Name: 성인의 준비 Drosophila 눈 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 학습하세요 성인 Drosophila 눈의 반투명 섹셔닝 및 현미경 분석을 위한 표본 제작 방법을. 에폭시 수지에 포매하고 다이아몬드 나이프로 미세 절단하여 돌연변이 눈 표현형과 유전자 상호작용을 정량화할 수 있습니다.

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나는 그림에서 사진 박사 제니퍼 컬티스 감사하고 싶습니다. 1 제레미 페이건와 비판적 원고를 읽기위한 박사 피렌체 말로. 우리 작품은 NIH 부여 1R01GM088202에 의해 지원됩니다.

1. 머리를 절개를 플라이 <ol><li> 당신은 (젤라틴 코팅 슬라이드 포함) 핸드에있는 모든 자료를 가지고 있는지 확인하십시오. 글루 타 알데히드와 오스뮴의 fixatives (아래 참조) 준비합니다. 얼음 1.5 ML 튜브에서 나누어지는 200μl 글루 타 알데히드 해결책을 포함하는 유전자형 당. </li><li> CO 2 패드 (우리는 보통 머리가 절차를 수행하는 동안 파괴하는 경우에 유전자형 최대 6를 포함 일곱 플라이 머리를 해부하다)에 파리를 마취. </li><li> 잡고 약간 핀셋과 함께, 최대 비행, 등의 측면의 흉부를 눌러 머리를 잘라하는 날카로운 메스를 사용합니다. </li><li> 핀셋으로 목을 만져 파리 머리를 고정하고 조심스럽게 눈 하나의 작은 부분을 슬라이스. 이것은 정착액의 침투를 (여러분이 clonal 분석을 위해 눈 섹션을 사용하려는 경우에는 이하 클론로 눈을 컷) 높여줍니다. 감동 나중에 sectioned 될 그대로 눈에 손상을 피한다. </li><li> 눈에서 절단 표면에 핀셋이나 메스로 머리를 만지 (정착액 위에 떠 자주 머리) 얼음 글루 타 알데히드 / 인산염 정착액에 머리를 전송 해부 머리가 이상에 대한 글루 타 알데히드 수정에 보관하지 말아야 오스뮴의 추가하기 전에 십오분 이상. 동일한 유전자형의 다른 파리와 같이 1.2-1.5를 반복합니다. </li></ol> 2. 고정 및 삽입 (모든 단계 장갑을 사용!) <ol><li> 10,000 RPM에서 1 분 Eppendorf의 원심 분리기에서 flyheads를 스핀. 머리 싱크대하지 않은 경우에도 계속합니다. </li><li> 오소 네 솔루션의 200μl를 추가하고 적어도 30 분 얼음에 1 시간 동안 수정. </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 글루 타 알데히드 / 오스뮴 솔루션 (적절한 폐기물 처리 절차를 사용해야합니다!) 제거하고 200μl 오스뮴 솔루션으로 대체합니다. 1-6 시간을위한 얼음에 품어. 항상 머리가 완전히 액체 덮여되도록하고 머리 또는 눈을 붕괴 수로 솔루션을 모두 제거 절대! </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여, 정착액 폐기 (에탄올 지금 오스뮴가 포함되어 있으므로 적절한 폐기물 처리 절차를 사용해야합니다!) 얼음에 적어도 5 분 동안 0.5 - 1ml 30 % 에탄올과 부화를 추가합니다. </li><li> 50 %, 70 %, (80 %), 90 % 및 두 번 100 % 에탄올로 위의 단계를 반복합니다. 전자 현미경 분석을 위해 눈을 사용하는 경우 80 % 에탄올 단계를 포함합니다. 70 % 세척 단계 후, 샘플은 얼음에서 제거할 수 있습니다. </li><li> 프로필렌 산화물 (휘발성, 후드에서 계속 작동)의 동일한 볼륨으로 에탄올을 대체합니다. 실온에서 10 분 알을 품다. </li><li> 프로필렌 산화물 세척을 반복합니다. 프로필렌 산화물의 증발로 인해 눈이 중첩 피하기 위해 병렬로 여러 genotypes를 처리하는 경우 일괄 처리 작업. </li><li> , 프로필렌 산화물의 대부분 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 제거를 1:1 수지 500μl에 대한 추가 프로필렌 산화물 솔루션입니다. 실온에서 하룻밤 평형. </li></ol> 3. 금형에 삽입하고 배치 <ol><li> 모든 금형가 다른 genotypes를 추적하기 위해 표시되었는지 확인 후, 100 % 수지와 금형을 입력합니다. 너무 많이 넣다가 (금형의 표면 위에 아니오 '하이 힐스'똑바로 금형 표면에 걸쳐보고)하지 마십시오. EM 분석을위한 하드 수지를 사용하십시오. </li><li> 전송 피펫을 사용하면, 머리에서 50 %의 수지를 제거 100 % 수지로 대체하고, 실온에서 3-4시간을위한 부화. 머리가 수지로 가득 차 있으므로, 그들은 튜브의 바닥에 싱크 것입니다. </li><li> 작은 갈고리를 만들 수 번 하드 표면에 공격을 받았습니다 이쑤시개를 사용하여 주형으로 한 번에 하나의 머리를 전송합니다. </li><li> 수지 유출 대조를 보호하기 위해 귀하의 해부 범위의 작업 영역을 플레이스 알루미늄 호일. </li><li> 해부 바늘을 사용하여 수지의 머리 약간 범위, 소용돌이 불구하고보고 신중하게 가까운 지적 끝에 금형의 하단으로 이동합니다. </li><li> 조심스럽게 눈 접선 표면이 약 절반 머리 계속해야하고, 금형의 전면 벽에있는 그대로 (!) 눈 (또는 교차 섹션을 원한다면 당신의 미래 sectioning 비행기) 목의 표면을 아래로 정렬 멀리 금형 벽에서 직경. 드문 경우에, 눈 표면과 머리 표피 사이의 빈 공간으로 볼 수있는 눈 붕괴. 당신이 붕괴 눈이있다면, 7 일 여분의 눈으로 그것을 대체합니다. </li><li> 모든 머리로 반복합니다. 일단 모든 정렬을 끝내고, 당신이 수지의 바늘을 제거하면 그들의 행동하지 않는지 확인하려고 모든 눈을 다시 확인합니다. </li><li> 당신이 해부 바늘을 제거할 때 눈에 이동에 문제가있을 경우, 원하는대로 눈을 위치를 신속하게 약간 떨어져 머리에서 바늘을 접어야 다음 천천히 완전히 바늘을 제거합니다. </li><li> 70 밤새 금형을 구워 ° C. </li></ol> 4. 트리밍과 sectioning <ol><li> K, 금형을 절곡하여 금형에서 강화된 블록을 제거합니다블록에 해당하는 eeping 추적하는 유전자형 (작은 섬광 튜브 안에 저장 예). </li><li> 트리밍 들어, 플렉시 또는 알루미늄 블록에 얼굴을 탑재하여 마이크로톰에 맞는 척을 사용합니다. 척에서 트리밍하는 블록 최대 눈을 탑재합니다. </li><li> 테플론 코팅 면도기를 사용하여 절개 범위가 베이드에서 신중하게 차단만을 상위 레이어를 잘라. 이것은 '눈'을 볼 수 있으므로 sectioning의 미래 비행기를 예측할 수있는지만 깨끗한 표면을 떠날 것입니다. 손가락을 절단하지 마십시오! </li><li> 머리 주위의 플라스틱의 대부분은 잘라 때까지 (눈을 정렬 때 금형의 상단이었던 예) 머리의 양쪽과 전면에 여분의 플라스틱을 잘라. 