Name: 전자 레인지 전송 전자 현미경으로 식물 바이러스 질병의 신속한 진단을 도와 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 학습하세요 전자 레인지 전송 전자 현미경을 이용한 식물 바이러스 질병의 신속한 진단 방법을. 샘플 준비 시간을 약 2시간으로 단축하여 반나절 내에 명확한 진단이 가능하며, 담배 모자이크 바이러스 등 다양한 식물 바이러스를 효율적으로 식별할 수 있습니다.

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이 작품은 오스트리아 과학 기금 (FWF, P20619 및 BZ에 P22988)에 의해 지원되었다.

전자 지원 샘플 준비 <ol><li> 샘플 준비 하나의 시작 전자 현미경에 대한 자동 전자 조직 프로세서 (Leica EM AMW, Leica 마이크로 시스템즈, 비엔나, 오스트리아)을 프로그램 할 필요가 전에 TEM에 대한 전자 지원 샘플 준비에 대한 다음 프로토콜 (표 1) : <img src="/files/ftp_upload/2950/2950table1.jpg" alt="표 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="표 1"> 표 1. 전자 방사선을 사용하여 샘플 준비를위한 프로토콜. 다른 열 (왼쪽에서 오른쪽으로) 표시 : <ol><li> 유리 병 번호 (비알의 NR은.) 유리 병은 프로세서의 회전 목마에로드되는 순서를 나타냅니다. </li><li> 실제 프로세스의 단계. </li><li> 병에 시약. </li><li> 실제 단계의 기간. </li><li> 전자 조사가 해제되기 전에 병에 도달 최대 온도. </li><li> 전자 방사선 설정 : 연속 = 급속한 온도 increASE, 설정 온도를 개최, 슬로프 = 부드러운 온도 상승, 끝 부분에 도달 최종 온도는, 온도가 5 감소 할 때까지 펄스 = 신속한 온도 상승, 전원이 꺼져 ° C, 전원이 온도에 도달 재개 할 수 있습니다. </li><li> 전자 조사의 최대 전력. </li></ol></li><li> 갓 샘플 준비 프로토콜 (한천 100 에폭시 수지에 1.7 참조​​)에 설명 된 여러 단계의 솔루션을 준비, 프로그래밍 프로토콜 (표 1)에 따라 지정된 병에 넣어 작성, 회전 목마에 튜브를로드 한 다음을 삽입 전자 레인지 조직 프로세서, 그리고에 회전 목마가 마침내 모노 모드 챔버 내로 첫 번째 병을로드합니다. </li><li> 60mM 소렌슨 3 %의 글 루타 알데히드 (한천 과학 (주), 스탠스 테드, 영국)의 드롭 모델링 왁스 판에 면도날과 담배 모자이크 바이러스 (TMV)에 감염된 Nicotiana의 tabacum에서 잎의 작은 섹션 (1mm 2) 잘라 온도는 실온에서 인산 버퍼 (산도 7.2)erature. </li><li> 즉시 약 200μm의 메쉬 폭 지정 바구니에 고급 핀셋으로 섹션을 전송합니다. 서로의 상단에있는 바구니를 스택과 모노 모드 챔버에 삽입. 케어는 샘플을 지속적 아웃 건조하지 않도록로드 및 바구니의 스태킹 동안 정착액 솔루션으로 덮여 있다는주의해야합니다. </li><li> 고정, 탈수와 침투에 대한 이전에 프로그램 된 전자 레인지 지원 샘플 준비 절차를 시작합니다. </li><li> 샘플 준비가 전자 조직 프로세서에 의해 자동으로 수행되는 동안 섹션 3 (부정적인 염색법)에 설명 된대로 나머지 공장 소재 부정적인 착색를 계속합니다. </li><li> 플라스틱 컵에 기입 24g 한천 100, 16g dodecenyl succinic 무수물, 그리고 10g 메틸 nadic 무수물 (모든 구성 요소에 대한 한천 과학 (주), 스탠스 테드, 영국 참조), 열 : 신선 다음과 같은 구성 요소 설명 된대로를 혼합하여 한천 100 에폭시 수지를 준비 거기에40 ° C와 잘 섞는다. 벤질 dimethylamine의 1.2g을 추가하고 철저하게 섞는다. 