Name: 강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에 /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 학습하세요 후각 감각 뉴런의 단일 축삭 형태를 생체내에서 시각화하는 렌티바이러스 유전자 조작 기법을. 이 방법은 신경과학 연구에서 개별 뉴런의 축삭 궤적과 말단 가지 형태를 상세히 분석할 수 있게 합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 NIH DC052256 DC006015하고, 그리고 QG 및 BS에 T32 - DC008072에 NSF 0,324,769에 의해 지원됩니다.

1. 준비 이 절차는 biosafety 레벨 2 따라서 다음과 같은 모든 준비는 microinjection 절차가 수행되는 생물 학적 후드에 만들어집니다. <ol><li> 준비하고 앞서 열을 가하다 37 ° C 물침 : 물로 플라스틱 저장 가방에 담아 - 비운 가열 블록 인큐베이터에 도장 및 설정합니다. 이 생쥐는 다음과 같은 주사를 복구할 수 있습니다. </li><li> 이 절차에서 모든 폐기물의 침수에 적합한 볼륨 10 % 표백제와 생물 학적 폐기물 컨테이너를 채웁니다. </li><li> 70 % 에탄올의 작은 열 접시와 생물 학적 안전 캐비닛에 소독 ddH2O 장소와 두 번째 접시를 준비합니다. </li><li> 플런저 모든 방법을 꺼내와 70 %의 에탄올과 함께 신체와 바늘을 아래로 분사하여 33 게이지 바늘로 5μL 용량 해밀턴 주사기를 소독. 반복적으로 요리에서 에탄올을 대기음 최소한 5 번 그 모든 방법을 꺼냅니다. </li><li> aspirating 및 꺼내기 멸균 물을 적어도 5 배 주사기 카트리지를 씻어. 문화 후드에 안전하게 따로 주사기를 삽입하고 건조 수 있습니다. </li><li> 얼음 ° C의 냉동고 저장 및 장소 융해 수 있도록 -80에서 바이러스 주식을 제거합니다. Microinjection은 10 9 전염성 단위 / ML의 titre에서 마우스마다 바이러스 주식 2μL 필요합니다. Lentiviruses는 기존 프로토콜 (로이스 외., 2002)에 따르면 실험실에서 상용 소스에서 얻은 또는 생산 수 있습니다. </li><li> 후드의 표면 위에서 제기된 영역을 제공하는 사출 단계를 준비​​ - Kimwipe의 시트로 덮여 10cm 문화 요리를 사용할 수 있습니다. </li><li> 사출 역 근처 알코올 잎사귀 마련. </li></ol> 2. 후각 상피에 lentiviral 입자의 Microinjection 이 방법에서 수행한 모든 동물 절차 IACUC 승인 지침에 따라 수행됩니다. 뮤스 musculus 긴장 C57BL/6J 모든 실험에 사용되는 동물 모델이 여기에 증명합니다. <ol><li> 밖으로 새장의 새끼 마우스 (P0 - P3)을 복용하고 5 분 얼음에 절단 - 열린 장갑에 강아지를 넣어 저체온증으로 마우스 새끼를 마취시키다. </li><li> 강아지가 살균 해밀턴 주사기로 바이러스 재고 완전히 anesthetized, 기음 2μL 수 기다리는 동안. </li><li> 사출 무대 위에 새끼 마우스를 놓습니다. 부드럽게 목의 상단쪽으로 귀의 머리 위로 떨어져 피부를 당기십시오. 이것은 비강을 통해 가르쳐 피부 표면을 제공해야하고 주사를 쉽게합니다. </li><li> 후각 상피를 도달하는 피부 표면 아래 3mm에 대한 비강의 정상을 통해 바늘을 삽입합니다. 왼쪽과 오른쪽 양쪽마다 두 사이트 (마우스마다 총 네 주사 필요한 바이러스 = 2μL)을 선택, 촬영마다 바이러스 솔루션의 0.5μL Microinject. 사출 사이트는 서로 떨어져 비틀 거렸다해야합니다. 적절한 사출 사이트 타겟팅은 후각 망울의 개요에 대한 지느러미 두개골 표면을 검색합니다. 이 줄은 반 투명한 피부와 두개골을 통해 출생시 거의 표시됩니다. 