천천히 플라스틱의 여러 얇은 레이어를 잘라하여 머리를 접근하는 것이 좋습니다. </li><li> 깨끗한 면도날을 사용하여 신중하게 나중에 섹션 (보통 tangentially 눈에, 원래 금형 표면에 약간의 각도)하고자하는 정확한 비행기의 눈 위로부터 얇은 레이어를 제거합니다. </li><li> 방금 눈 바깥 표면을 떼어 버리기 시작 전까지 계속합니다. 당신이 마이크로톰 쉽게에 정렬하게 빛나는 투명한 표면을 얻기 위해 블레이드의 깨끗한 영역을 사용했는지 확인하십시오. </li><li> 면도날에 저장하려면 블록의 양쪽 주변 트리밍 원유에 대한 기존의 블레이드를 사용하여 고급 (첫 번째 절단 및 4.6) 트리밍을위한 새로운 블레이드를 사용합니다. 결국 당신은 미래의 섹션 비행기에 해당하는 약간 기울어져, 컷 - 오프 최고로 세 일방적인 피라미드됩니다. </li><li> 마이크로톰에서 블록을 탑재합니다. 실제 sectioning는 마이크로톰의 유형에 따라 다를 수 있으며 여기에 자세히 설명되지 않습니다. 우리는 0.5 1μm 섹션을 절단하기 위해 조직을 품질 다이아몬드 나이프로 Sorvall MT5000을 사용합니다. 가벼운 현미경 분석을 위해, 섹션 두께에 약간의 차이가 중요하지 않습니다. sectioning 클론은 화이트 + transgene 섹션으로 표시된 경우에는 1μm 섹션은 섹션 당 rhabdomeres (그림 2)에 인접한만큼 안료 과립을 가지고 있도록합니다. </li><li> 섹션 물 위에 떠 있습니다. 회전 운동에서 수면 아래에서 목조 Q - 팁의 평평 엔드와 첫번째 20-30 섹션을 허용하고 젤라틴 코팅 유리 슬라이드 (약 100 ° C에서 가열 접시에 보관에 물 한 방울로 그들을 전송 ). </li><li> 또 20-30 섹션과 반복합니다. 물이 증발하고 섹션을 슬라이드에 집중 때까지 기다리십시오. 보통 3 눈 부분 한 슬라이드에 잘 맞지 타운쉽 행에 의해 3 개 항목 (세명 눈) (상단 / 하단 부분)에 배치. </li></ol> 5. 얼룩과 미세 분석 <ol><li> 않는 sectioning 클론, 얼룩 섹션. 90에서 설정 난방 블록에 대한 섹션 플레이스 슬라이드 ° C. 슬라이드에 0.22μm 필터에 부착된 30 ML의 주사기에서 Toluidine - 푸른 얼룩 솔루션을 분배하고 10 초 동안 얼룩. 즉시 증류수를 폭 린스. 공기가 건조. </li><li> 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 슬라이드에 미디어를 장착 DPX 3 방울을 배포하고 coverslip로 커버. 3 천과 위로와 장착 매체 강화를 (룸 온도 예 : 하루)하자. </li><li> 가벼운 현미경 이미지. 좋은 섹션을 찾은 후 상세한 분석과 사진 촬영을위한 63x 기름 침지 렌즈로 전환하는 5 배 또는 10 배 렌즈를 사용합니다. 우리는 일반적으로 위상 대비 설정을 사용하지만, darkfield 광학은 잘 작동합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 : 가장 자주, 눈이 유전 화면의 일부로 또는 일반 눈 구조 또는 극성 중 하나에 영향을 미칠 것으로 알려진 유전자와 유전자 상호 작용을 테스트 과정에서 발견 외부 거친 아이 phenotypes에 대한 자세한 분석을 위해 플라스틱에 포함됩니다. 안과 섹션의 전형적인 결과는 그림 3에 표시됩니다. 야생 형 ommatidia (그림 3A)는 안료 세포의 격자에 둘러싸인 전체 photoreceptor의 보완을 보여줍니다. 반대로, 사시 (stbm, 일명 반 - 고흐 7) 돌연변이에 ommatidial 극성이 전체 photoreceptor의 보완이 존재하더라도, 분실 있으며, 회전과 chirality가 무작위 (그림 3B)입니다. 또한, sectioned stbm allele이 아에 이후 - 배경, 안료 과립은 그림 누락되었습니다. 3B. 그림 3C는 clonal 분석의 예제를 보여줍니다. Drosophila Rho 키나 아제 (drok)가 ommatidial 회전뿐만 아니라 눈 8 구조적 무결성을 위해 필요합니다. 야생에서 돌연변이 - Homozygous drok이 클론은 안료 세포와 rhabdomeres (일반적으로 안료의 부재에 의해 확인할 수 있습니다, 클론은 눈이없는 - FLP와 배경 w를 보완 강하게 표현 흰색 마커 유전자와 P - 요소를 사용 유도 아르 - 유형 및 heterozygous 조직). 그것은 안료 그들의 부족에 의해 돌연변이 영역을 식별할 수 있으므로이 가능합니다. R - CE의 착색의 휴대 자치으로 인해힘들 일찍, 개별 R - 세포의 genotypes합니다 (그림. 3C에서 화살촉 참조) 확인할 수 언급했다. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. Drosophila의 눈으로부터 생물학을위한 훌륭한 모델 시스템입니다, 야생 타입 눈 (A)의 매끄러운 표면에 대조적으로, 돌연변이 눈 표면은 외부 자주, (B) 거친 기본 안구 phenotypes을 나타내는 것입니다 . 모든 수치에서 앞의은 왼쪽이고 지느러미가있다. 박사 제니퍼 컬티스, NMSU, 라스 크루 시스, NM, 미국의 이미지 커터. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 설명한 방법을 사용 sectioned 단일 ommatidia의 빛 현미경 이미지. 맥도널드 R - 세포가 R8 위에 R7 자리잡고 있기 때문에, ommatidium마다 한 번에 볼 수 있습니다. (A는 A ') (R7 수준에서 R7의 세포 시체는 R1 및 R6에 노란색 화살표) 사이의 감지. 반면, R8 수준 (B)에서, R8의 세포 시체는 R1 및 R2 (B에 노란색 화살표 ') 사이에 감지됩니다. 블루 화살촉은 셀 자율 안료 마커로 사용할 수있는 안료 과립을 표시합니다. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 야생 - 타입 (A), stbm (B)와 drok (C) 돌연변이 성인 Drosophila의 눈을 통해 접선 섹션. 섹션 아래의 설계도는 ommatidia의 극성 (화살표위한 (A) 참조) 나타냅니다. 동그라미 photoreceptor의 보완에 결함이 ommatidia을 나타냅니다. 노란색 라인은 대칭의 지느러미 / 복부 라인 (적도)를 나타냅니다. (A) 야생 타입의 잘 지향 ommatidia 대조적으로, 평면 조직은 stbm 돌연변이 (B)에서 손실됩니다. 돌연변이 배경 - stbm 돌연변이의 섹션 표시 참고는 w에 의한 색소 부족합니다. drok의 변이가 있기 때문에 치명적인 (C), 그들은 클론으로 분석해야합니다. R - 세포 부족 색소 (오픈 파란색 화살촉)는 ​​homozygous 돌연변이있는 동안 따라서, 색소 세포는 (가득 푸른 화살촉) 야생 입력하거나 heterozygous 있습니다. 회전 결함 이외에 drok의 돌연변이도 R - 세포 없거나 초과 번호 포함 구조적 결함을 보여줍니다. clonal 분석, 섹션은 안료 과립을 왜곡하지 않도록 스테인드되지 않습니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

