Name: 커튼에서 Agrobacterium - 중재 바이러스 유발 유전자 입을 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 배우세요 목화에서 Agrobacterium-중재 바이러스 유발 유전자 침묵(VIGS) 기법을 활용한 GrCLA1 유전자 기능 분석 방법입니다. 이 실험은 RNA 침묵을 유도하여 2주 내에 알비노 표현형을 관찰할 수 있는 신속하고 효율적인 유전자 기능 연구 플랫폼을 제공합니다.

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우리는 DRS에게 감사하고 있습니다. SP Dinesh - 쿠마과 율 리우 TRV - VIGS 벡터, 그리고 DRS. 척 Kenerley, 테리 휠러, 짐 스타와 무명의 씨앗을 제공 바이엘 CropScience. 이 작품은 PH에 LS와 NIH에 NSF에 의해 투자되었다

1. 목화 모종의 성장 <ol><li> 업랜드 커튼 (고십피움 히르수툼) 다양한 Fibermax 832, Phytogen 425RF, Phytogen 480WR 및 지하철 믹스 700 (SunGR, Beavile, WA)이있는 냄비 (지름 7cm)에 Deltapine 90 씨앗을 뿌리다. </li><li> 23 플라스틱 돔 덮여 트레이에서 냄비를 유지 성장 방에 12시간 light/12 시간 어두운 photoperiod 함께 ° C, 120 μE m -2 S -1 빛. </li><li> 이 cotyledons가 등장 돔을 제거합니다. </li><li> 약 2 주후에 VIGS 분석의 두 가지 완전히 확장된 cotyledons과 식물을 사용합니다. 이 단계에서, 진정한 단풍은 아직 (그림 1) 등장하지 않았습니다. </li></ol> 2. GrCLA1​​ 유전자를 운반 건설 VIGS 벡터 <ol><li> G.의 cDNA 라이브러리에서 primers GrCLA1 ​​- F와 PCR, 5' - GCCCTTTGTGCATCTTC - 3 '와 GrCLA1 ​​- R, 5' - CTCTAGGGGCATTGAAG - 3'로 무명의 Cloroplastos alterados 한 유전자 (GrCLA1)를 증폭 raimondii 잎 조직. </li><li> EcoRI과 KpnI과 GrCLA1의 PCR 제품을 다이제스트와 결합하여 pYL156 (pTRV - RNA2) 벡터에 삽입합니다. </li><li> 50 μg / Kanamycin의 ML이 포함된 LB 한천 플레이트에 클론을 화면. 제한 효소 분해 및 시퀀싱하여 구조를 확인합니다. </li><li> electroporation에 의해 Agrobacterium tumefaciens GV3101으로 플라스미드를 변환 28에서 LB 액체 배지에 복구 ° C. LB와 함께 접시에 transformants을 선택 + Kanamycin (50 μg / ML) + Gentamycin (25 μg / ML). 박테리아는 -80 ° C에서 장기 사용을 위해 25 % 글리세롤에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. VIGS 접종을 수행 <ol><li> pYL192 (TRV)를 들고 Agrobacterium의 tumefaciens의 접종, 탄력 냉동 글리세롤 주식 사흘 전에 : RNA1, pYL156 (TRV) : RNA2 (벡터 혼자)과 pYL156 (TRV) : 50 μg / Kanamycin의 ML이 포함된 LB 한천 플레이트에 RNA2 - GrCLA1 25 μg / Gentamycin의 ML. 24 시간 동안 28 ° C에서 접시를 품어. </li><li> VIGS 침투하기 전에 이틀, 위의 접시에서 각 구조에 대한 하나의 식민지를 선택 50 μg / Kanamycin의 ML 25 μg / Gentamycin의 ML과 보충 LB 매체의 5 ML에 그것을 예방, 28에서 세균성 문화를 성장 ° 50 RPM의 속도로 롤러 드럼에서 하룻밤을위한 C. </li><li> (- (4 morpholino) 에탄 설폰산 2) 및 20 μm의 제품 acetosyringone 50 μg / Kanamycin의 ML 25 Gentamycin의 μg / ML, 추가로 10 MM MES와 보충 LB 매체 50 ML있는 플라스크에 위의 문화를 전송합니다. ° C 50 RPM의 속도로 통에 하루를위한 28의 문화를 성장. </li><li> 다음날, 5 분 4,000 RPM에서 농업 박테리아 세포를 스핀 다운, 10 MM MgCl 2, 10 MM MES와 200 μm의의 acetosyringone를 포함하는 침투 버퍼의 문화를 다시는 - 일시 중지합니다. 