샘플 준비 프로토콜이 종료 (예 : 표 1의 단계 22시)에있어서 바로 전에 지정된 중합에 한천 100 에폭시 수지를 기입은 형성한다. </li><li> 프로토콜이 완료되면 (표 1에서 단계 22 이후) 모노 모드 챔버에서 회전 목마의 마지막 유리 병에 침투 샘플을 포함하는 스택 바구니를 놓습니다. 전자 장치에서 회전 목마를 제거, 바구니를 제거시켜야하고 지정된 중합 형태로 고급 핀셋을 이용하여로드합니다. 케어는 샘플이 항상 unstacking하고 아웃 건조하지 않도록로드하는 동안 한천 100 에폭시 수지로 덮여 있다는주의해야합니다. </li><li> 서로의 상단에있는 중합 양식을 쌓아. 케어는 샘플을 항상 스택과 그들이 건조하지 않도록로드하는 동안 한천 100 에폭시 수지로 덮여 있다는주의해야합니다. </li><li> 전자 레인지 tiss의 회전 목마에서 이전에 사용 된 튜브를 제거UE 프로세서는 스택 바구니로로드하고 전자 레인지 조직 프로세서에 회전 목마를 삽입합니다. </li><li> 이전에 프로그램 된 중합 프로토콜 (표 1)를 시작합니다. </li><li> 중합은 전자 레인지 조직 프로세서에 의해 자동으로 수행하는 동안 전송 전자 현미경과 부정적인 스테인드 격자를 검토 [예 필립스 CM10 TEM, 페이 (구 필립스), 아인트호벤, 네덜란드]와 섹션 3과 4 (에 설명 된대로 이미지 분석을 수행 부정적인 착색 및 이미지 분석). </li><li> 프로토콜은 제거시켜야한다, 모노 모드 챔버에서 중합 양식을 중합 양식을 제거하고 샘플을 포함 polymerized 블록을 제거 완료되면. 그들은 지금 마이크로톰으로 sectioned 될 준비가 된 것입니다. </li></ol> 2. 트리밍 및 sectioning <ol><li> ultrathin의 홀더에 대해 상단 그걸 고정에 샘플로 1cm를 sectioning에 대해 별도의 샘플 홀더에 하나 이상의 블록을 삽입합니다. </li><li>TEM (예 : Leica 라이 Ultratrim, Leica 마이크로 시스템즈)에 대한 표본 트리머로 블록을 잘라 있도록 최대의 블록 얼​​굴. 길이 (얼굴 크기를 차단 다이아몬드 나이프의 크기에 조정해야 할 수도) 달성 가능한 한 많은 잎 물질을 포함하는 폭 200μm의 1mm. </li><li> 45 ° (예 : Diatome 울트라 45, Gröpl, Tulln, 오스트리아)의 칼 각도로 다이아몬드 칼을 사용하여, ultramicrotome (Leica 마이크로 시스템즈 예 라이 Leica Ultracut S)와 제 블록을. 섹션의 두께는 약 70 ~ 90nm로 조정해야하며 절단 속도는 1mm / s의 주변에 있어야합니다. formvar (한천 과학 (주)) 코팅 구리 또는 니켈 321 평방 메쉬 그리드에 여러 섹션을 선택합니다. </li><li> 일부 2 무료 CO를 만들 NaOH로 가득 배양 접시에 5 분, 리드 구연산 (42ml 더블 증류수와 8ml 1N NaOH에 용해 1.1g 리드 구연산 한천 과학 (주))와 그리드의 섹션을 포스트 얼룩 환경 15 마일에1 % uranyl 아세트산 (한천 과학 (주))와 nutes는 상온에서 증류수에 용해. 각 포스트 착색 단계 사이에 1 분 동안 증류수로 격자를 씻으십시오. 공기는 그리드 상자에 격자를 건조. </li><li> 전송 전자 현미경 (예 : 필립스 CM10 TEM, 페이, 아인트호벤, 네덜란드)와 ​​섹션을 확인합니다. </li></ol> 3. 음성 염색법 <ol><li> TMV에 감염된 잎 소재의 100mg 약 60mM 인산 Søfrensen 버퍼 (산도 7.2)의 100μl의 현미경 슬라이드에 면도날을 2 분 동안 자료를 homogenizing으로 원유 수액을 준비 수확. </li><li> 4 개 이상의 우물 (또는 그 parafilm의 한 부분에 homogenate를 전송하는 것도 가능합니다)와 테플론 코팅 현미경 슬라이드의 잘 처음에 결과 homogenate의 20μl를 전송합니다. </li><li> 드롭 및 incu으로 직면하고있는 formvar (한천 과학 (주)) 코팅 된면으로 homogenate의 상단에 formvar 코팅 그리드를 배치5 분을 덜다. </li><li> 200μl 60mM 인산 소렌슨 버퍼 (산도 7.2) 두 방울의 상단에있는 격자를 배치하여 격자에게 이분 각각에 대한 2 번 씻으십시오. </li><li> 신선하게 조리 된 2% phosphotungstic 산 (한천 과학 (주)) 60mM 인산 소렌슨 버퍼 (산도 6.5)에 솔루션을 1 분 격자를 품다. </li><li> 그리드를 제거하고 그리드 상자에 드라이를 방송 할 수 있습니다. </li><li> 전송 전자 현미경 (; 페이, 아인트호벤, 네덜란드 필립스 등 CM10 TEM)으로 격자를 검사합니다. 21000X 이상의 기본 배율에서 전송 전자 현미경으로 무작위로 선택한 부정적인 스테인드 virions의 적어도 10 이미지를 (적어도 10 명 이상 virions 각 이미지에 표시됩니다)보세요. 주의 모든 이미지가 동일한 배율을 가지고 촬영해야합니다. </li></ol> 4. 이미지 분석 <ol><li> 에서 가져온 micrographs에 최소 100 무작위로 선택된 하나의 바이러스 입자의 길이와 너비를 측정모든 이미지 분석 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 부정적인 스테인드 샘플 입자 분석 도구 또는 Optimas과 [예를 들면 세포 D (올림푸스, 생활과 재료 과학 유럽 GmbH의, 함부르크, 독일) 6.5.1-(미디어 인공 이식 주식회사 메릴랜드 주 베데스다, USA)]. </li><li> 부정적인 착색 방법 및 TEM으로 시각화 바이러스 입자의 평균 길이와 너비를 달성하기 위해 수단과 표준 편차를 계산합니다. </li><li> 명확하게 바이러스 질병을 파악하기 위해 문헌에 알려진 바이러스 질환에 의해 유도 바이러스와 ultrastructural 변경의 크기와 길이와 ultrastructural 기능을 (2.5에서 얻은) 비교합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 : 같은 전자 지원 샘플 준비 전형적인 TMV 유발 ultrastructural 변경 한 후 병렬 형태로 정렬 virions을 포함하는 넓은 영역은 감염된 담배의의 세포 기질에 전송 전자 현미경으로 관찰 할 수tabacum 세포 (그림 1A). 또한 TMV에 감염된의 원유 SAP에서 TMV 입자가 부정적인 착색 후 flexuous, 막대 모양의 구조 (그림의 1B)로 관찰 할 수 둡니다. 100 바이러스 입자의 이미지 분석은 폭 길이와 17nm에서 280nm (그림 2)의 TMV에 대한 평균 크기를 발표했다. TMV에 감염된 세포와 본 연구에서 관찰 virions의 크기에 ultrastructure는 TMV 입자의 담배 크기의 범위에서 TMV 유발 ultrastructural 특성에 따라 이전에 문학 9-15에보고 된 것으로되었다. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> TMV에 감염된 잎 세포와 virions의 그림 1. 전송 전자 micrographs. A) 이미지 Nicotiana tabacum의 전자 레인지 지원 식물 샘플 준비 후의 TMV에 감염된 mesophyll 잎 세포의 ultrastructure을 보여줍니다. 세포 기질에 축적 된 병렬 정렬 virions의 넓은 지역을 확인합니다.C 전분과 = 엽록체 (ST), M = mitochondrion, N = 핵, V = 액포, 바 = 2μm. B) 이미지가 감염된 잎의 수액에 부정적인 염색법에 의해 감지 된 virions을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. virions의 상대 크기입니다. 길이와 부정적인 착색는 전자 현미경에 나타난 것처럼 감염된 잎의 수액 후 TMV-입자의 폭이 상대적 배포. (길이 / 폭 ± 표준 편차를 의미) 값을 평균 100 virions에서 계산되었다.