측면마다이 주사를하려면 중간 축에 하나의 전구 개요 단 주동이의 한 주사를 목표로하고 있습니다. 전구 개요에 가로 두 번째 삽입을 만들고, 아직 medially 있도​​록 전구 아래 ventrally있는 후각 상피에 도달할 수있는 주사 각도 있는지 확인하십시오. 후각 망울을 관통하지 마십시오! </li><li> 잔여 바이러스 솔루션이나 Kimwipe를 사용하여 주사 사이트 또는 코에 구멍에서 탈출 수도 혈액을 건조 얼룩. 즉시 희석 액체 표백제 생물 학적 컨테이너에 Kimwipes 처분. </li><li> 물침 인큐베이터에 주입 마우스를 놓습니다. </li><li> 반복은 마우스마다 바이러스 주식 2μL에 대해 필요합니다 기억, 주입하는 모든 마우스에 대해 1-4 단계를 반복합니다. </li><li> 원래 둥지 케이지에게 돌아가기 전에 쥐가 30 분 물침 인큐베이터에서 복구하자. </li><li> 액체 표백제 생물 학적 처리에 microinjection 무대, 살균 잎사귀와 별도의 청소 종이 제품의 폐기. </li><li> 으로 준비 단계에서 수행 반복 열망과 에탄올의 배출 후 물로 해밀턴 주사기를 청소합니다. 주사기가 건조 수 있습니다. </li><li> 최대 전달 효율을위한 4 시간 만에 다시이 절차를 반복합니다. 감염 OSNs 사흘 같은 몇 가지로 세포의 길이에 걸쳐 시각 수 있습니다. </li></ol> 3. 부동 후각 망울 섹션의 Immunohistochemistry <ol><li> 원하는 시점에 주입 마우스를 희생과 재관류는 4 % paraformaldehyde로 조직을 수정. OB를 해부하다. 하룻밤 숙박 후 paraformaldehyde의 PBS에서 30 % 자당을 품어. 드라이 아이스에서 OCT의 포함 매체에 삽입할 수 있습니다. </li><li> 코로나 OB 섹션은 그라 이오 스탯을 사용하여 두께 60μm에서 얻을 수 있습니다. 5mL 1X PBS (산도 7.4)와 10cm 문화 요리에 전구 섹션을 지나간다. 제는 D에 OCT를 허용하도록 PBS에 떠 보관해야합니다issolve. 50mL 원뿔 유리병에 떠있는 섹션과 PBS를 전송합니다. </li><li> 섹션 유리병의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 어떤 부분을 빨아하지 않고 PBS에서 진공. 20mL PBS로 조직 섹션 린스. 정착하고 진공 청소기로 청소하는 단계를 반복합니다. 10mL PBS과 immunostaining을위한 15mL 원뿔 유리병로 전송 부동 섹션 Resuspend 조직. 일단 조직 섹션 조직을 방해하지 않고, PBS 뜨는에서 진공을 해결했습니다. 와 Resuspend 섹션 0.3 % 트리톤 1X PBS, 세제는 세포 세포막을 구멍 수 있도록 산도 7.4 (PBS - TX)에 X - 100. 실온에서 10 분 알을 품다. 두 번 PBS - TX로 뜨는 반복 보육에서 진공. </li><li> 상온에서 두 시간 동안 차단 솔루션의 10mL (PBS - TX의 5 % 목마 ​​혈청)에 조직 섹션을 품어. </li><li> 십오분 상온에서 각각 PBS - TX로 적어도 두 번 차단 솔루션을 씻어. </li><li> PBS - TX에 프라이 머리 항체 솔루션의 2mL를 준비합니다. 시약이 실험에 사용된 항체에 대한 장비 섹션을 참조하십시오. </li><li> 기본 항체 솔루션 초 PBS - TX 차단 세차를 교체하십시오. ° C 24-48시간에 대한 60μm 부동 섹션으로 철저한 침투력을 보장하기 위해 4 천천히 락을 플랫폼 (~ 30rpm)에 품어. </li><li> 부화 후, 기본 항체 솔루션은 4 조심스럽게 피펫을 사용하여 검색하고 저장할 수 있습니다 ° 얼룩 강도의 큰 손실없이 2 주 이내에 두 번 더 최대 재사용을위한 C. </li><li> 이십분 부드러운 회전 (~ 30rpm)로 실온에서 각 섹션에게 PBS - TX에 세 번 씻으십시오. </li><li> PBS - TX에서 이차 항체 희석의 2mL를 준비합니다. 