1.5 문화의 OD 600 조정합니다. </li><li> 3 시간 동안 실온에서 벤치에 문화를 둡니다. </li><li> Agrobacterial 침투하기 전에, 펀치 cotyledons 통해 피어싱없이 25 G 바늘로 목화 식물의 cotyledons의 아래쪽. 하나 또는 두 개의 구멍 (조직의 부드러움에 따라 다름) 떡잎의 각 섹션 (그림 2)에 펀치했다. </li><li> 1:1 비율 RNA2 - GrCLA1, 손 1을 사용하여 입힐 수있는 총알 사이트를 통해 cotyledons의 아래쪽에서 혼합물에 침투해 : RNA1 및 pYL156 (TRV) : RNA2 또는 pYL156 (TRV) pYL192의 Agrobacterial 문화 서스펜션 (TRV)를 혼합 ML needleless 주사기 (그림 3). </li><li> 플라스틱 돔과 함께 식물을 커버하고 야간에 대한 희미한 빛 조건하에 상온에서 침입 식물을 두십시오. </li><li> 23 온도와 성장 방에 식물을 전송 ° C, 120 μE m 12 시간 조명 / 12시간 어두운주기 -2 S -1 빛. </li></ol> 참고 : 식물 23 ° C 또는 글래스 하우스 (25-28 ° C) 중 아래의 경우 VIGS가 작동합니다. 온도 (23-25​​ ° C) 상대적으로 낮은 경우, 그것은 접종을 위해 쉽게하고 표현형 높은 (28-30 ° C) 또는 오르 내렸는지를 보여준다 온도에 비해 더 균일합니다. 돔과 식물을 포함하면 VIGS가 더 효율적입니다. <ol start="10"><li> 7 ~ 8 일 게시 침투에 입을 표현형을 검사합니다. pYL156 (TRV)에 의해 입막음을 식물의 진정한 잎 : RNA2 - GrCLA1는 흰둥이 표현형를 (그림 4)을 표시하기 시작했습니다. Agrobacteria 운반 pYL156 (TRV)와 침투 식물 : RNA2는 컨트롤 역할을합니다. </li><li> 제어 및 침묵 면화 공장으로부터 격리 RNA와 리버스 전사 중합 효소의 연쇄 반응 (RT - PCR)을 사용하여 내생 유전자의 표현 수준을 검사하여 유전자 입을 효율성을 확인합니다. </li></ol> 참고 : TRV는 광범위한 호스트 범위를 가지고 있으며 신고 대상 병원체이므로 VIGS - ed를 식물이 포함된 검역 조건과 식물에 따라 보관해야 제대로 autoclaved 및 assays 후 처리하여야한다. 4.대표 결과 : 약 이주 Agrobacterial 혼합 손으로 침투 후 GrCLA1 ​​입을 의한 흰둥이 표현형 분명 진정한 나뭇잎에서 관찰되었다. 입을 효율 50 개 이상의 식물을 여러 실험을 거의 100 %에 도달합니다. 입을 식물 새롭게 엘더 단풍 (그림 4)에 모자이크와 나뭇잎을 개발에 균일하게 배포하고 강한 흰둥이 표현형를 표시합니다. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Agrobacterial 침투에 사용이 완전히 확장 cotyledons 두 주간 올드 스테이지에 대해에서 무명 세들링. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 2"> 그림 2. Agrobacterial 침투를 용이하게하기 위해 25 G 바늘을 사용하여 목화 식물의 cotyledons의 아래쪽에 작은 구멍을 펀칭. <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 입힐 수있는 총알 사이트를 통해 무명의 cotyledons에 Agrobacterial 혼합의 핸드 침투는 needleless 주사기를 사용하여 <img src="/files/ftp_upload/2938/2938fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="그림 4"> 그림 4. 알비노 표현형은 면화 공장을 침묵 VIGS에 나타났습니다. 네 cultivars가 표시됩니다. A) Fibermax 832, B) Phytogen 480WR, C) Phytogen 425RF, D) Deltapine 90.

