2011년 5월 22일
우리는 lentiviral 하나의 후각 감각 신경 세포의 축삭의 유전자 조작과 시각화를위한 기술 및 터미널 arborization을 제시 생체내에.
신경과학에서 발달을 연구하는 과제 중 하나는 생체 내 단일 세포 수준에서 수지상 수지상 및 축삭 형태를 포착하는 것입니다. 후각 시스템에서 후각 감각 뉴런은 코의 후각 상피에서 뇌의 후각구까지 축삭을 확장합니다. 여러 개의 후각 감각 뉴런이 후각구를 향해 돌출할 때, 그들은 다발로 매혹됩니다.
이것은 개별 축삭 궤적과 말단 형태에 대한 연구를 복잡하게 만듭니다. 우리는 A GFP 구조체를 마이크로 주입하여 생체 내에서 단일 후각 감각 뉴런을 시각화하는 방법을 개발했습니다. 렌티바이러스 보유.
렌티바이러스를 이용한 성공적인 형질도입은 말단 가지를 포함한 전체 후각 감각 축삭 길이를 조명합니다. 단일 후각 감각 뉴런을 시각화하는 것 외에도 이 방법을 사용하면 특정 관심 유전자의 유전자 발현을 조작하여 생체 내 맥락에서 해당 기능을 연구할 수 있습니다. 이 렌티바이러스 절차는 생물 안전성 레벨 2이며 층류 후드에서 수행해야 합니다.
멸균 환경을 유지하려면 후드에 삽입된 모든 항목에 70% 에탄올을 스프레이하고 37도 수침대를 최소 20분 동안 준비하고 예열하십시오. 주사 전에. 물이 반쯤 찬 플라스틱 보관 가방을 밀봉하고 빈 가열 블록 인큐베이터에 놓습니다.
이렇게 하면 마우스가 주입 후 회복할 수 있습니다. 생물학적 위험 폐기물 용기에 10% 표백제를 채워 바이러스에 노출된 모든 물질의 오염을 제거합니다. 이 절차에서 70 % 에탄올의 작은 열린 접시와 멸균 증류수가 담긴 두 번째 접시를 준비합니다.
층류 후드에서는 33게이지 바늘이 있는 5마이크로리터 용량의 Hamilton 주사기를 사용할 것입니다. 이 특정 모델을 사용하면 플런저 챔버 상단에 있는 장력 다이얼을 돌려 플런저 저항을 조정할 수 있습니다. 이 기능은 바늘과 주사기 챔버를 멸균하기 위한 미세 주입 부피 제어 기능을 제공합니다.
접시에서 에탄올을 여러 번 흡인하고 배출하기를 반복하십시오. 멸균수를 여러 번 흡입하고 배출하여 주사기 카트리지를 헹굽니다. 주사기를 플로우 후드에 안전하게 옆에 놓습니다.
주사 스테이션 근처에 알코올 물티슈를 배치하십시오. 마우스의 위치를 쉽게 잡을 수 있도록 돌출된 표면을 제공하는 주입 단계를 준비합니다. 김씨 물티슈로 덮인 거꾸로 된 10cm 배양 접시를 사용할 수 있습니다.
새끼 쥐는 젖을 뗄 때까지 저체온증으로 마취될 수 있습니다. 고무 장갑의 손가락을 잘라내고 마우스 강아지를 손가락 절단에 넣습니다. 그런 다음 얼음 위에 5분 동안 놓습니다.
장갑은 강아지의 뒷다리와 네 발을 꼬집어 동물이 반응하지 않는지 확인하여 철저한 마취를 위한 얼음 테스트와 직접적인 피부 접촉으로 인해 발생할 수 있는 피부 화상을 방지합니다. 이제 렌티바이러스의 미량 주사를 맞을 준비가 되었습니다. 우리는 신생아 강아지와 함께 시연을 할 것입니다.
더 오래된 마우스의 경우 두개골 표면을 관통하기 위해 더 두꺼운 게이지 바늘 대신 33 게이지 바늘로 대체해야 합니다. 알코올 패드로 마우스의 코 표면을 닦아 소독합니다. 냉동실 보관에서 렌티바이러스 육수를 제거하고 얼음에서 해동합니다.