마지막 세척을 진공 및 조직 섹션 차 항체 솔루션을 추가합니다. 형광단의 photobleaching가 발생할 수 있습니다 빛을 차단하기 위해 알루미늄 호일에있는 얼룩의 약병의 바깥쪽을 바꿈. 장소는 4 ° C 하룻밤에 천천히 락을 플랫폼과 부화에 병을 감쌌다. </li><li> 거리 청소에 의해 이차 항체 솔루션을 폐기하십시오. 이십분 상온에서 각각 PBS - TX로 한 섹션을 씻으십시오. 이십분 상온에서 각각 PBS와 함께 두 개의 추가 회 (산도 7.4)을 씻어. Fluoromount G.를 사용하여 유리 슬라이드에 스테인드 조직 섹션 마운트 </li><li> 형광 현미경으로 적극적으로 감염된 OSN의 axons 및 축삭의 테르 미니에 대한 스테인드 섹션을 통해 화면. </li><li> 표시 OSN 축삭 터미널 아버의 3 차원보기를 구성하려면 공촛점 현미경을 사용하여 대상 OB 조직 슬라이스 (Z 축 따라)의 60μm 깊이를 통해 광학 섹션 일련의합니다. </li><li> Z - 섹션 영상이 스택은 이후 전체 터미널 아버 세부 사항을 포함하여 단일 레이블 OSN 축삭의 360 ° 회전 관점을 재구성 함께 예상하실 수 있습니다. 어떤 하나의 회전 각도를 캡처 및 2D 형식으로 프레 젠 테이션을위한 이미지 파일 (예 : JPG, TIFF)로 내보낼 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 방법이 여기에 설명된로, 우리는 생체내에 lentivirus의 후각 감각 뉴런을 transduce 수 있습니다. 우리는 따라서 GFP와 mCherry 형광 기자까지 시각 감염 OSNs뿐만과 immunocytochemistry를 통해 myc - 태그 융합 단백질 있습니다. 이 기술은 감염 OSNs의 풍부를 제공합니다. 그래도, 형질 도입 따라서 단일 세포 형태의 분석을 위해 수 있도록 개별적으로 표시된 OSNs를 제공하기 위해 산발적으로 충분히 발생합니다. Axons 및 축삭 터미널은 공촛점 현미경 (그림 1)에 의해 자신의 기본 환경 가운데 OB 조직 섹션 내에 몇 군데 있습니다. 전체 OSN 축삭 터미널 아버은 일반적으로 40 - 50μm 광 섹션 매료 수 있습니다. 감염 OSN의 축삭 터미널 높은 배율은 사구체 계층에서 axonal 아버 형태의 상세 분석을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> 그림 1. 하나의 후각 감각 뉴런 축삭과 터미널 아버의 탄도.) 후각 신경 층 (ONL)를 보여주는 P7 마우스의 후각 망울의 코로나 섹션 OMP (적색)에 대한 immunostained과 사구체 층 (GL)는 OMP 모두 immunostained 그리고 Vglut2 (회색). GFP (녹색)를 표현하는 하나의 후각 감각 신경 세포의 축삭은 ONL 내의 여행과 사구체 구조로 침투. B) glomerulus 내에 축삭 터미널 아버 형태 명확하게 GFP 표현으로 강조했다. 회색 Vglut2 공동 얼룩은 GFP 양성 축삭은 터미널 에이버을 elaborates하는 시간 전체 glomular 지역을 조명. C) Lentiviral 감염 OSNs는 OE에서 GFP (녹색)를 표현. 후각 상피의 cytostructure는 DAPI의 얼룩 (파란색)과 함께 표시됩니다. GFP 표현은 OE에서 OSN 세포 기관과 세포 프로세스의 시각화 수 있습니다. D) Rap1GAP2 표정으로 OSN의 축삭과 터미널 형태 노크 다운 shRNA로. 아래 마우스 U6업자와 GFP 이하 Rap1GAP2 shRNA와 듀얼 표현 카세트를 들고 LentivirusesCMV 프로 모터는 OE에 적용되었습니다. GFP 전용 제어의 비교 감염 후각 축삭 터미널보다 단순 터미널 아버을 전시. 바 = 20μm.