<ol><li>Chen, Z. J., Scheffler, B. E., Dennis, E., Triplett, B. A., Zhang, T., Guo, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+sequencing+cotton+%28Gossypium%29+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Toward sequencing cotton (Gossypium) genomes.</a> Plant Physiol. 145, 1303-1310 (2007).</li>
<li>Dinesh-Kumar, S. P., Anandalakshmi, R., Marathe, R., Schiff, M., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing.</a> Methods Mol Biol. 236, 287-294 (2003).</li>
<li>Hamilton, A. J., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+species+of+small+antisense+RNA+in+posttranscriptional+gene+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants.</a> Science. 286, 950-952 (1999).</li>
<li>Burch-Smith, T. M., Anderson, J. C., Martin, G. B., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+and+advantages+of+virus-induced+gene+silencing+for+gene+function+studies+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants.</a> Plant J. 39, 734-746 (2004).</li>
<li>Liu, Y., Schiff, M., Dinesh-Kumar, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-induced+gene+silencing+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Virus-induced gene silencing in tomato.</a> Plant J. 31, 777-786 (2002).</li>
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<li>Mandel, M. A., Feldmann, K. A., Herrera-Estrella, L., Rocha-Sosa, M., Leon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLA1%2C+a+novel+gene+required+for+chloroplast+development%2C+is+highly+conserved+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">CLA1, a novel gene required for chloroplast development, is highly conserved in evolution.</a> Plant J. 9, 649-658 (1996).</li>
<li>Gao, X., Wheeler, T., Li, Z., Kenerley, C., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+GhNDR1+and+GhMKK2+compromised+cotton+resistance+to+Verticillium+wilt%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Silencing GhNDR1 and GhMKK2 compromised cotton resistance to Verticillium wilt.</a> Plant J. 66, 293-305 (2011).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

VIGS은 transiently 내생 유전자의 표현을 쓰러뜨린하여 기능적 게놈 분석에 강력한 도구로 입증되었습니다. 본 연구에서는, 우리는 TRV 기반 이진 벡터를 이용하여 Agrobacterium - 중재 VIGS을 개발했습니다. 커튼 CLA1 (GrCLA1) 유전자는 입을 효율성을 모니터링하는 시각 마커로 개발되었습니다. 우리는 지속적으로 모든 종류의 진정한 나뭇잎에 나타나는 흰둥이 표현형은 약 2 주 게시물 침투로부터 시작, 테스트에 의해 입증 유전자 입을 효율의 100 %를 획득했습니다. 그러나, CLA1 - 침묵 면화 공장 거의 가능성이 엽록체 개발에 강한 결함에 의한 섬유 또는 종자 단계로 발전하지 않습니다. 목화 VIGS의 성공적인 개발은 쉽게 손실 기능 assays에 대한 관심의 유전자를 침묵하는 대안을 제공하고 빠르게 다가오고 포스트 게놈 시대 8 면화 기능 유전학 / 유전체학에 대한 기초를 낳는다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 및 장비의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 / 일련 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 롤러 드럼 </td><td> 글라스 - 콜, LLC. </td><td> 099A TC108 </td><td> 농업 세균 문화 </td></tr><tr><td> 보육기 </td><td> 셸던 제조 주식 회사 </td><td> 01046209 </td><td> 농업 세균 문화 </td></tr><tr><td> UV / 비스 분광 광도계 </td><td> 베크맨 쿨터 </td><td> 모델 : DU530 </td><td> 측정 OD </td></tr><tr><td> 진 Pulser </td><td> BioRad </td><td> 모델 : 1652076; 직렬 : 154BR3880 </td><td> Electroporation </td></tr><tr><td> Pulser 컨트롤러 </td><td> BioRad </td><td> 모델 : 1652098; 직렬 : 232BR4833 </td><td> Electroporation </td></tr><tr><td> Micropulser Electroporation 쿠베​​트 </td><td> BioRad </td><td> 165-2081 </td><td> Electroporation </td></tr><tr><td> 1 ML 주사기 </td><td> BD Biosciences </td><td> 30,962 </td><td> 농업 세균의 접종 </td></tr><tr><td> 메트로 믹스 700 </td><td> SUNGR </td><td> SKU # 553001 </td><td> 성장 세들링 </td></tr><tr><td> 테라 코타 냄비 </td><td> TOPlastics </td><td> GPS 3001B2 </td><td> 성장 세들링 </td></tr><tr><td> MES 일수화물 </td><td> USB </td><td> 18,886 </td><td> 침투 버퍼 </td></tr><tr><td> Acetosyringone </td><td> 시그마 </td><td> D134406 </td><td> 침투 버퍼 </td></tr></tbody></table>