모델 생물, 인간을 포함한 높은 eukaryotes에서 가장 높은 보존 신호 통로의 대부분에 필수적인 유전자 가족의 창립 멤버 많은 이들의 신분에 LED 유전자 화면으로 Drosophila을 사용합니다. , 실험실 조건 하에서 기능 눈이 생존을위한 소모품이기 때문에, 그 &#39;눈&#39;은 새로운 유전자 기능의 발견과 유전자 네트워크의 평가에 특히 적합 조직입니다. 설명한 방법을 사용하여 비행 아이의 Ultrastructural 분석함으로써 개발 및 질병에 해당하는 기본적인 발견되었다. 처음에는, 단일 세포 clonal 분석 알려져 밀접하게 연관된 세포 자치 열성 마커와 결합하여 X - 선 유도 클론을 사용하여 수행되었습니다. 최근 클론을 생성하는 FLP / FRT 시스템의 가용성이 크게 눈에 섹션 6,9에 치명적인 돌연변이의 phenotypic 분석을 촉진하고 있습니다. 안과 섹션의 분석은 여기에 설명된 접선 섹션에 국한되지 않습니다. 원하는 경우, 헤드는 금형의 모든 방향으로 정렬된 수 있으며, 가로 섹션은 얇은 판과 모수 같은 머리에 깊이 레이어를 연구받을 수 있습니다. 여기에서 설명한 프로토콜은 따라서 눈과 머리 구조 Drosophila 성인의 분석을위한 다양한 방법입니다.