<ol><li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li>
<li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb%3A+a+long-term+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otol+Rhinol+Laryngol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li>
<li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li>
</ol>

이 프로토콜은 생물 안전 수준이 호환됩니다. 모든 적절한 작업 공간, 개인 보호 및 바이러스성 폐기물 억제 대책이 따라 설립되었습니다. 모든 동물의 절차 IACUC 지침에 따라 수행되었다.

OSN의 게놈의 DNA에 유전자 구조의 영구 양도에 lentivirus 결과의 Microinjection. 이러한 접근 방식은 우리가 overexpression 또는 shRNA의 중재 노크 다운을 통해 후보 유전자의 단기 또는 장기 조작을 수행할 수 있습니다. 또한, 우리는 찬란 odorant 수용체 집단의 공동 현지화을 관찰하기 위해 기존의 유전자 변형 마우스 라인에서 단일 OSNs 레이블을하실 수 있습니다. Microinjection은 OSNs의 lentiviral 도입이 필요합니다. 우리는 어떤 성공도없이 OSNs을 transduce하는 비강에 lentivirus 서스펜션 플러싱 시도했습니다. 따라서 OSN 세포 기관 거짓말 OE의 내부 레이어에 바이러스를 전달하기 위해 지느러미 코의 표면을 통해 microinjections을 수행합니다. adenoviral 기존의 조작을 통해 lentivirus을 사용하는 많은 장점이 있습니다. 아데노 바이러스는 유전자 조작의 제한 t...

Microinjection : 신생아 생쥐는 33 게이지 바늘 (해밀턴 # 7762-06)가 장착되어 5μL 해밀턴 주사기 (해밀턴 # 7647-01)를 사용하여 microinjected되었습니다. Immunocytochemistry의 시약 : 차 항체 : 토끼 polyclonal 항체 GFP (분자 프로브 # A - 6455), OMP에 대한 polyclonal 항체 닭 (사용자 정의) (첸 외, 2005.) VGlut2에 대한 기니피그 polyclonal 항체 (Millipore # AB2251). 차 항체 : Cy2 - 복합 당나귀 안티 - 토끼 (잭슨 Immunolab # 711-225-152), Cy3 - 복합 당나귀 안티 - 닭고기 (잭슨 Immunolab # 703-165-155)와 Cy5 - 복합 염소 안티 기니피그 (잭슨 Immunolab # 106-175-008). 섹션이 50ng/mL DAPI 얼룩 염색질 솔루션 Fluoromount G (남부 바이오 # 0010-01)와 유리 슬라이드에 장착했다. 공촛점 이미징 : Z - 스택 이미지는 올림푸스 Flouview FV1000 공촛점 현미경과 올림푸스 FV10 - ASW 2.01 공촛점 수집 및 분석 소프트웨어를 사용하여 3 차원 투영으로 수집 및 처리 이미지를 사용하여 촬영되었다.

강한 감각 뉴런의 lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에</em

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

정확한 후각 회로의 개발은 후각 망울 (OB)에서 시냅스 대상으로 후각 감각 뉴런 (OSN) axons의 정확한 예측에 의존하고 있습니다. OSN 축삭의 성장과 대상의 분자 메커니즘이 잘 이해되지 않습니다. 조작 유전자 발현 및 단일 OSN의 axons과 터미널 아버 형태의 시각 이후는 지금까지 도전했습니다. 지정된 시간 프레임 내에 단일 세포 수준에서 유전자 기능을 연구하기 위해, 우리는 생체내에 OSNs의 유전자 발현을 조작하는 lentiviral 기반 기술을 개발했습니다. Lentiviral 입자가 후각 상피 (OE)에 microinjection하여 OSNs로 전달됩니다. 표현 카세트는 다음 영구적으로 transduced OSNs의 게놈에 통합됩니다. 그린 형광 단백질 표현이 감염된 OSNs를 식별하고 축삭 터미널 아버 포함한 전체 형태를 설명합니다. microinjection 및 기자 탐지 사이의 짧은 처리 시간으로 인해, 유전자 기능 연구 개발의 아주 좁은 기간 내에 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법을 통해, 우리는 몇 셋처럼 일 이내에 GFP 발현을 감지하고 한 셋처럼 개월 주사를 다음과. 우리는 노크를 다운 lentiviral microinjection하여 중재를 통해 표현과 shRNA를 모두 달성했습니다. 이 방법은 생체내에있는 단일 세포 수준에서 OSN 세포 기관과 axons 자세한 morphologies을 제공하므로 후각 개발하는 동안 후보 유전자 기능의 특성을 허용합니다.

우리는 lentiviral 하나의 후각 감각 신경 세포의 축삭의 유전자 조작과 시각화를위한 기술 및 터미널 arborization을 제시<em&gt; 생체내에</em&gt;.

