유도성 Tet-Off 조절 시스템: Tetracycline-Off 시스템을 사용하여 배양된 세포의 유전자 발현을 조절하는 In vitro 방법

배양된 수혜 세포의 현탁액을 튜브에 담아 섭취하는 것으로 시작합니다. 관심 유전자를 포함하는 유도성 플라스미드로 튜브를 보충합니다. 이 유전자의 발현은 테트라사이클린 연산자 또는 TetO에 융합된 업스트림 프로모터 서열의 제어 하에 있으며, 테트라사이클린 반응성 요소 또는 TRE를 형성합니다.

또한 각각 재조합 테트라사이클린 트랜스활성제 단백질 또는 tTA를 암호화하는 유전자를 포함하는 조절 테트라사이클린 오프 벡터를 추가합니다. 세포-DNA 혼합물을 전기천공하여 전기 펄스를 사용하여 세포에 의한 플라스미드 흡수를 촉진합니다.

전기천공 후, 세포를 플레이트하고 원하는 시간 동안 배양합니다. 핵에 들어가면 테트라사이클린 오프 벡터는 tTA 단백질을 발현합니다. tTA는 Tet 억제 또는 TetR 부분과 바이러스 VP16 전사 트랜스활성제 도메인을 포함하는 하이브리드 단백질입니다.

TetR 부분은 TRE 요소의 TetO 서열에 결합하는 반면, VP16 도메인은 RNA 중합효소가 다운스트림 DNA에서 mRNA를 합성하여 결국 유전자 발현을 유도할 수 있도록 합니다. 배양 플레이트의 성장 배지를 독시사이클린 함유 배지로 교체하고 배양합니다.

합성 테트라사이클린 유사체인 독시사이클린은 TetR 단백질에 결합하여 형태를 변화시킵니다. 이러한 변화는 TetR 단백질과 TetO 서열의 상호 작용을 방해하여 표적 유전자 발현을 억제합니다.

완전한 최소 필수 배지가 있는 상태에서 100mm 페트리 접시에 1 x 10 6 cells/cm²로 세포를 시드합니다. 습도가 있는 24% 이산화탄소에 섭씨 37도에서 5시간 동안 배양합니다. 다음날, 새로운 12웰 플레이트의 각 웰에 항생제 없이 500마이크로리터의 완전 배지를 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 30분 동안 예열합니다.

이 배양 동안, 반응 플라스미드 1마이크로그램과 조절 벡터 1마이크로그램을 웰당 1.5밀리리터 튜브 1개에 첨가한다. 칼슘 또는 마그네슘이 없는 섭씨 37도 PBS의 웰당 10밀리리터로 폐포 상피 세포를 세척하고, 세포 배양 인큐베이터에서 2-4분 동안 섭씨 37도의 0.05% 트립신의 웰당 5밀리리터로 세포를 처리합니다.

세포가 분리되면 항생제 없이 웰당 10밀리리터의 완전 배지로 트립신을 중화하고 세포를 새로운 50밀리리터 튜브에 모으십시오. 접시 4밀리리터의 신선한 배지로 접시를 씻어 남은 세포를 수집하고 원심분리로 세포를 침전시킵니다.

계수를 위해 펠릿을 PBS 1밀리리터에 재현탁하고 세포를 다시 원심분리합니다. 4 x 10⁷ 세포/mL의 재현탁 완충액 밀도로 펠릿을 재현탁하고 4 x 10⁵ 세포를 플라스미드 및 벡터의 각 튜브에 부드럽게 혼합하여 첨가합니다. 전기천공 장치에 튜브 1개를 넣고 튜브에 3.5밀리리터의 전해 완충액을 채웁니다.

피스톤을 완전히 눌러 금도금 전극 팁을 피펫에 삽입하고 튜브 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 피펫으로 세포를 조심스럽게 흡인하고 딸깍 소리가 들릴 때까지 피펫을 전기천공 스테이션에 삽입합니다. 폐포 상피 세포에 적합한 전기천공 프로토콜을 선택하고 터치 스크린에서 시작을 누릅니다.

형질감염 직후, 피펫을 제거하고 세포를 예열된 12웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다. 모든 세포가 전기천공되고 도금되면 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣고 2일 후에 각 웰의 상청액을 항생제가 포함된 완전 배지로 교체합니다. 형질감염의 성공은 형광 현미경 또는 대조군 벡터를 사용한 유세포 분석법으로 관찰된 바와 같이 EGFP의 발현에 의해 확인할 수 있습니다.

관심 유전자의 전사를 억제하기 위해, 형질감염 후 72시간 후, 상청액을 새로 준비된 독시사이클린의 밀리리터당 1마이크로그램이 보충된 완전 배지의 웰당 1밀리리터로 대체한다. 관심 유전자의 mRNA 반감기를 평가하려면 플레이트를 15분에서 6시간 동안 세포 배양 인큐베이터로 되돌립니다.

중에서 판매되는 페놀-클로로포름 RNA 추출 키트에서 추출한 500마이크로리터의 용해 완충액으로 세포를 용해하기 전에 얼음처럼 차가운 PBS 1밀리리터로 웰 1개를 세척하고 각 실험 시점에서 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 키트 지침에 따라 RNA를 분리하고 230, 260 및 280나노미터에서 분광 광도법으로 RNA 수율과 순도를 결정합니다.