일반 장비 : <ul><li> 일반 파리 축산위한 10를 참조 </li><li> 선호 손을의 그림자를 캐스팅 방지하기 위해 링 광원 표준 해부 현미경 (예 : 니콘 SMZ - 645 스테레오 줌 현미경). </li><li> 해부 동안 먼지에 대한 보호를 제공하기 위해 3MM 왓먼 종이로 덮여 CO 2 플라이 패드. </li><li> 젤라틴 코팅 슬라이드 : (물에 거의 가지고 약 2 시간 소요) 열판에 1L 물 10g 젤라틴과 1g CrKSO 4 X 12 H 2 O를 해산. 딥 (DH 2 O) 잘 씻어 (비누)와 씻어서 하룻밤 호일로 덮여 젤라틴 용액과 공기 건조에 소유자의 슬라이드. </li><li> 가열 오븐 (70 ° C, nitrocellulose 필터 건조에 사용된 오래된 진공 오븐 잘 이러한 목적으로 적합합니다.) </li><li> ultrathin sectioning의 (0.5-1 μm의 두께 부분) 가능 마이크로톰은 전자 현미경 시설 사용되는 예를 들어. 우리는 조직을 품질 다이아몬드 나이프로 Sorvall MT5000 Ultramicrotome을 사용합니다. 유리 칼도 작동합니다. </li></ul> 고정 솔루션 : <ul><li> 0.2 M의 인산 나트륨 버퍼, 산도 7.2의 주식 솔루션을 준비합니다. </li><li> 0.1M의 인산 나트륨 버퍼, pH를 7.2 (4 ° C에 대한 사주에 저장할 수 있습니다)에서 2 % 글루 타 알데히드를 준비합니다. 당신이 포함하려는 유전자형 당 200μl를 적어도 충분합니다. 얼음 계속. </li><li> 오스뮴 솔루션 : 2% 0.1M의 인산 나트륨 버퍼, pH를 7.2로 오소 4. 솔루션 저장할 수 없기 때문에, 당신이 포함하려는 유전자형 당 200μl를에만 충분합니다. 얼음 계속. </li></ul> 글루 타 알데히드와 오소 4 매우 독성이 있으며 통풍이 잘되는 모자의 극단주의해서 다루어 져야합니다. 당신의 피펫의 blackening 방지하기 오소 4 다룰 때 필터 도움말을 사용하십시오. 탈수 : 30 %, 50 %, 70 %, (80 %), 90 %, 및 100 % 에탄올 솔루션을 확인하십시오. 가급적 30 % 쿨, 50 %, 사용하기 전에 얼음에 70 % 에탄올. 솔루션을 염색법 : 1 % 보락스에 Toluidine - 청색 1 %. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> 부드러운 </th><th> 하드 </th></tr><tr><td> 수지 </td><td> 54g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> 경화제의 B </td><td> 44.5g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> 가속기 C </td><td> 2.5G </td><td> 1.75g </td></tr><tr><td> 가소제 D </td><td> 10g </td><td> 0.75g </td></tr></tbody></table> 표 1. 수지 준비 신중하게, 수지를 준비하지만, 철저하게 대형 저어 바있는 자기 활동가를 사용하여 플라스틱 비이커에있는 모든 재료를 혼합한다. 거품을 피하십시오. -20 ° C.에서 표준 섬광 튜브 또는 이와 유사한 용기 동결에 혼합, 나누어지는 후 귀하의 EM 시설 더 어려워 수립을 요구하지 않는 모든 응용 프로그램에 대해 부드러운 수지를 사용하십시오. (그 unpolymerized 형태로 발암성) 수지를 처리​​하는 장갑을 사용하십시오. 70 ° C 야간에, 장비 및 폐기물에 굽기를 수지를 중합한다. 폐기물은 다음 안전하게 삭제 및 장비 세척 및 재사용 수 있습니다. 쏟았 unpolymerized 수지는 이소프로판올과 청소하실 수 있습니다. <table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 공급 업체 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 패드 플라이 </td><td> 예 제네시 </td><td> 59-119 </td></tr><tr><td> 글루 타 알데히드 </td><td> 시그마 </td><td> G7526 - 10 X 10 ML </td></tr><tr><td> 오소 네 </td><td> Polysciences 주식 회사 </td><td> 0972A - 20 </td></tr><tr><td> Propyleneoxide </td><td> 어부 </td><td> 04332-1 </td></tr><tr><td> # 3 메스 핸들, </td><td> 어부 </td><td> 22080046 </td></tr><tr><td> 메스 블레이드 # 11 </td><td> 어부 </td><td> 08-916 - 5B </td></tr><tr><td> 전송 pipettes </td><td> 어부 </td><td> 13-711 -은 7m </td></tr><tr><td> Durcupan (R) ACM 수지 </td><td> 시그마 (Fluka) </td><td> 44610 - 1EA </td></tr><tr><td> 스틸 해부 바늘 </td><td> 어부 </td><td> S17346 </td></tr><tr><td> BEEM 평면 퍼가기 금형 </td><td> 전자 현미경 문화. </td><td> 70904-12 </td></tr><tr><td> 테플론 코팅 면도날 </td><td> 전자 현미경 문화. </td><td> 71,970 </td></tr><tr><td> Q - 팁 (멸균 면봉) </td><td> 어부 </td><td> 14-959-81 </td></tr><tr><td> 유리 슬라이드 </td><td> 어부 </td><td> 12-550-143 </td></tr><tr><td> 커버는 더 이상 1, 22X60 mm를 실수하면 안된다 </td><td> 어부 </td><td> 12 - 531K </td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 어부 </td><td> ICN96010280 </td></tr><tr><td> CR (III) K 사 dodecahydrate SO </td><td> 시그마 </td><td> 243361 </td></tr><tr><td> 6mm 다이아몬드 조직을 칼로, </td><td> Diatome 미국 </td><td> 60 그의 </td></tr><tr><td> Toluidine 블루 O </td><td> 어부 </td><td> BP107 - 10 </td></tr><tr><td> 보락스 (나 - 테트라 보 레이트) </td><td> 어부 </td><td> AC20629 - 1000 </td></tr><tr><td> DPX 장착 매체 </td><td> 시그마 </td><td> 44581 - 100ML </td></tr></tbody></table> 표 2. 자료