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</ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

TEM에 대한 전자 지원 식물 샘플 준비는 몇 시간 3,4,16 내에 신속하고 신뢰할 수있는 ultrastructural 데이터를 제공하기 위해 입증되었습니다. 본 연구에 사용 된 방법으로 달성 세포 소기관과 멤브레인의 미세 구조 보존 샘플 고정의 대규모 감소의 장점과 5,15 기존과 cryofixed 샘플과 비슷했고 약 2 시간에 3 일 이상에서 시간을 삽입. 이것은 문학에서 현재 TEM에 대한 가장 빠른 샘플 준비 프로토콜을 나타냅니다. 본 연구에서 설명하는 방법은 TMV 유발 ultrastructural 변경 및 바이러스 에이전트 자체의 명확하고 신속한 식별 할 수 부정적인 염색 방법과 TEM에 대한 전자 지원 식물 샘플 준비를 결합. TMV 유도 ultrastructural 변경은 전송 elec에 고정의 시작 후 약 4 시간 이내에, 트리밍 sectioning 및 사후 착색 한 후에 조사 할 수TRON 현미경. 완전히 자동으로 표본 준비 모드를 사용하면 바이러스 대리인의 크기와 폭을 결정하기 위해 중간에 제외 착색을 수행 할 연구원을 해제. 따라서, 우리는이 방법은 공장 phytopathology의 농업과 과학 실험 향후 사용하기 위해 매우 중요하다 절반 정도 하루에 식물 바이러스 질환의 명확하고 신속한 진단을 할 수 있다는 결론을 내릴 수 있습니다. 이 방법은 또한 동물과 인간의 질병의 급속한 진단을 위해 사용될 수로 의료 및 수의학 병리의 미래 응용 프로그램에 대한 큰 가능성이 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 글 루타 알데히드 </td><td> 한천 과학 (주) </td><td> R1312 </td><td></td></tr><tr><td> 오스뮴의 tetroxide </td><td> 한천 과학 (주) </td><td> R1022 </td><td></td></tr><tr><td> 한천 100 수지 </td><td> 한천 과학 (주) </td><td> R1043 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecenyl succinic 무수물 </td><td> 한천 과학 (주) </td><td> R1051 </td><td></td></tr><tr><td> 메틸 nadic 무수물 </td><td> 한천 과학 (주) </td><td> R1081 </td><td></td></tr><tr><td> 벤질 dimethylamine </td><td> 한천 과학 (주) </td><td> R1060 </td><td></td></tr><tr><td> 구연산 리드 </td><td> 한천 과학 (주) </td><td> R1210 </td><td></td></tr><tr><td> Uranyl 아세테이트 </td><td> 한천 과학 (주) </td><td> R1260A </td><td></td></tr><tr><td> Phosphotungstic 산 </td><td> 한천 과학 (주) </td><td> R1213 </td><td></td></tr><tr><td> Formvar </td><td> 한천 과학 (주) </td><td> R1202 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Leica EM AMW </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Leica (라이) Ultratrim </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td></td><td> 최근 모델을 사용할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> Leica (라이) Ultracut S </td><td> Leica 마이크로 시스템즈 </td><td></td><td> 최근 모델을 사용할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> Diatome 울트라 45 </td><td> Gröpl </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 필립스 CM10 TEM </td><td> 페이 (구 필립스) </td><td> &lt;/ TD&gt; <td> 최근 모델을 사용할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> 셀 D </td><td> 올림푸스 주식회사 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Optimas 6.5.1 </td><td> 미디어 인공 이식 주식회사 </td><td></td><td> 최신 버전을 사용할 수 있습니다 </td></tr></tbody></table>