강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에</em

정밀한 후각 회로의 발달은 후각 감각 뉴런(OSN) 축삭이 ... 내의 시냅스 표적으로 정확하게 투사되는 것에 의존합니다.

신경과학에서 발달 과정을 연구할 때 직면하는 과제 중 하나는 생체 내(in vivo)의 단일 세포 수준에서 수지상 돌기 및 축삭의 형태를 포착하는 것입니다. 후각 시스템에서 후각 신경세포는 코의 후각 상피에서 뇌의 후각구까지 축삭을 뻗습니다. 여러 후각 신경세포가 후각구를 향해 투사함에 따라, 이들은 다발 형태로 묶이게 됩니다.이는 개별 축삭의 경로와 그 말단 형태를 연구하는 것을 어렵게 만듭니다. 본 연구진은 GFP 구축물을 포함하는 렌티바이러스를 미세 주입하여 살아있는 상태에서 단일 후각 sensory 뉴런을 시각화하는 방법을 개발하였습니다.렌티바이러스(lentivirus)를 이용한 성공적인 형질전환은 말단 수지상 돌기를 포함한 후각 감각 축삭의 전체 길이를 시각화합니다. 이 방법은 단일 후각 감각 뉴런을 시각화할 뿐만 아니라, 특정 표적 유전자의 발현을 조절하여 생체 내(in vivo) 환경에서 해당 유전자의 기능을 연구할 수 있게 합니다. 본 렌티바이러스 프로토콜은 생물안전 2등급(biosafety level two) 작업이며, 반드시 층류 후드(laminar flow hood) 내에서 수행되어야 합니다.멸균 환경을 유지하기 위해, 후드 내로 반입하는 모든 물품에 70%ethanol을 분사하십시오. 주입 전, 37 °C 워터베드를 준비하고 최소 20분 동안 예열하십시오. 물을 절반 정도 채운 플라스틱 보관 백을 밀봉하여 빈 가열 블록 인큐베이터 위에 올려두십시오.이를 통해 마우스가 주사 후 회복할 수 있게 합니다. 바이러스에 노출된 모든 물질을 오염 제거하기 위해 생물학적 위험 폐기물 용기에 10% bleach를 채웁니다. 이 절차를 위해 70% ethanol을 담은 작은 개방형 접시와 멸균 증류수가 담긴 두 번째 접시를 준비합니다.층류 정화대(laminar flow hood) 내에서 33 gauge 바늘이 장착된 5 µL 용량의 Hamilton 시린지를 사용하겠습니다. 이 특정 모델은 플런저 챔버 상단에 위치한 장력 다이얼을 돌려 플런저 저항을 조절할 수 있습니다. 이 기능은 바늘과 시린지 챔버를 멸균하는 과정에서 미세 주입 부피를 정밀하게 제어할 수 있게 해줍니다.디쉬에서 에탄올을 여러 번 반복적으로 흡입하고 배출합니다. 멸균수를 여러 번 흡입하고 배출하여 시린지 카트리지를 헹굽니다. 시린지를 플로우 후드 내 안전한 곳에 둡니다.알코올 솜을 주사 스테이션 근처에 배치하십시오. 마우스의 위치 잡기를 용이하게 할 수 있도록 높이가 있는 주사대를 준비합니다. 10 cm 배양 접시를 뒤집어 그 위에 Kim wipes를 덮어 사용할 수 있습니다.마우스 새끼는 이유 시기 전까지 저체온법으로 마취할 수 있습니다. 고무장갑의 손가락 부분을 잘라낸 후 그 안에 마우스 새끼를 넣습니다. 그런 다음 5분 동안 얼음 위에 둡니다.장갑은 얼음과 피부가 직접 접촉하여 발생할 수 있는 동상을 방지합니다. 강아지의 뒷발과 앞발 네 곳을 집어 동물에 반응이 없는지 확인하여 마취가 충분히 되었는지 테스트합니다. 이제 렌티바이러스(lentivirus)를 미세 주입할 준비가 되었습니다. 신생 강아지를 통해 시연하겠습니다.더 고령의 마우스를 사용하는 경우, 두개골 표면을 관통하기 위해 33 gauge 바늘을 더 굵은 gauge 바늘로 교체해야 합니다. 