커튼에서 agrobacterium - 중재 바이러스 유발 유전자 입을 분석

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

커튼 (고십피움 히르수툼)는 세계적으로 가장 중요한 작물 중 하나입니다. 상당한 노력은 새로운 종류의 분자 육종에되었습니다. 면화의 대규모 유전자 기능 분석은 게놈, 유전자 복제 및 polyploidy, 유전자 변형 1 길이 성장주기와 말을 안들음 자사의 대형에 의한 가능성이 현대 식물 종, 대부분의 뒤에서 느껴지되었습니다. 커튼 높은 처리량 기능 유전자 / 게놈 연구를 촉진하기 위해, 우리는 면화 유전자 기능을 평가하기 위해 신속하고 효율적인 과도 assays을 개발하려고합니다. 바이러스 유도된 유전자 입을 (VIGS)은 바이러스 확산 2,3을 주체할 수있는 호스트 포스트 Transcriptional 진 입을 (PTGS)을 기반으로 개발된 강력한 기술입니다. Agrobacterium - 중재 VIGS가 성공적으로 같은 Solanaceae, Arabidopsis과 콩과의 식물 수종으로 dicots 종의 다양한 적용 및 monocots 수종 다양한 기능적 게놈 연구 3,4을 위해 보리, 밀 및 옥수수를 포함하고 있습니다. 이 신속하고 효율적인 접근법 식물 변환을 피할 수와 기능 중복을 극복로서, 그것은 특히 매력적이고 변화에 대한 의무가없는 목화 같은 작물 종의 기능 게놈 연구에 적합합니다. 본 연구에서는, 우리는 목화의 Agrobacterium - 중재 VIGS 시스템의 상세한 프로토콜을보고합니다. 여러 바이러스 VIGS 벡터 중에서 담배 래틀 바이러스 (TRV)는 호스트의 다양한 침공하고 아직 hosts5에 가벼운 증상을 생산하여 전체 공장을 통해 적극적으로 전파 수 있습니다. 입을 효율, GrCLA1, alterados 1 면화의 유전자 (AtCLA1). CLA1 유전자가 엽록체 개발 6 관여 복제 및 VIGS 이진 벡터 pYL156에 삽입되었으며, 이전의 연구 보여주 Arabidopsis Cloroplastos의 상동체 유전자를 모니터링하는 것을 AtCLA1의 손실 기능은 효율을 입을 수있는 훌륭한 시각적인 마커를 제공하고, 진정한 나뭇잎 7 흰둥이 표현형 결과. 약 이주에 게시 Agrobacterium의 침투, 흰둥이 표현형은 모든 복제 실험에서 100 % 입을 효율, 진정한 나뭇잎에 표시하기 시작했습니다. 내생 유전자 표현의 입을는 RT - PCR 분석에 의해 확인되었다. 크게, 입을는 potently 텍사스 다양한 상업적으로 재배 품종을 포함하여 우리가 테스트한 모든 cultivars에 발생할 수 있습니다. 이것은 신속하고 효율적인 Agrobacterium - 중재 VIGS 분석은 목화의 게놈 - 넓은 수준에서 유전자 기능을 신속하게 대규모 분석을위한 매우 강력한 도구를 제공합니다.