전자 레인지 전송 전자 현미경으로 식물 바이러스 질병의 신속한 진단을 도와

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

바이러스에 의해 유도 ultrastructural 변화 조사는 종종 명확 식물 바이러스 질병을 식별 할 수 필요합니다. 전송 전자 현미경 (TEM)에 대한 기존의 샘플 준비 등 조사가 며칠 1,2 걸릴 수 있으므로 식물 바이러스 질환의 급속한 진단에 적합하지 않습니다. 전자 고정이 대폭 통상 샘플 준비 3-5 후 관찰과 유사한 ultrastructural 결과와 TEM 조사를위한 샘플 준비 시간을 단축 할 수 있습니다. 여러 가지 맞춤 제작 전자 장치는 성공적으로 고정 및 TEM 조사 5-8에 대한 생물학적 시료의 삽입을 위해 사용할 수있는 현재 사용할 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 담배 모자이크 바이러스에 설명 (TMV)는 T에 대한 전자 지원 샘플 준비를 사용하여 절반 정도 하루에 잎의 ultrastructural 변경을 진단하는 것이 가능하다는 것을 Nicotiana tabacum의 식물을 감염EM. 그 많은 단계를 수동으로 6-8을 수행해야하므로 더 많은 시간과 노동력이 소요있는 다른 사용 가능한 장치에 대조적으로 거의 완벽하게 자동으로 5 샘플 준비를 수행으로 우리는 상업적으로 이용 가능한 전자 장치와 본 연구를 수행하도록 선택했습니다. 샘플 준비가 나머지 TMV에 감염된 잎과 ultrastructure 및 크기의 다음 시험의 수액에서 바이러스 입자의 완전 자동으로 부정적인 염색법을 수행으로 고정하고 삽입하는 동안 수행 할 수 있습니다.

이 연구는 전송 전자 현미경과 부정적인 착색 방법에 대한 전자 지원 식물 샘플 준비의 조합을 사용하여 절반 정도 하루에 식물 바이러스 질병의 신속하고 명확한 진단을 할 수있는 방법을 설명합니다.

식물에서 바이러스성 질병을 명확하게 식별하기 위해서는 바이러스로 인해 유도된 초미세구조 변화에 대한 조사가 흔히 필요합니다. 전통적인 시료...