성인의 준비 drosophila</em씬 sectioning 및 현미경 분석을위한> 눈

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila는 오래 유전자 다루기 쉬운되는과 용이 주로 인해, 개발 연구를 모델 시스템으로 사용되고 있습니다. 수년에 걸쳐, 돌연변이 종자 및 기술 트릭의 과다는 복잡한 질문 및 시간의 합리적인 금액에 답변 수 있도록 개발되었습니다. 모든 알려진 주요 신호 경로의 구성 요소의 상호 작용에 근본적인 통찰력은 앞으로의 취득 및 유전자 Drosophila 연구를 반대하고 있습니다. 실험실 조건 하에서, 파리 기능성 눈없이 살아남을 수, 이후 플라이 눈, 유난히 잘 mutational 분석을 위해 적합한 것으로 입증되었습니다. 또한, 곤충 눈의 표면은 해부 현미경으로 바라 보았다 때 정기적으로 부드러운 표면을 형성 약 800 개별 단위 눈 (측면 또는 ommatidia)로 구성되어 있습니다. 각각 또는 전체 눈 크기 (에 따라 화면의 예를 보려면, 그러므로, 그것은 돌연변이가 외부에 매끄러운 표면의 손실 (그림 1. &#39;거친 눈&#39;표현형)을보고 안구 개발이나 성장에 영향을 미칠 수 있는지 쉽게 외부 눈 형태) 예 1을 참조하십시오. 눈 phenotypes 이후에 세부적인 분석은 고정, 플라스틱 퍼가기 성인 눈이 얇은 sectioning을 필요로합니다. Drosophila 아이는 소위 눈 imaginal 디스크 (검토 예 2 참조) 애벌레와 pupal 단계 동안 세포 분열 따위에 의해 번식하고 차별 상피 세포의 가방에서 개발하고 있습니다. 넷 렌즈 - secreting 콘 세포, 색소 세포 (R - 세포 클러스터 주변에 &#39;육각&#39;)와 브리슬, 각 ommatidium 여덟 photoreceptors (. 그림 2 PR 또는 R - 세포) 등 20 세포로 이루어져 있습니다. R8 [그림;, 가장 쉽게 가벼운 민감한 organelles, rhabdomeres, (R1 - 6) 6 &quot;객관적인&quot;두 &quot;주관적인&quot;photoreceptors (R7 / 8 이루어진 사다리꼴로 구성됩니다 각 ommatidium의 photoreceptors 확인 2.]) R7 아래이며 따라서에만 눈이 깊은 지역에서 섹션에 보았다. 각 패싯의 사다리꼴은 정확하게는 이웃과 눈 (그림 3A)의 전반적인 anteroposterior 및 dorsoventral 축의 기능과 정렬됩니다. 특히, 지느러미 및 복부 (각각 검은색과 빨간색 화살표)의 ommatidia은 눈의 반쪽은 서로의 미러 이미지이며 평면 세포 극성 신호 (검토 예 3 참조) 중 설립이 chiral 형식과 일치합니다. 세미 얇은 눈 섹션을 생성하는 방법 (예 : 그림 3.로 표시 것과)은 약간 원래 톰린슨 4 준비하여 설명하는 하나에서 수정됩니다 여기에 설명되어 있습니다. 그것은 투명한 원추 세포를 제외한 모든 세포의 형태학의 분석을 수 있습니다. 또한, R - 세포 (그림 파란색 화살촉. 2와 3)의 안료는 R - 세포의 유전자형에 대한 셀 - 자율 마커, R - 세포 수의 하위 집합에있는 유전자의 따라서 유전자 요건으로 사용할 수 있습니다 쉽게 5,6를 결정합니다.