우리는 목화의 Agrobacterium - 중재 바이러스 유발 유전자 입을 (VIGS) 분석에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다. 담배 래틀 바이러스 (TRV) - 파생 VIGS 벡터는 면화 GrCLA1​​, Cloroplastos alterados 1 유전자의 입을 RNA를 유도하기 위해 배치되었다. 입을 GrCLA1​​로 인한 흰둥이 표현형은 접종 후 2 주 이내에 세들링 단계에서 관찰되었다.

커튼에서 Agrobacterium - 중재 바이러스 유발 유전자 입을 분석

면화(Gossypium hirsutum)는 전 세계적으로 가장 중요한 작물 중 하나입니다. 새로운 품종의 분자 육종을 위해 상당한 노력이 기울여져 왔습니다. ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 유전자 기능을 연구하기 위해 목화에서 아그로박테리움 매개 바이러스 유도 유전자 침묵 분석법을 개발하는 것입니다. 이를 위해 먼저 목화 묘목을 10일에서 2주일령까지 성장시킵니다. 그런 다음 목화 엽록체 rados 1 유전자를 담배 쇠세포 바이러스(tobacco rattle virus) 기반의 vs 벡터로 클로닝합니다.세 번째 단계는 P-T-R-V-R-N-A one 및 P-T-R-V-G-R-C-A one을 포함하는 agrobacterium 배양액을 준비하는 것입니다. 마지막 단계는 이 agrobacterium 배양액을 면화 자엽(cotyledon)에 수동 접종하는 것입니다. 최종적으로, 약 2주 후 면화 식물의 본잎에서 알비노 표현형을 관찰함으로써 유전자 침묵 결과를 확인할 수 있습니다.이 기술이 형질전환과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은 VIGs가 면화의 유전자 기능 연구를 위한 신속하고 효율적인 플랫폼을 제공한다는 점입니다. 이 방법은 면화의 게놈 수준에서 유전자 기능을 신속하고 대규모로 분석하는 강력한 도구가 될 수 있으며, 다른 중요한 작물 종에도 적용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람은 아그로박테리움 배양액을 면화 꽃가루관에 수동으로 접종하는 것이 어렵기 때문에 시행착오를 겪을 수 있습니다.이 방법은 바이러스 유도 유전자 침묵(virus induced gene silencing)을 위해 면화 묘목을 재배하는 것과 같이 유전자 기능을 탐구하는 등 면화 유전학 및 유전체학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. Metro Mix 700을 여러 개의 7cm 화분에 채우고 채워진 화분들을 트레이에 놓습니다. 다음으로 Fibermax 832 PhytoGen 4, 25 RF PhytoGen 4 80 WR, Delta Pine 90과 같은 여러 육지면 품종의 종자를 심습니다.준비된 화분에서, 화분이 담긴 트레이를 플라스틱 돔으로 덮고 23 °C, 120 µEinsteins/m²/s 광도, 12시간 명기 및 12시간 암기의 광주기 조건인 생장실에 트레이를 배치합니다. 3~4일 후, 두 개의 떡잎이 나오면 플라스틱 돔을 제거합니다. 면화 식물이 두 개의 완전히 확장된 떡잎이 발달한 단계에 도달할 때까지 약 10일 동안 성장하도록 둡니다. 본잎이 나오기 전 단계가 되면, 해당 식물들은 바이러스 유도 유전자 침묵(virus induced gene silencing) 분석에 사용할 준비가 된 것입니다.이 클로닝 절차는 목화 식물이 완전히 전개되는 단계에 도달하는 2주의 기간 동안 수행해야 합니다. 먼저, 표준 PCR 절차에 따라 서면 프로토콜에 제공된 프라이머를 사용하여 CACI remondi 잎 조직의 cDNA 라이브러리로부터 목화 엽록체 one 유전자를 증폭합니다. 그런 다음 효소 제조사의 프로토콜에 따라 Eco R I와 K PN I로 GCA one PCR 산물을 제한효소 처리합니다.Athene 브로마이드 겔에서 500 base pair PCR 산물을 시각화합니다. 밴드를 절단하여 DNA를 추출하고, 정제된 PCR 산물을 PYL 1 56 벡터에 라이게이션합니다. T four DNA Ligase를 사용하여 라이게이션된 벡터를 컴피턴트 e coli 세포에 형질전환시키고, 형질전환된 세포 10 to 50 µL를 50 µg/mL의 canam mycin이 포함된 LBA 한천 배지에 도말합니다.플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 플레이트에서 콜로니를 선택하여 50 µg/mL의 kanamycin이 포함된 2 mL의 LB broth에서 하룻밤 동안 배양합니다. 원심분리를 통해 박테리아를 회수하고 표준 절차에 따라 DNA prep을 수행합니다. 플라스미드 DNA를 정제하고, 제한 효소 처리 및 시퀀싱을 통해 컨스트럭트를 검증합니다.PYL 1 56 벡터 내 삽입물의 존재와 방향이 확인되면, 플라스미드를 agrobacterium tumor fas GV 3 1 0 1에 전기천공하고 28 °C의 LB 액체 배지에서 회복시킵니다. 