본 절차의 전반적인 목표는 투과전자현미경을 통해 수 시간 내에 식물 바이러스 질병을 진단하는 것입니다. 이 절차는 감염된 식물 시료의 마이크로파 보조 고정 및 포매 단계부터 시작됩니다. 다음 단계로 음성 염색법을 통해 식물 샘플에서 바이러스 입자를 추출 및 염색하며, 이어서 포매된 식물 샘플을 절편 제작합니다.그 후 샘플을 투과 전자 현미경으로 관찰하고, 이미지 분석을 통해 바이러스 입자의 크기를 측정합니다. 최종적으로, 투과 전자 현미경법을 통해 전형적인 바이러스 유도 초미세 구조 변화와 바이러스 입자의 크기를 확인할 수 있습니다. 며칠이 소요될 수 있는 상온에서의 기존 고정 및 포매법과 같은 기존 방식에 비해 이 기술의 주요 장점은, 투과 전자 현미경을 위한 샘플 준비 시간을 약 2시간으로 단축하여 약 반나절 만에 바이러스성 질환의 명확한 진단이 가능하다는 점입니다.이 절차의 시연을 위해 저희 실험실의 기술자인 Gerhard Kaba 님과 동료인 Zelnik 교수님이 함께하겠습니다. 시료 준비 프로그램을 시작하기 전, 전자현미경용 자동 마이크로웨이브 조직 처리기 LA A-E-M-A-M-W에 적절한 프로토콜을 설정하십시오. 프로그래밍된 프로토콜에 기술된 고정, 탈수 및 침투의 각 단계에 필요한 용액을 준비하여 지정된 바이알에 채운 후, 프로토콜에 따라 바이알을 캐러셀에 장착하십시오. 캐러셀을 마이크로웨이브 조직 처리기에 삽입하고, 첫 번째 바이알을 모노 모드 챔버에 넣으십시오.다음으로, 실온에서 글루타르알데하이드가 포함된 소렌즈 인산염 완충액 한 방울이 떨어진 모델링 왁스 플레이트 위에서 면도날을 사용하여 담배 모자이크 바이러스(TMV)에 감염된 니코티아나 담배(nicotiana tobacco) 잎의 작은 단면들을 절단합니다. 시료를 채취하고 바스켓에 담는 동안, 시료가 마르지 않도록 항상 고정액으로 덮여 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 미세 핀셋을 사용하여 절단된 단면들을 즉시 약 200 µm 메시 너비의 지정된 바스켓으로 옮깁니다.바스켓을 서로 겹쳐 쌓은 후 모노 모드 챔버에 넣습니다. 고정, 탈수 및 침투를 위해 이전에 프로그래밍된 마이크로파 보조 시료 준비 프로토콜을 시작합니다. 시료 준비 프로토콜이 끝나기 직전에 지정된 중합 몰드에 새로 준비한 agar 100 에폭시 수지를 채웁니다.프로토콜이 완료되면, 침투된 샘플이 담긴 적층 바스켓을 모노 모드 챔버에서 캐러셀의 마지막 바이알로 배출하십시오. 마이크로파 장치에서 캐러셀을 분리하고, 샘플이 담긴 바이알을 캐러셀에서 꺼냅니다. 그런 다음 바이알에서 바스켓을 꺼내고 정밀 핀셋을 사용하여 적층을 해제하십시오.지정된 중합 몰드에 시료를 넣습니다. 그다음, 중합 몰드를 서로 겹쳐 쌓고 마이크로파 조직 처리기의 캐러셀에서 이전에 사용한 바이알을 제거합니다. 겹쳐 쌓은 바스켓을 캐러셀에 올린 후, 캐러셀을 마이크로파 장치에 삽입합니다.이제 이전에 프로그래밍한 중합 프로토콜을 시작하십시오. 프로토콜이 완료되면, 모노 모드 챔버에서 중합 몰드를 꺼내어 분리합니다. 샘플이 포함된 중합 블록을 제거하며, 이제 마이크로톰으로 절편을 만들어 샘플 포함 블록의 절편 제작 절차를 시작할 준비가 되었습니다.초박절편 제작을 위해 하나 이상의 블록을 각각의 시료 홀더에 삽입합니다. 시료가 위를 향하게 하여 홀더 밖으로 약 1cm 정도 돌출되도록 합니다. TEM용 시료 트리머를 사용하여, 가능한 많은 잎 조직이 포함되도록 블록 면의 길이를 최대 1mm, 너비를 200µm 이하로 다듬습니다.초미세절편기(ultra microtome)를 사용하여 절편 두께를 약 70~90 nm로, 절단 속도를 초당 약 1 mm로 설정하십시오. 다이아몬드 칼의 각도를 45도로 설정하여 블록을 절단합니다. Formvar 코팅된 구리 또는 니켈 200 매쉬 그리드로 여러 개의 절편을 수집하고, CO2 없는 환경을 조성하기 위해 NaOH를 부분적으로 채운 페트리 접시에서 리드 시트레이트(lead citrate)로 5분 동안 그리드 위의 절편을 후염색하십시오.그리드를 증류수로 1분 동안 세척합니다. 마지막으로, 그리드를 증류수로 1분 동안 세척한 후, 실온에서 증류수에 녹인 1% uranyl acetate로 15분 동안 후염색하고 그리드 박스에서 자연 건조합니다. 