어른을 준비하는 표준 방식<em&gt; Drosophila</em세미 - 얇고 sectioning 가벼운 현미경 분석을위한&gt; 눈이 여기서 제공됩니다. 프로토콜은 눈 결함의 총 형태학의 분석을 위해 사용할 수있는, 또는 지정된 조정은 안구의 특정 세포 유형 (photoreceptors의 예 clonal 분석)이나 전자 현미경 분석을위한 유전자의 유전 요구 사항을 결정하는 데 사용할 수와 함께.

성인의 준비 Drosophila</em씬 Sectioning 및 현미경 분석을위한> 눈

초파리(Drosophila)는 유전적 조작이 용이하다는 장점 덕분에 오랫동안 발생학 연구의 모델 시스템으로 사용되어 왔습니다. 수년에 걸쳐 수많은 돌연변이 계통과 기술적 방법들이 개발되었으며, 이를 통해 정교한 질문들을 던지고 합리적인 시간 내에 답을 얻을 수 있게 되었습니다. 순방향 및 역방향 유전학적 초파리 연구를 통해 알려진 모든 주요 신호 전달 경로 구성 요소들 간의 상호작용에 대한 근본적인 통찰을 얻었습니다. 초파리의 눈은 실험실 조건에서 눈의 기능이 없어도 생존이 가능하기 때문에 돌연변이 분석에 매우 적합한 것으로 입증되었습니다. 또한, 곤충 눈의 표면은 약 800개의 개별 단위 눈(소면 또는 낱눈)으로 구성되어 있으며, 해부 현미경으로 관찰하면 규칙적이고 매끄러운 표면을 형성합니다. 따라서 매끄러운 표면의 소실('거친 눈' 표현형; 그림 1)이나 전반적인 눈 크기의 변화를 외부에서 관찰함으로써 돌연변이가 눈의 발생 또는 성장에 영향을 미치는지 쉽게 확인할 수 있습니다(외부 눈 형태학 기반 스크리닝의 예는 참고문헌 1 참조). 이후 눈 표현형에 대한 세부 분석을 위해서는 성체 눈의 고정, 플라스틱 임베딩 및 박절 과정이 필요합니다. 초파리의 눈은 이른바 눈 성충판(eye imaginal disc)에서 발달하며, 이는 유충 및 번데기 단계 동안 증식하고 분화하는 상피 세포 주머니입니다(리뷰는 참고문헌 2 참조). 각 낱눈은 8개의 광수용기(PR 또는 R-세포; 그림 2), 4개의 렌즈 분비 원추세포, 색소세포(R-세포 클러스터 주변의 '육각형'), 그리고 강모를 포함한 20개의 세포로 구성됩니다. 각 낱눈의 광수용기는 빛에 민감한 세포 소기관인 랩돔(rhabdomere)을 통해 가장 쉽게 식별할 수 있으며, 6개의 '외부' 광수용기(R1-6)와 2개의 '내부' 광수용기(R7/8; R8[그림 2]은 R7 아래에 위치하므로 눈의 더 깊은 영역의 절편에서만 보임)로 이루어진 사다리꼴 형태로 배열됩니다. 각 소면의 사다리꼴은 인접한 소면들 및 눈의 전반적인 전후축과 배복축에 정확하게 정렬되어 있습니다(그림 3A). 특히, 눈의 등쪽과 배쪽(각각 검은색 및 빨간색 화살표) 절반의 낱눈들은 서로 거울상 관계에 있으며, 이는 평면 세포 극성(planar cell polarity) 신호 전달 중에 형성된 두 가지 카이랄 형태에 해당합니다(리뷰는 참고문헌 3 참조). 여기에서 설명하는 반박절 눈 절편(그림 3에 제시된 것과 같은) 제작 방법은 Tomlinson과 Ready가 처음 기술한 방법을 약간 수정하여 적용한 것입니다. 이 방법은 투명한 원추세포를 제외한 모든 세포의 형태학적 분석을 가능하게 합니다. 또한 R-세포의 색소(그림 2 및 3의 파란색 화살표 머리)를 R-세포 유전자형의 세포 자율적 마커로 사용할 수 있어, R-세포의 특정 하위 집합에서 유전자의 유전적 요구 사항을 쉽게 결정할 수 있습니다(참고문헌 5,6).