50 µg/mL의 can mycin과 25 µg/mL의 gentamycin이 함유된 LBI 아가 플레이트에서 형질전환체를 선별합니다. 필요에 따라, 박테리아를 25% glycerol과 함께 -80 °C에서 보관할 수 있습니다.접종 3일 전에 PYL 1 9 2 RNA one, PY 1 56 RNA two 및 PY 1 56 RNA two GLA one을 포함하는 Agrobacterium tumefaciens의 T-thought 글리세롤 스톡을 LB 항생제 한천 배지에 스트리킹하고, 28 °C에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 각 컨스트럭트의 단일 콜로니를 선택하여 50 µg/mL의 kanamycin과 25 µg/mL의 Gentamycin이 첨가된 5 mL의 LB 배지에 접종합니다.분당 50회 회전 속도로 설정된 쉐이커에서 28 °C로 하룻밤 동안 박테리아 배양액을 배양합니다. PYL 1 56 RNA two GLA one 배양액과 대조군 배양액을 50 µg/mL의 can mycin과 25 µg/mL의 Gentamycin, 그리고 10 mM MES 및 20 µM aceto. Cy Ringy가 첨가된 50 mL의 LB 배지가 담긴 각각의 플라스크로 옮깁니다. 분당 50회 회전 속도로 설정된 쉐이커에서 28 °C로 하룻밤 동안 배양액을 배양합니다.다음 날, 배양액을 원심분리관으로 옮기고 아그로박테리아 세포를 4,000 rpm에서 5분 동안 원심분리합니다. 10 mM 염화마그네슘, 10 mM MES 및 200 µM acetosyringone가 포함된 침투 완충액에 배양액을 다시 현탁합니다. 배양액의 OD 600을 측정하고 침투 완충액을 사용하여 1.5로 조정합니다. 아그로박테리아 잎 침투 전, 배양액을 상온의 벤치 위에서 3시간 동안 배양합니다.면화 식물 cotton leadin의 하단부를 25 gauge 바늘로 찌르되, cotton leadin을 완전히 관통하지 않도록 합니다. Cotton Leadin의 각 섹션에 한두 개의 구멍을 뚫습니다. 그 다음 PYL 1 92 RNA one 아그로박테리아 배양액을 PYL 1 56 RNA two 또는 PY 1 56 RNA two GRCA one과 1:1 비율로 혼합합니다.그 다음, 1 mL 주사바늘이나 주사기를 사용하여 뚫려 있는 구멍을 통해 혼합물을 솜 리드인(cott lead-ins) 하단부에 주입합니다. 식물을 플라스틱 돔으로 덮고, 침투시킨 식물을 희미한 빛 조건의 상온에서 하룻밤 동안 둡니다.식물을 온도 23 °C, 광도 120 µE m⁻² s⁻¹, 12시간 명기/12시간 암기 주기의 생장실로 옮깁니다. 침윤 후 7~8일째에 사이런싱 표현형을 관찰합니다. 이 시점에 PY 1 56 RNA two GLA one에 의해 사이런싱된 식물의 본잎에서 알비노 표현형이 나타나기 시작합니다.PYL 1 56 RNA two를 운반하는 아그로박테리아로 침투시킨 식물은 대조군으로 사용한다. 표준 절차에 따라 대조군 및 유전자 억제 면화 식물에서 분리한 RNA를 이용하여 역전사 PCR을 수행함으로써 내인성 유전자의 발현 수준을 조사하고, 유전자 억제 효율을 검증한다.이 이미지는 GLA1 유전자의 바이러스 유도 유전자 억제(VIGS) 후의 fiber max 8 3 2 품종을 보여줍니다. 여기서 유전자 억제가 일어난 흰색 잎을 확인하십시오. PHYTO four 80 WR 품종 또한 바이러스 유도 유전자 억제 후 알비노 표현형을 나타냅니다.마찬가지로, 이 phyto 4 2 5 RF 품종은 바이러스 유도 유전자 침묵이 일어난 부위에서 흰색 잎을 나타냅니다. 마지막으로, 이 이미지는 Delta PINE 90 품종에서 수행된 또 다른 성공적인 바이러스 유도 유전자 침묵 실험 결과를 보여줍니다. 이 절차를 수행할 때, 아그로박테리움 배양액을 벤치 위에 3시간 동안 두기 전에 아세톤을 첨가해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이후 개발된 유전자 기능을 탐구하는 것과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 vig, CD NA 라이브러리 클로닝과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 식물 유전학 분야의 연구자들이 경제적으로 중요한 작물 식물에서 유전자 기능과 항생제 및 생물적 스트레스에 대한 방어 반응을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 데이터가 준비되면, 적절하게 수행했을 때 이 기술은 2~3일 이내에 완료될 수 있습니다.이 영상을 시청하고 나면 면화에서 바이러스 유도 유전자 침묵(virus induced gene silencing)을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