우리는 확립된 방법을 사용하여 실험실에서 직접 렌티바이러스를 생산했습니다. 이 방법을 개발하면서 우리는 우수한 transduction rate를 위해서는 mil당 10에서 9번째 감염 단위의 최소 바이러스 역가가 필요하다는 것을 발견했습니다. 2마이크로리터의 렌티바이러스 스톡 용액을 멸균된 Hamilton 주사기에 흡입합니다.
주입 단계 위에 마우스 강아지를 놓습니다. 머리 윗부분의 귀 쪽 피부를 잡고 부드럽게 뒤로 당깁니다. 우리는 플로우 후드에 해부 스코프를 장착했습니다.
마이크로 주사를 정확하게 지시하려면 전뇌의 등쪽 두개골 표면을 검색하여 후각구의 윤곽을 찾으십시오. 우리의 마이크로 주입 타겟은 후각 전구를 밀접하게 둘러싸고 있지만 전구 자체를 포함해서는 안 됩니다. 우리는 각 강아지의 후각 상피에 4번의 주사를 놓습니다.
파란색 점으로 표시되는 이러한 위치는 바늘이 중앙으로 향하는 각도로 삽입되어야 합니다. 녹색 점으로 표시된 추가 두 개의 주사는 비틀 거리며 후각 전구의 내측과 앞쪽에 있습니다. 이러한 주사는 비스듬히 기울어질 수 있습니다.
바늘 각도 제안은 대부분 후각구 아래에 위치한 후각 상피의 복부 위치를 고려하여 이루어집니다. 따라서 수직 접근이 제한됩니다. 피부 표면에서 약 3mm 아래 비강 상단을 통해 바늘을 삽입합니다.
후각 상피에 도달하기 위해. 훈련된 손은 비강 내강 공간에 도달했을 때 저항이 떨어지는 것을 느껴야 합니다. 이 영역은 피해야 합니다.
위치당 0.5마이크로리터의 바이러스 원액을 마이크로로 주입합니다. 다시 말하지만, 왼쪽과 오른쪽 양쪽의 두 부위를 선택하면 총 0.5 마이크로 리터의 4 회 주입. 각 마우스는 단일 주입 세션에서 마우스당 2마이크로리터의 바이러스가 필요하다는 것을 의미합니다.
다시 말하지만, 주사 부위나 콧구멍 구멍에서 빠져나갈 수 있는 잔류 바이러스 용액이나 혈액을 후각구에 주입하거나 건조시키지 않도록 주의하십시오. 에탄올 물티슈를 사용하여 희석된 액체 표백 용기에 물티슈를 버리고 즉시 주입된 마우스를 물침대 인큐베이터에 올려 회수합니다. 준비 중에 수행된 멸균 절차를 반복하여 바늘 주사기의 오염 제거 주입된 마우스는 물침대 인큐베이터에서 회수 30분 후 케이지로 되돌릴 수 있습니다.
이 전체 미세주입은 4시간 내에 다시 반복할 수 있습니다. 감염될 후각 감각 뉴런의 수를 늘리고 싶다면, 감염된 후각 감각 뉴런을 3일 이내에 세포 전체에 걸쳐 시각화할 수 있습니다. 동물들은 원하는 시점에서 관찰을 위해 희생되고 관류되었습니다.
표준 방법을 사용하여 형질도입된 단세포 후각 감각 뉴런 궤적과 축삭 말단을 시각화하기 위해 60미크론 두께로 후각구 관상을 해부하고 절단합니다. 따라서 이 섹션에는 후각 감각 뉴런 축삭 다발과 축삭 말단을 포함한 후각구의 모든 세포층이 포함되며, 이는 부유 면역조직화학을 준비하기 위해 전구 표면에 결합된 사구체 구조에서 시냅스를 형성합니다. 후각구의 연속적인 절편들이 만들어지고 5밀리리터의 인산염 완충 식염수가 들어 있는 10cm 배양 접시에 집합적으로 쓸어냅니다.
떠 있는 부분을 50ml 원뿔형 바이알로 옮깁니다. 단면이 바이알 바닥에 가라앉으면 인산염 완충 식염수를 진공 청소기로 제거합니다. 진공 청소기로 청소하지 않도록 주의하십시오.
