Negative staining of Purified Exosomes: A Procedure to Visualize Exosome Morphology Using Transmission Electron Microscopy(정제된 엑소좀의 음성 염색: 투과전자현미경을 이용한 엑소좀 형태 시각화 절차)

엑소좀(나노 크기의 구형 소포)의 음성 염색을 수행하려면 적절한 전자 현미경 그리드를 취하는 것부터 시작합니다. 글로우 방전기 장치를 사용하여 그리드를 준비합니다. 이 공정은 그리드 표면을 친수성으로 만들어 샘플의 접착력을 향상시킵니다.

동시에 튜브에 정제된 엑소좀의 현탁액을 섭취합니다. 튜브에 파라포름알데히드(샘플 고정제)를 보충하고 배양합니다. 파라포름알데히드는 엑소좀에 침투하여 단백질과 핵산을 가교합니다. 이 단계는 엑소좀의 형태를 보존하는 데 필수적입니다.

이제 엑소좀 현탁액을 미리 준비된 그리드에 로드하고 흡착이 발생할 수 있도록 배양합니다. 다음으로, 그리드 위에 중금속 얼룩인 우라닐 아세테이트 몇 방울을 추가합니다. 우라닐 이온은 막 단백질과 지질에 결합하여 엑소좀 경계 주위에 침전물을 형성합니다.

마지막으로 그리드를 물로 씻어 여분의 얼룩을 제거합니다. 그리드를 건조시키고 투과 전자 현미경 또는 TEM을 사용하여 이미지를 촬영합니다.

전자빔이 엑소좀에 부딪히면 표본을 둘러싼 염색이 더 많은 전자를 산란시킵니다. 엑소좀은 전자 밀도가 낮기 때문에 빔이 통과할 수 있습니다. 이렇게 다르게 흩어진 전자는 이미징 시스템에 의해 캡처되어 고대비 이미지를 형성합니다.

음성적으로 염색된 엑소좀은 주변에 어두운 경계가 있는 더 밝게 보입니다.

음성 염색을 수행하기 위해 분리 후 정제된 엑소좀을 1 밀리리터의 2% 파라포름알데히드로 5분 동안 고정합니다. 얇은 formvar/탄소 필름 코팅된 200 메쉬 구리 EM 그리드를 1분 동안 글로우 방전으로 처리합니다. 그런 다음 5-7마이크로리터의 엑소좀 현탁액을 그리드에 로드하고 1분 동안 배양합니다. 엑소좀의 농도가 너무 높으면 농도를 적절한 수준으로 희석하십시오.

즉시 EM 그리드 표면에 여과된 1% 우라닐 아세테이트 용액 약 20방울로 엑소좀을 염색합니다. 그리드 가장자리를 여과지로 접촉시켜 그리드에서 과도한 우라닐 아세테이트 용액을 제거합니다. 그런 다음 물 한 방울로 그리드를 빠르게 헹굽니다.

을 사용하여 그리드를 테이블 위에 놓고 그리드를 배양 접시로 부분적으로 덮습니다. 그리드를 실온에서 10분 동안 건조시킨 다음 그리드를 이미지화하거나 향후 관찰을 위해 전자 현미경 그리드 상자에 보관합니다.