균합니다. 뚜껑이 없는 멸균 접시에 샘플의 앞면이 아래로 향하게 배치하고, UV 램프를 6시간 동안 켭니다. 그 후 샘플을 뒤집어 새로운 멸균 접시에 앞면이 위로 향하게 배치합니다.

UV 라이트를 6시간 더 켜둡니다. 세포를 도말하기 전에 샘플을 비교적 안정적인 상태로 평형화해야 합니다. 샘플을 96 웰 플레이트에 넣고 완전 성장 배지 150 µL를 추가합니다.

웰당 배지. 원하는 부분 회복 단계에 도달할 때까지 플레이트를 5%CO2가 포함된 30 °C 인큐베이터에 넣습니다. 본 시연에서는 세포를 정렬시키기에 충분한 진폭을 생성하기 위해 샘플을 30시간 동안 배양합니다.

부분적인 회복이 이루어지면, 샘플에 세포를 플레이팅할 수 있습니다. 샘플을 새로운 96 웰 플레이트에 옮깁니다. 그런 다음 각 샘플에 150 microliters의 세포 용액을 추가합니다, C3 H 10 t and a half.

대부분의 배아 섬유아세포는 mL당 20,000 cells 농도로 사용합니다. 세포를 분리하기 위해, 30 °C에서 9.5시간 동안 배양하여 세포가 일시적인 지형 구조에 부착되고 퍼지도록 합니다. 그 다음, 샘플을 제거하고 염색 및 형광 이미징을 수행하여 전이 전의 세포 형태를 분석합니다.

이 재료는 대부분의 UV 및 가시광선 범위에서 자가형광을 나타내므로, 스펙트럼의 원적색단 영역에 있는 Alexa Fluor 647과 같은 형광체를 사용하여 배경 신호를 줄이는 것이 권장됩니다. 트리거 샘플을 회복시키려면 플레이트를 37 °C 인큐베이터로 옮겨 19시간 동안 배양을 계속하십시오. 이를 통해 재료가 회복되고 세포가 새로운 지형에 맞게 형태를 적응할 수 있습니다. 배양 후, 필라멘트성 액틴 이미징을 위한 phalloidin과 같은 적절한 염색제를 처리하십시오.

마지막 단계로, 세포를 촬영할 수 있으며, 여기에 표시된 새로운 지형은 단일 NOA 63 경화물의 벌크 일방향 형상기억 특성을 나타냅니다. 별표는 실험적 개시 경화 시점을 나타내며, 총 세 번 반복되었습니다. NOA 63은 우수한 형상기억 특성을 가진 투명한 유리질 고체입니다.

본 사례에서 재료는 경화되었으며, 저장 탄성률(storage modulus)의 하강 시작점을 기준으로 측정한 결과 51.1 °C의 균일한 TG를 나타냅니다. 여기서 관찰되는 변형률(strain)의 감소는 측정된 tg에서 발생합니다. 4.7%의 인가된 변형률 중 상당 부분이 20 °C에서 하중 제거 후 고정되었으며, 이는 89.3%의 고정률(fixing ratio)에 해당합니다. 이후 가열 과정 중 상대적으로 좁은 온도 범위에서 고정 변형률이 84.4%의 비율로 회복되었습니다.

모든 곡선이 거의 동일한 경로를 따르는 것으로 입증되었듯이, 형상 기억 성능은 3회 사이클까지 저하되지 않았습니다. 30 °C에서 30시간 동안 일시적인 지형의 진폭이 시간이 지남에 따라 감소합니다. 30 °C에서.

진폭은 시간 0에서 여기에 표시된 바와 같이 약 50% 감소하였습니다. 이후 9.5시간 동안 추가로 10% 더 감소합니다. 온도를 37 °C로 높여 회복을 유도하면, 사용된 엠보서와 4.9 MPa의 엠보싱 응력 조건에서 진폭은 9.5시간 이내에 초기 진폭의 0.5%까지 감소합니다.

이는 13 µm 홈이 있는 구조에서 거의 평평한 표면으로의 기능적 변화에 해당합니다. 이 폴리머는 세포 배양 조건 하의 30~37 °C 온도 범위에서 복원됩니다. 이는 배양 배지로부터의 수분 흡수로 인한 것이며, 흡수된 물이 폴리머를 가소화하여 tg를 낮춤으로써 건조 상태의 TG인 51 °C보다 낮은 온도에서도 복원이 가능하게 합니다.

활성 세포 배양 기판을 사용하여 조절되는 세포 행동의 한 예는 일시적인 홈 기판(grooved substrates) 상에서 일어나는 세포골격 구조의 변화입니다. 회복이 유도되기 전에는 actin 미세섬유가 홈의 방향을 따라 정렬됩니다. 온도 상승을 통해 회복이 이루어진 후에는 미세섬유가 재구성되어 무작위 방향으로 배열됩니다.

반대로, 정적이고 평평하거나 정적인 홈이 있는 대조군 샘플은 온도 상승 후에도 재구성되지 않습니다. 이 절차를 수행할 때, 본인의 실험에서 원하는 전이를 달성하기 위해 경화 챔버의 기하학적 구조, 폴리머의 전이 온도, 변형 고정 방법 및 폴리머 자체의 조성을 모두 조정할 수 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후에는 실시간 PCR과 같은 다른 방법을 사용하여 기판의 기계적 자극에 반응하여 유전자 발현이 어떻게 변하는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.

이 기술은 세포 기계생물학 분야의 연구자들이 2차원에서 세포 세포골격, 재배열 및 연성 물질 물리학을 조사할 수 있는 길을 열어주었습니다. 저희 연구에 관심을 가져주셔서 감사하며, 시청해 주셔서 감사합니다.