agrobacterium-mediated-virus-induced-gene-silencing-assay-in-cotton

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노크를 다운 유전자 표현의에 대한 바이러스 유도된 유전자 입을 (VIGS) 메서드에 대한...

바이러스 유도 진 입을 (VIGS)에 Nicotiana benthamiana 토마토

출처: Shi, J. 외. 식물 병원체의 분비 효과자로부터 RNA 침묵 억제제의 스크리닝 및 확인. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 Nicotiana benthamiana 16c에서 RNA 침묵을 억제하는 병원체 효과 단백질을 규명하기 위한 공동 침투 분석 방식을 보여줍니다. 형광 리포터와 후보 효과기 유전자가 아그로박테리움 을 통해 식물 잎에 전달됩니다. 일반적으로 RNA 침묵은 보고자 전사체를 분해하여 형광을 감소시킵니다. 억제 효과기가 이 반응을 차단하여 형광을 보존합니다. 이 분석법은 숙주 방어를 방해하는 미생물 효과자를 빠르고 시각적으로 스크리닝하는 방법을 제공합니다.

식물 RNA 침묵을 억제하는 병원체 효과자를 선별하기 위한 공동 침윤 분석법

출처: Shi, J. 외, 식물 병원체의 분비 효과자로부터 RNA 침묵 억제 물질의 스크리닝 및 식별. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 아 세 토시린곤으로 병원성 유전자 발현을 유도한 후 세척과 재현탁을 통해 항생제를 제거하여 식물 조직에 유전자 전달을 위한 형질전환 준비 현탁액을 생성하는 과정을 시연합니다.