알코올 솜으로 마우스의 코 표면을 닦아 멸균합니다. 냉동 보관 중인 렌티바이러스 스톡을 꺼내 얼음 위에서 해동합니다.우리는 기성 방법을 사용하여 연구실에서 직접 렌티바이러스를 생산했습니다. 이 방법을 개발하면서, 양호한 형질전환 효율을 얻기 위해서는 최소 10⁹ infectious units/mL의 바이러스 타이터가 필요하다는 것을 확인했습니다. 멸균된 Hamilton 시린지로 렌티바이러스 스톡 용액 2 µL를 흡입하십시오.마우스 새끼를 주입 스테이지 위에 놓습니다. 귀 쪽의 머리 위 피부를 잡고 부드럽게 뒤로 당깁니다. 당사의 플로우 후드에는 해부 현미경이 설치되어 있습니다.미세 주입을 정확하게 수행하기 위해, 전뇌의 등쪽 두개골 표면에서 후각구의 윤곽을 찾습니다. 미세 주입 대상 부위는 후각구를 밀접하게 둘러싸고 있어야 하지만, 후각구 자체는 포함되어서는 안 됩니다. 각 새끼 쥐의 후각 상피에 네 군데의 주입을 실시합니다.파란색 점으로 표시된 이 위치들은 바늘을 내측 방향의 각도로 삽입해야 합니다. 초록색 점으로 표시된 추가 2회 주사는 후각구보다 더 내측 및 전측에 엇갈리게 배치됩니다. 이 주사들은 각도를 조절하여 진행할 수 있습니다.바늘 각도 제안은 후각 상피의 복측 위치를 고려하여 이루어졌으며, 후각 상피는 대부분 후각 구 아래에 위치합니다. 따라서 수직 접근은 제한적입니다. 피부 표면에서 약 3mm 아래의 비강 상단을 통해 바늘을 삽입하십시오.후각 상피에 도달하기 위해서입니다. 숙련된 연구자는 비강 내강 공간에 도달했을 때 저항이 감소하는 것을 느껴야 합니다. 이 영역은 피해야 합니다.위치당 0.5 µL의 바이러스 스톡 용액을 미세 주입합니다. 다시 각 측면(좌측 및 우측)에서 두 곳의 지점을 선택하여, 총 네 곳에 0.5 µL씩 주입합니다. 이는 한 번의 주입 세션당 마우스 한 마리당 총 2 µL의 바이러스가 필요함을 의미합니다.다시 한번, 후각구에 주입할 때 주입 부위나 콧구멍 개구부에서 흘러나올 수 있는 잔류 바이러스 용액이나 혈액을 닦아내지 않도록 주의하십시오. 에탄올 솜을 사용하여 닦아낸 후, 솜은 희석된 액체 표백제 용기에 폐기하고, 주입이 완료된 마우스는 즉시 회복을 위해 워터베드 인큐베이터에 놓으십시오. 준비 단계에서 수행했던 멸균 절차를 반복하여 바늘 주사기를 오염 제거하십시오. 주입된 마우스는 워터베드 인큐베이터에서 30분간 회복한 후 원래의 케이지로 돌려보낼 수 있습니다.이 전체 미세주입 과정은 4시간 후에 다시 반복할 수 있습니다. 감염시킬 후각 감각 신경세포의 수를 늘리고자 하는 경우, 감염된 후각 감각 신경세포는 빠르면 3일 만에 세포 전체 길이에 걸쳐 시각화될 수 있습니다. 동물들은 원하는 시점에서 관찰을 위해 희생시키고 관류합니다.형질전환된 단일 세포 후각 감각 뉴런의 궤적과 축삭 말단을 시각화하기 위해, 표준 방법을 사용하여 후각구를 60 micron 두께로 관상면 절단 및 섹셔닝합니다. 이렇게 하면 부유 면역 조직 화학 염색을 준비하는 과정에서 후각구 표면에 경계가 형성된 사구체 구조 내에 시냅스를 형성하는 후각 감각 뉴런의 축삭 다발과 축삭 말단을 포함하여 후각구의 모든 세포층이 섹션에 포함되게 됩니다. 후각구의 연속 절편을 제작하고, 이를 5 milliliters의 인산염 완충 식염수가 담긴 10 centimeter 배양 접시에 한데 모읍니다.