본 절차의 전반적인 목적은 성체 초파리의 눈을 박편 제작용으로 준비하여, 평면 세포 극성(planar cell polarity) 결함과 같은 돌연변이 눈 표현형을 상세하게 평가하는 것입니다. 이를 위해 먼저 마취된 초파리의 머리를 절단합니다. 그 다음 눈 조직을 고정하고 에폭시 수지에 매립합니다.수지가 응고되면, 포매된 눈을 다듬습니다. 절편 제작을 위한 마지막 단계는 다이아몬드 나이프가 장착된 마이크로톰을 사용하여 눈을 얇게 절단하는 것입니다. 최종적으로, 눈 절편 분석을 통해 새로운 돌연변이체의 눈 표현형을 특성화하거나 PCP 경로와 같은 신호 전달 경로 내 유전자들 사이의 유전적 상호작용을 정량화할 수 있습니다.두 방법 모두 새롭게 확인된 유전자들의 생리학적 역할을 규명하는 데 도움이 될 것입니다. 이 방법은 새로운 돌연변이가 눈 발달에 어떤 영향을 미치는지, 또는 유전적 상호작용 분석에서 유전자들이 어떻게 상호작용하는지와 같은 초파리 연구 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 섹셔닝 몰드 내에 눈을 정렬하는 것과 같은 안구 임베딩 과정의 여러 단계는 텍스트 형태보다는 영상을 통해 훨씬 더 쉽게 이해할 수 있습니다. 우선, 독성 화학 물질인 글루타르알데하이드와 오스뮴을 사용하는 초파리 머리 고정 준비를 위해 장갑을 착용하십시오.다음으로 CO2를 사용하여 파리를 마취시키고, 해부 현미경 하에서 watman paper로 보호된 fly pad 위로 털어냅니다. 일반적으로 각 유전자형당 6개의 매립된 파리 머리를 확보하기 위해 6마리의 파리에 추가로 1마리를 더 분류하며, 핀셋으로 파리의 흉부를 부드럽게 누른 후 메스로 파리의 머리를 제거합니다. 핀셋으로 목 부분을 접촉시켜 파리 머리를 고정하고, 고정액의 침투를 높이기 위해 한쪽 눈의 작은 부분을 조심스럽게 잘라냅니다. 핀셋이나 메스로 잘라낸 눈 표면의 머리 부분을 접촉시켜 얼음 위에 둔 glutaraldehyde phosphate 고정액으로 머리를 옮깁니다. 고정 과정 전반에 걸쳐 반드시 장갑을 착용하십시오.먼저 각 유전형을 구분할 수 있도록 모든 몰드에 라벨을 붙입니다. 그다음, 각 몰드에 100% resin을 채우되, 너무 많이 채우지 않도록 주의하십시오. 표면이 평평하게 마무리되어야 합니다.트랜스퍼 피펫을 사용하여 머리에서 50% resin을 제거합니다. 이를 100% resin으로 교체하고 실온에서 3~4시간 동안 배양합니다. 배양 과정 동안 머리가 resin 내에서 평형을 이루면서 튜브 바닥으로 가라앉게 됩니다.이쑤시개를 딱딱한 표면에 쳐서 끝부분에 작은 갈고리를 만듭니다. 이 도구를 사용하여 파리 머리를 하나씩 각 몰드에 옮깁니다. 레진이 쏟아져 현미경이 오염되는 것을 방지하기 위해 해부 현미경의 작업 구역에 알루미늄 호일을 깝니다.해부 현미경의 도움을 받아, 해부용 바늘을 사용하여 머리를 약간 주의 깊게 회전시킵니다. 이를 몰드의 바닥, 즉 뾰족한 끝부분 근처로 이동시킵니다. 목 부분이 아래를 향하도록 하여, 손상되지 않은 눈의 표면을 몰드의 앞벽과 주의 깊게 정렬합니다.눈의 접선 표면이 몰드 벽에서 머리 지름의 약 절반 정도 떨어져 있도록 유지하십시오. 해부침을 제거할 때 눈이 움직이면, 눈을 원하는 위치로 다시 잡고, 침을 머리에서 빠르게 약간 뺀 다음 천천히 완전히 제거하십시오. 모든 머리의 정렬이 완료되면, 모든 눈이 움직이지 않았는지 다시 확인하십시오.수지에서 바늘을 제거한 후, 필요하거나 비뚤어진 경우 헤드 부분을 다시 정렬하고, 몰드를 오븐으로 옮겨 70 °C에서 밤새 굽습니다. 밤새 구운 후, 몰드를 구부려 경화된 블록을 몰드에서 분리합니다. 라벨이 붙은 용기에 보관하여 어떤 블록이 어떤 유전자형에 해당하는지 기록해 둡니다.블록을 트리밍하려면, 해부 현미경으로 보았을 때 눈이 위를 향하도록 블록을 마이크로톰 척(chuck)에 장착하십시오. 테플론 코팅 면도날을 사용하여 블록의 최상단 층만 조심스럽게 잘라냅니다. 이렇게 하면 눈이 보이는 깨끗한 표면이 형성되며, 절단면을 설정할 수 있습니다.다음으로, 머리 주변의 플라스틱이 대부분 제거될 때까지 머리의 양쪽과 앞부분의 과도한 플라스틱을 잘라냅니다. 깨끗한 면도날을 사용하여 얇은 플라스틱 층을 여러 번 나누어 잘라내며 천천히 머리 부분에 접근하는 것이 가장 좋습니다. 정확히 원하는 절단면의 눈 윗부분에서 얇은 층을 조심스럽게 제거하십시오.각 절단 시 면도날의 새 부분을 사용해야 하며, 눈의 외부 표면에 도달할 때까지만 계속 절단하십시오. 결과적으로 다듬어진 블록은 절단면과 일치하는 약간 기울어진 상단 절단면을 가진 삼각뿔 형태가 됩니다. 블록을 마이크로톰에 장착하고 절편 제작을 시작하십시오.20~30개의 절편이 생성될 때까지, 결과물인 절편들은 저장조의 수면에 떠 있게 됩니다. 100 °C로 설정된 가열판 위에 슬라이드를 놓습니다. 그런 다음, 끝을 납작하게 만든 면봉을 사용하여 회전시키듯 수면 아래에서 첫 번째 절편 묶음을 들어 올린 후, 물 한 방울 위로 옮깁니다.슬라이드 위에서 물이 증발하고 절편들이 슬라이드에 밀착될 때까지 기다린 다음, 다른 20~30개의 절편으로 이 과정을 반복합니다. 일반적으로 6개의 물방울에 배치된 3개의 눈 절편들이 하나의 슬라이드에 적절히 들어갑니다. 모든 절편이 슬라이드에 수집되면, 염색 후 현미경 관찰을 위해 마운팅할 수 있습니다. 야생형 초파리 눈의 접선 절편.TIA는 정상적인 극성을 나타내며 아래 도식에서 노란색 선으로 표시된 등-배 대칭선에 대해 잘 정렬되어 있습니다. 야생형 눈의 잘 정렬된 tia와 대조적으로, 여기 strabismus 돌연변이 눈에서는 tia의 극성이 상실되었으며, 전체 광수용기 구성 요소가 존재함에도 불구하고 회전과 극성이 무작위로 나타납니다. 또한, 색소 세포 격자와 개별 광수용기 세포의 색소가 결핍되었음에 유의하십시오.strabismus 돌연변이는 white minus 유전적 배경에 있었으므로, drosophila ro kinase 또는 drop은 동형접합 치사 돌연변이이며, 따라서 클론 분석이 필요합니다. 여기서 동형접합 돌연변이 클론은 색소의 부재로 표시되며, 단일 세포 수준에서 광수용기 세포의 결손 또는 과잉을 포함한 구조적 결함뿐만 아니라 회전 결함을 나타냅니다. 돌연변이 및 야생형 광수용기의 예는 각각 빈 파란색 화살표 머리와 채워진 파란색 화살표 머리로 표시되어 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 초파리 눈의 포매 및 절편 제작 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 약 3일 정도의 연습을 거치면 눈의 표현형을 상세하게 분석하는 과정을 능숙하게 수행할 수 있으며, 이를 통해 눈 발달 과정에서 새로운 유전자의 기능을 규명할 수 있습니다.