식물 세포에 유전자 전달을 위한 아그로박테리움 배양 준비

출처: Beernink, B. M. 외 재조합 여우꼬리 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 감염성 클론을 주입하여 옥수수 묘목을 직접 농연균화합니다. J. Vis. 경험 (2021)이 영상은 아그로박테리움 매개 재조합 바이러스 클론을 옥수수 묘목에 전달하여 유전자 침묵을 시연합니다. 이 연구는 아그로박테리움 감염, 전신 바이러스 확산, RNA 간섭에 의한 표현형 변화 과정을 개괄합니다.

아그로박테리움 매개 재조합 바이러스 클론을 옥수수 묘목에 전달하여 유전자 침묵을 위한 방법

바이러스에 의한 유전자 침묵은 식물의 nonhost 저항성에 관련된 유전자를 식별하기위한 유용한 도구입니다. 우리는 nonhost 병원균에 감염 유전자 침묵 식물을 식별 GFPuv을 표현 세균성 병원체의 사용을 보여줍니다. 이 방법은 빠르고, 간단하고 대규모 검사와 유사한 프로토콜이 다양한 식물 미생물 상호 작용을 연구에 적용 할 수있는 용이하게합니다.

유전자의 식별을위한 VIGS - 중재 앞으로 유전학 검사는 Nonhost 저항에 참여

아그로 박테리아는 (담배 모자이크 바이러스 계는) 백신 항원과 치료 단백질을 생산하기 위해 신속하고 경제적 인 방식 발사 벡터를 들고있는 진공 침투에 근거 된 담배 식물에서 과도 단백질 생산. 우리는 절차를 간소화하고, 세균의 배양 조건을 최적화 호스트 종을 선택하고 RNA 침묵 억제를 공동 도입하여 대상 축적을 개선.

최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

우리는 라이브 셀에 복잡 한 규제 및 신호 메커니즘을 연구를 많은 양의 콩 protoplasts의 준비를 위한 간단 하 고 효율적인 프로토콜을 개발.

콩 Protoplasts 및 변이 유전자 표정 분석 응용 프로그램의 격리에 대 한 간단한 방법

여기서, 우리는 식물 병원체에서 RNA 침묵 억제제를 신속하게 스크리닝하는 데 광범위하게 사용될 수 있는 변형된 스크리닝 방법을 제시한다.

식물 병원균의 분비 이펙터에서 RNA 침묵 억제제의 스크리닝 및 식별

농균 계 주사 (농업 주입) 프로토콜은 옥수수 묘목으로 여우 꼬리 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 클론의 접종을 위해 제시된다. 이러한 방식으로 접종은 바이러스 감염, 마커 유전자의 바이러스 유발 유전자 침묵, GFP의 바이러스 과발현으로 이어집니다.

재조합 폭스테일 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 감염 클론주사에 의해 옥수수 묘목의 직접 농경화

여기에서 우리는 형질전환 대두 털 뿌리의 고효율 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다.

유전자 기능 분석을 위한 콩 털이 뿌리 형질전환

여기에서는 대형 식물의 유전적 형질전환에 대한 생체 내 연구를 위한 국소 진공 침투를 위한 첫 번째 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론을 사용하여 우리는 처음으로 카카오의 식물의 일시적인 변형에서 Agrobacterium을 매개 하는 것을 달성했습니다.

난치성 식물의 식물 변형 을 위한 진공 강제 농업 여과: 사례 연구로서의 카카오

배우세요 목화에서 Agrobacterium-중재 바이러스 유발 유전자 침묵(VIGS) 기법을 활용한 GrCLA1 유전자 기능 분석 방법입니다. 이 실험은 RNA 침묵을 유도하여 2주 내에 알비노 표현형을 관찰할 수 있는 신속하고 효율적인 유전자 기능 연구 플랫폼을 제공합니다.

커튼에서 Agrobacterium - 중재 바이러스 유발 유전자 입을 분석

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