Zinc Finger Nuclease-based genome editing: double-stranded homology dependent repair mechanism에 의한 인간 만능 줄기세포의 게놈 수정 기법

아연 핑거 뉴클레아제 또는 ZFN은 링커를 통해 엔도뉴클레아제 도메인에 연결된 아연 이온 안정화 DNA 결합 매크로 도메인을 포함합니다. 이 구조는 DNA를 절단하는 동안 특이성을 유지하는 데 도움이 됩니다.

게놈 편집에 ZFN을 사용하려면 인간 만능 줄기 세포를 배양하십시오. ZFN을 인코딩하는 플라스미드로 보완합니다. 상동성 암 또는 HA 사이에 끼워진 표적 유전자와 항생제 내성 유전자를 포함하는 복구 플라스미드를 추가합니다. 전류가 세포 내부에 플라스미드가 쉽게 들어가는 세포-DNA 혼합물을 전기천공합니다.

일단 내부로 들어가면 번역된 ZFN의 아연 핑거 모티프는 숙주 게놈의 상보적 염기쌍의 삼중항에 결합하여 표적 부위에 Fok-1 제한 엔도뉴클레아제를 올바르게 배치합니다. ZFN은 쌍으로 반대쪽 가닥에 결합하여 Fok-1 동종이량체화가 활성 촉매 중심을 형성할 수 있도록 하며, 여기서 Fok-1은 DNA 이중 가닥 단절 또는 DSB를 생성하여 4개의 뉴클레오티드 돌출부를 생성합니다.

복구 플라스미드에 HA의 존재는 돌출된 끝이 반전되고 상동 HA 서열을 템플릿으로 사용하는 상동성 의존적 복구를 안내합니다. DNA 합성은 표적 유전자에 상보적인 뉴클레오티드를 추가함으로써 계속됩니다.

생성된 간격은 결찰되어 유전자 삽입을 용이하게 합니다. 또한, 프로모터가 없는 항생제 내성 유전자는 삽입 부위의 상류에 있는 숙주 프로모터로부터 발현됩니다. 성공적으로 편집된 세포는 항생제 선택 배지에서 성장합니다.

라틴에서 성장한 미토마이신 C-비활성화 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 포함하는 6웰 플레이트의 hESC 배지에서 인간 만능 줄기 세포를 배양하는 것으로 시작합니다. 도금 후 매일 hPSC가 50% 컨플루션에 도달할 때까지 유리 피펫과 진공청소기를 사용하여 전체 부피의 배지를 제거합니다. 웰당 3밀리리터의 따뜻한 hESC 배지로 교체합니다.

표적화 하루 전에 hESC 배지를 제거하고 10마이크로몰 Y27632가 보충된 신선한 예열된 hESC 배지를 추가합니다. 또한, DR4 마우스로부터 약물 내성 MEF 피더 세포의 1-2개의 6웰 플레이트를 준비한다. 표적화 당일, 5마이크로그램의 아연 핑거 뉴클레아제 발현 플라스미드 1 및 2를 1.5밀리리터 튜브에 피펫팅하여 형질감염 용액을 준비합니다.

30마이크로그램의 복구 기증자 플라스미드를 첨가한 다음 부피를 300마이크로리터로 만드는 충분한 1X 인산염 완충 식염수를 추가합니다. 현미경으로 세포를 검사하여 50% 합류도를 확인합니다. 다음으로, 유리 피펫과 진공청소기를 사용하여 hPSC 플레이트에서 배지를 제거합니다. 그런 다음 따뜻한 1X PBS 2밀리리터로 세포를 세척합니다. PBS를 흡인한 후 0.5 밀리리터의 0.25 % 트립신 EDTA 용액을 세포에 직접 첨가합니다.

약 10분 동안 또는 피더 층이 플레이트에서 들어 올려지기 시작할 때까지 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다. 배양 후, 트립신 반응을 멈추기 위해 각 웰에 2밀리리터의 따뜻한 esWash 배지를 추가합니다. 각 웰에서 세포를 수집하여 피더 세포가 시트로 벗겨지도록 합니다. 각 웰의 내용물을 단일 50밀리리터 원추형 튜브에 피펫팅하여 모든 웰을 결합하고 10밀리리터 혈청학적 피펫을 사용하여 세포를 분쇄합니다.

esWash 배지를 첨가하여 세포 현탁액을 40밀리리터로 만듭니다. 큰 피더 덩어리가 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 1-2분을 기다린 다음 혈청학적 피펫을 사용하여 상청액을 제거하고 새로운 50밀리리터 원추형 튜브에 침전시킵니다. 세포 현탁액을 190 x g에서 5분 동안 원심분리한 후, 세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 흡인합니다. 세포를 500마이크로리터의 1X PBS에 재현탁합니다.

재현탁된 세포를 이전에 준비된 혈장 형질감염 용액과 결합합니다. 세포와 형질감염 혼합물을 4mm 전기천공 큐벳에 피펫팅하고 얼음 위에 3-5분 동안 놓습니다. 전기천공 시스템의 지수 프로그램에 대한 매개변수를 250볼트, 500마이크로패럿, 무한 저항 및 4mm 큐벳 크기로 설정합니다. 세포를 전기 구멍으로 만든 다음 큐벳을 다시 얼음 위에 3분 동안 놓습니다.

10마이크로몰 Y27632가 보충된 18밀리리터의 따뜻한 hESC 배지에 전기천공된 세포를 재현탁합니다. 현미경으로 DR4 MEF를 검사합니다. 단일 세포 현탁액 3밀리리터를 DR4 피더 세포가 포함된 6웰 플레이트의 각 웰에 플레이트하고 인큐베이터로 되돌립니다. 도금 후 3일째에 세포의 배지를 Y27632가 없는 hESC 배지로 교체합니다. 4일째에 보충되지 않은 배지를 적절한 선택 항생제가 포함된 배지로 교체합니다. 여기서는 푸로마이신이 사용됩니다.