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파라핀에 성체 초파리 머리 삽입: 조직학을 위한 조직 준비

이 비디오는 성체 초파리의 뇌를 해부하고 분리하는 방법을 설명하며, 이는 큐티클, 눈 및 기관 조직에 의해 가려진 장기를 시각화하는 데 필요한 절차입니다. 예시 프로토콜은 초파리 신경생물학의 면역염색 및 이미징 방법에 사용할 수 있는 고품질 제제를 산출하는 상세한 시연을 보여줍니다.

초파리 성인 뇌 해부: 파리 신경생물학의 방법

이 비디오는 번데기에서 눈-뇌 복합체를 해부하고 분리하는 방법을 설명합니다. 주요 프로토콜은 예를 들어 면역 염색 및 다른 유전자 발현 실험과 호환되는 고품질 조직을 생성하는 절차를 보여줍니다.

파리 번데기에서 눈-뇌 복합체의 해부: 망막 조직을 분리하는 방법

성인 초파리 뇌는 신경 회로, 높은 뇌 기능, 복잡한 질환 연구를위한 유용한 시스템이다. 효율적인 방법은 뇌 기반 연구를 용이하게 작은 비행 머리에서 전체 뇌 조직을 해부한다. 여기에 우리가 잘 보존 된 형태와 성인 두뇌의 간단한 한 단계 해부 프로토콜을 설명합니다.

간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em&gt; 초파리</em&gt; 두뇌

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Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization(시신경엽 시각화를 위한 유충 및 성체 초파리 뇌의 해부, 면역조직화학 및 마운팅)

여기에서는 패터닝 및 성장 결함을 정량화하기 위해 성인 초파리 눈의 고해상도 이미징을 위한 빠르고 저렴한 워크플로우를 제시합니다. 포인트 마운팅(point-mounting), 고해상도 이미지 획득(high-resolution image acquisition) 및 이미지 분석을 통한 시료 전처리를 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

외부 성체 초파리 구조의 정량화를 위한 빠르고 간단한 워크플로우

학습하세요 성인 Drosophila 눈의 반투명 섹셔닝 및 현미경 분석을 위한 표본 제작 방법을. 에폭시 수지에 포매하고 다이아몬드 나이프로 미세 절단하여 돌연변이 눈 표현형과 유전자 상호작용을 정량화할 수 있습니다.

성인의 준비 Drosophila 눈

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