마이크로파 조직 처리기에 의해 샘플 준비가 자동으로 진행되는 동안 나머지 식물 재료의 음성 염색을 수행합니다.먼저, TMV에 감염된 잎 조직 약 100 milligrams를 수확하고, 현미경 슬라이드 위에서 면도날을 이용해 2분 동안 재료를 균질화하여 조(crude) SAP를 준비합니다. 이때 sorens 및 인산 완충액을 사용합니다. 이렇게 얻은 균질액 20 microliters를 테플론 코팅된 현미경의 첫 번째 웰로 옮깁니다.4개 이상의 웰이 있는 슬라이드를 준비합니다. 그 후 form VAR이 코팅된 그리드를 호모게네이트 위에 올리되, form VAR이 코팅된 면이 방울을 향하게 하여 5분 동안 배양합니다. 그리드를 소렌(sorens) 및 인산 완충액 방울 위에 올려놓고 2분 동안 세척합니다.세척 과정을 2분 더 반복합니다. 다음으로, 갓 제조한 phospho tongue stick 산 용액으로 그리드를 1분 동안 반응시킵니다. 1분 후, 그리드를 꺼내어 공기 중에서 건조시킵니다.그리드 박스 내에서 음성 염색된 그리드를 샘플 홀더에 장착하고 투과전자현미경으로 관찰합니다. 마이크로웨이브 조직 처리기에 의해 중합 반응이 자동으로 진행되는 동안, 무작위로 선택된 음성 염색 이온의 이미지를 최소 10장 촬영합니다. 각 이미지에는 최소 10개 이상의 이온이 보여야 합니다.투과전자현미경(TEM)의 1차 배율을 21,000배 이상으로 설정할 때는 모든 이미지의 배율이 동일하도록 주의해야 합니다. 마이크로웨이브 조직 처리기로 자동 처리된 조직 샘플 포함 절편 또한 투과전자현미경으로 관찰합니다. TEM으로 획득한 이미지의 분석은 임의의 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다.입자 분석 도구가 포함된 컴퓨터 소프트웨어. 음성 염색된 시료에서 촬영한 현미경 사진을 통해 무작위로 선택한 최소 100개의 단일 바이러스 입자의 길이와 크기를 측정합니다. 마이크로파 보조 시료 준비 후 음성 염색법과 TEM으로 시각화된 바이러스 입자의 평균 길이와 너비를 구하기 위해 평균 및 표준 편차를 계산합니다.감염된 Nicotiana tobacco 세포의 세포질에서 투과전자현미경을 통해 평행하게 배열된 이온을 포함하는 넓은 영역과 같은 전형적인 TMV 유발 초미세 구조 변화를 관찰할 수 있었습니다. 본 투과전자현미경 사진에서 C는 전분을 포함한 엽록체, St.M은 미토콘드리아, 그리고 nucleus는 핵, V는 액포를 나타냅니다.또한, TMV에 감염된 잎의 조(crude) SAP에서, 음성 염색 후 TMV 입자가 막대 모양의 구조로 관찰될 수 있었습니다. 그림 1B. 이 그래프는 전자 현미경으로 관찰된 100개 TMV 입자의 길이와 너비의 상대적 분포를 보여줍니다. 음성 염색 후, 감염된 잎의 즙액 내 바이러스 입자를 이미지 분석한 결과, TMV의 평균 크기는 길이 280 nanometers, 너비 17 nanometers로 나타났습니다. 이는 뇌 바이러스 질환을 신속하게 진단하기 위한 개발 이후의 결과입니다.이 기술은 동물 및 인체 병리학 분야의 연구자들이 투과 전자 현미경을 통해 동물 및 인체 질병을 신속하게 진단할 수 있는 길을 열어줄 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

식물 세포 사이 Macromolecular 거래는 transiently 관심 찬란 - 태그 단백질을 표현하고 공촛점 현미경하여 내부와 세포 분포를 분석하여 평가하실 수 있습니다.

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바이러스학의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영: 고압 냉동, 동결 치환 샘플의 3D 이미징

학습하세요 전자 레인지 전송 전자 현미경을 이용한 식물 바이러스 질병의 신속한 진단 방법을. 샘플 준비 시간을 약 2시간으로 단축하여 반나절 내에 명확한 진단이 가능하며, 담배 모자이크 바이러스 등 다양한 식물 바이러스를 효율적으로 식별할 수 있습니다.

전자 레인지 전송 전자 현미경으로 식물 바이러스 질병의 신속한 진단을 도와

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