섹션에는 10ml의 새 버퍼가 보충되어 잔류 고정액 또는 포착 물질이 씻겨 나옵니다. 이 재부유액을 즉시 15ml 원뿔형 바이알에 피펫으로 주입하고, 모든 떠 있는 부분을 포착하고, 헹굼 용액을 진공 청소기로 청소하고, 0.3% Triton X 100 용액으로 섹션을 천공하고 로커 플랫폼의 로커 플랫폼에 10분 동안 놓습니다. 그런 다음 실온에서 동일한 원뿔형 바이알에서 표준 면역 염색 프로토콜을 진행하여 이 크기의 용기에 필요한 진공 및 로커 단계를 반복하고 염색 및 헹굼 단계를 위해 10ml의 부피를 유지할 수 있습니다.
다음은 양성으로 transducted 후각 감각 뉴런과 일반적인 후각 감각 뉴런 집단을 염색하기 위해 사용하는 항체 목록입니다. 60미크론 전구 부분의 완전한 항체 침투를 위해서는 섭씨 4도에서 밤새 배양하는 것이 좋습니다. 세척 깊이도 각각 20분 이상이어야 합니다.
페인트 브러시로 유리 슬라이드의 각 섹션을 부드럽게 펴고 염색질 염색 용액이 보충된 식물 마운트 G로 각 슬라이드를 장착합니다. 장착 매체에서 모든 기포를 제거하도록 노력하십시오. 후속 스크리닝 단계를 단순화하기 위해 섹션을 행으로 장착하십시오.
면역 염색 전구 섹션의 이러한 층을 스캔하여 GFP 양성 축삭 섬유와 말단을 찾습니다. 형광 현미경을 사용하여 양성 감염된 신경 말단을 컨포칼 현미경으로 이미지화할 수 있습니다. DPI 및 후각 마커 단백질 채널을 사용하여 관심 영역의 초점면을 보정하는 것이 도움이 됩니다.
이러한 결과는 사구체 내의 단일 후각 센서 뉴런 뉴런 섬유 및 축삭 말단을 보여주며, 이는 회색에 감염된 후각 센서 뉴런 세포체에 빨간색의 후각 마커 단백질과 vlu 2가 있는 CO이며, 이 조직이 해부 및 면역 염색 단계에 포함된 경우 후각 상피 내에서도 이들의 수상돌기 손잡이를 시각화할 수 있습니다. 안녕하세요, 제 컨포칼 투영은 단일 후각 감각 뉴런 축삭 확장 경로와 말단 아버의 매우 상세한 형태를 제공합니다. 축삭 섬유가 사구체 표적을 향해 다시 연결되는 것을 볼 수 있을 뿐만 아니라 사구체 신경 알약 내에서 분기 패턴의 세부 사항을 볼 수 있습니다.
렌티바이러스 미세주입 방법은 단세포 축삭돌기, 후각 감각 뉴런의 형태를 시각화할 수 있으며 유전자 발현을 조작하는 연구를 가능하게 하며, 렌티바이러스 형질도입은 구조의 안정적인 게놈 통합을 가능하게 합니다. 렌티바이러스는 주변 세포를 시냅스적으로 트랜스 감염시키지 않습니다. 시각화는 최소 3일 이내에 달성할 수 있으며 최소 3개월 동안 지속되는 것으로 확인되었으며 더 오랜 기간 동안 지속될 가능성이 있습니다.
후각 감각 뉴런은 렌티바이러스 용액의 비강 주입에 쉽게 감염되지 않습니다. 따라서 이 절차에서는 표면을 통한 미세 주입이 필요합니다. 이것이 바로 렌티바이러스 미량주입 절차입니다.
이 모든 정보가 당신 자신의 행복한 사냥의 단세포 형태학을 달성하는 데 유용하기를 바랍니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
이 연구는 단일 후각 감각 뉴런의 축삭과 그 종단 분지의 유전적 조작 및 생체 내 시각화를 위한 새로운 렌티바이러스 기술을 제시합니다. 이 방법은 복잡한 후각 시스템 내에서 개별 축삭 경로를 연구하는 데 있는 도전 과제를 해결합니다.
Precise genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neurons in vivo enables direct interrogation of gene function during neural circuit development. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for neurodevelopmental pathways, informing early-stage portfolio decisions. The method's temporal control and single-cell resolution provide predictive confidence for translational neuroscience programs.
This lentiviral microinjection method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging genetic target validation and phenotypic screening in neural systems.