부유하는 절편들을 50 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 절편들이 튜브 바닥에 가라앉으면, phosphate buffered saline을 진공 흡입하여 제거합니다. 이때 절편까지 함께 흡입되지 않도록 주의하십시오.각 절편에 10 milliliters의 신선한 완충액을 채워 잔류 고정제나 포매제를 씻어냅니다. 이 재현탁액을 즉시 15 milliliter 원추형 튜브에 피펫으로 옮기되, 떠다니는 모든 절편이 포함되도록 주의하십시오. 세척액을 진공 흡입하여 제거한 후, phosphate buffer saline에 0.3%Triton X 100을 섞은 용액으로 절편을 투과화시키며 로커 플랫폼에서 10분 동안 반응시킵니다. 실온에서 동일한 원추형 튜브를 사용하여 표준 면역 염색 프로토콜을 진행할 수 있으며, 이 크기의 용기에 맞게 진공 흡입 및 로킹 단계를 필요에 따라 반복하고, 염색 및 세척 단계에서는 10 milliliter의 부피를 유지하십시오.다음은 양성으로 형질전환된 후각 신경세포와 일반 후각 신경세포 집단을 공동 염색하는 데 사용하는 항체 목록입니다. 60 µm 두께의 구구(bulb) 절편에 항체가 충분히 침투하도록 하려면 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하는 것을 권장합니다. 세척 단계 또한 각각 20분 이상 수행해야 합니다.붓을 사용하여 각 절편을 슬라이드 글라스 위에 조심스럽게 펴고, 염색액이 첨가된 flora Mount G로 각 슬라이드를 마운팅합니다. 마운팅 매질 내의 모든 기포를 제거하도록 노력하십시오. 이후의 스크리닝 단계를 간소화하기 위해 절편들을 행 단위로 배열하여 마운팅하십시오.면역 염색된 구형(bulb) 절편의 이 층들을 스캔하여 GFP 양성 축삭 섬유와 종말을 찾으십시오. 형광 현미경을 사용하여 감염이 확인된 신경 종말을 공초점 현미경으로 촬영할 수 있습니다. DPI 및 후각 마커 단백질(olfactory marker protein) 채널을 사용하여 관심 영역의 초점 평면을 보정하는 것이 도움이 됩니다.이 결과는 사구체 내의 단일 후각 센서 뉴런 축삭 섬유와 축삭 말단을 보여주며, 여기서 후각 마커 단백질은 적색으로, vlu two로 감염된 후각 센서 뉴런 세포체는 회색으로 표시되었습니다. 만약 해부 및 면역 염색 단계에 이 조직이 포함되었다면, 이들의 수지상 돌기 결절 또한 후각 상피 내에서 시각화될 수 있습니다. 이 공초점 투영 영상은 단일 후각 감각 뉴런의 축삭 연장 경로와 말단 수지상 분지의 매우 상세한 형태학적 구조를 제공합니다. 축삭 섬유가 사구체 표적으로 다시 굽어 들어가는 모습과 사구체 신경망 내에서의 분지 패턴에 대한 세부 사항을 확인할 수 있습니다.렌티바이러스 미세주입법을 이용하면 단일 세포 축삭 및 후각 신경세포의 형태를 시각화할 수 있으며, 유전자 발현을 조절하는 연구가 가능합니다. 렌티바이러스 형질도입은 구성물의 안정적인 게놈 통합을 유도합니다. 렌티바이러스는 시냅스를 통해 인접 세포로 감염되지 않습니다. 시각화는 최소 3일 만에 가능하며, 최소 3개월 동안 유지됨이 확인되었고 아마도 더 오랜 기간 지속될 것입니다.후각 감각 뉴런은 렌티바이러스 용액을 비강 내로 주입하는 방식으로는 쉽게 감염되지 않습니다. 따라서 본 절차에서는 표면을 통한 미세주입이 필요합니다. 이것으로 렌티바이러스 미세주입 절차를 마치겠습니다.이 모든 정보가 귀하의 단일 세포 형태학 연구 성과를 달성하는 데 유용했기를 바랍니다. 좋은 결과 있으시길 바랍니다.

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

유전자 조작의 시간적 및 공간적 해상도는 그들이 교란 수있는 생물 학적 현상의 스펙트럼을 결정합니다. 여기 temporally과 공간 개별...

결합을 사용하여 타겟팅 후각 망울의 뉴런 VIVO에서 Electroporation 및 Gal4 기반 향상제 트랩 Zebrafish 라인

후각 망울의 성인에서 태어난 뉴런은 optogenetically Channelrhodopsin2 - 표현 이식 미니어처와 함께 주동이의 철새 스트림과 만성 photostimulation에서 lentiviral 주사를 LED를 사용하여 조절할 수 있습니다.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

출처: Kozin, E. D., et.al. 청각 경로의 광유전학적 자극을 위한 쥐 등쪽 달팽이관 핵의 직접 시각화. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 빛 유도 청각 자극을 가능하게 하기 위해 마우스 등쪽 달팽이관 핵(DCN)으로의 바이러스 매개 유전자 전달을 보여줍니다. 빛에 민감한 이온 채널인 옵신을 암호화하는 바이러스 벡터는 직접 접근을 위해 개두술 및 소뇌 흡인 후 DCN에 주입됩니다. 발현된 옵신은 뉴런이 빛에 의해 활성화될 수 있도록 하여 광유전학을 사용하여 청각 경로 반응을 연구하기 위한 모델을 제공합니다.

빛 유도 청각 자극을 위한 마우스 등쪽 달팽이관 핵으로의 바이러스 매개 유전자 전달

바이러스 성 벡터는 타겟 유전자 조작을 위해 수 있습니다. 우리는 등쪽 뿔에 바이러스 벡터의 stereotaxic 주입, 기본 somatosensory afferents 및 중추 신경계의 뉴런 사이의 시냅스 접촉의 눈에 잘 띄는 사이트를 사용하여 조건부 유전자 발현 또는 마우스 척추 절제하는 방법을 보여줍니다.

마우스 척추 조건부 유전자 조작을위한 바이러스 성 벡터의 Stereotaxic 주입

우리는 뉴런 형태와 시간 경과에 따른 발달을 시각화하기 위해 전기천공법과 후속 컨포칼 레이저 스캐닝 또는 다광자 현미경에 의한 후각 감각 뉴런의 생체 내 라벨링 프로토콜을 설명합니다.

모델로 후각 시스템은 축삭 성장 패턴 및 형태를 연구하는 생체

여기에서는 신경 줄기세포에 대한 세포 자율 및 비자율적, 틈새 의존적 효과를 별도로 분석할 수 있는 성인 심실-심실하 신경인성 틈새에서 신경 줄기 세포 및/또는 인접한 뇌실막 세포의 장기 유전자 변형을 위한 렌티바이러스 입자의 사용을 기반으로 하는 절차를 설명합니다.

신경의 분석을위한 성인 마우스 V-SVZ에서 세포의 안정적이고 효율적인 유전자 변형 줄기 세포 자율 및 비 자치 효과

Intraspinal 주입 recombinase 종속 재조합 형 adeno 관련 바이러스 (rAAV)의 척수에서 모든 유전자 이라는 셀 형식을 조작 하 사용할 수 있습니다. 여기 우리가 transduce 요 추 척수의 등 쪽 뿔에 신경 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조작된 신경 하위의 기능 심문 수 있습니다.

척수의 유전으로 정의 된 신경에 있는 Adeno 관련 바이러스 중재 Transgene 식

현재 프로토콜은 해마에 복부 테진 영역 (VTA) 글루타민트 프로젝션을 추적하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 VTA 글루타민단 단자가 생체 내에서 CA1 퍼티티 피라미드 발사 속도를 조절하는 방법을 보여주기 위해 CA1 레코딩과 결합되었습니다.

해마의 생체 내 해부학 및 기능적 추적

여기서 우리는 급성 설치류 뇌 조각에서 시냅스 특이적 전기생리학적 특성을 허용하기 위해 광유전학적 구조를 가진 분리된 뇌 영역의 바이러스 형질도입을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

생체 외 내측 전두엽 피질에서 외측 내후각 피질까지의 장거리 시냅스 전달 및 가소성에 대한 광유전학적 심문

여기에서는 초파리 청소년 뇌에서 더듬이엽 시냅스 사구체의 후각 경험 의존적 리모델링을 유도하고 분석하는 방법을 설명합니다.

Experience-Dependent Remodeling of Juvenile Brain Olfactory Sensory Neuron Synaptic Connectivity in an Early-Life Critical Period(어린 뇌 후각 감각 뉴런 시냅스 연결성의 경험 의존적 리모델링)

학습하세요 후각 감각 뉴런의 단일 축삭 형태를 생체내에서 시각화하는 렌티바이러스 유전자 조작 기법을. 이 방법은 신경과학 연구에서 개별 뉴런의 축삭 궤적과 말단 가지 형태를 상세히 분석할 수 있게 합니다.

강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에

더 많은 동영상 탐색