모기 배아 미세주입: 생식세포 돌연변이를 생성하기 위해 Anopheles gambiae의 배아 난황에 외인성 DNA를 전달하는 기술

Anopheles 배아에 외인성 DNA를 미세 주입하려면 원하는 수의 갓 수확한 배반엽 전, 모기 알을 채취하십시오. 이 초기 발달 단계에서 난자는 세포 구조를 형성하지 않고 핵을 포함합니다.

유리 슬라이드 표면에 있는 축축한 압지의 주변에 보트 모양의 계란을 놓습니다. 이 단계는 후속 단계에서 주입을 용이하게 하기 위해 배아의 적절한 수화를 보장합니다. 복부 표면이 바깥쪽으로 노출된 상태에서 서로 인접한 알을 정렬합니다.

이제 원하는 플라스미드 용액이 들어 있는 협구경 미세 주입 바늘을 사용합니다. 해부 현미경을 사용하여 생식 세포 전구체가 있는 부위인 난자의 후극 근처에 바늘을 배치합니다. 바늘을 적절한 각도로 삽입하여 외융모막(외부 층)과 내융모막(달걀 껍질의 내부 층)을 관통하여 결국 배아에 도달합니다.

플라스미드 혼합물을 배아의 노른자에 주입합니다. 바늘을 부드럽게 집어넣고 적절한 조건에서 알이 자랄 수 있도록 합니다. 난자가 자라면서 일부 핵은 미세 주입된 DNA를 통합할 수 있는 후극으로 이동합니다. 이 핵은 나중에 유전 가능한 생식계열 돌연변이를 일으킬 수 있는 성세포인 배우자가 됩니다.

성공적인 미세 주입을 확인하는 후속 세대에서 관찰 가능한 특성인 변형된 표현형에 대한 성충 모기를 시각화합니다.

마이크로 로더 팁을 사용하여 바늘에 2마이크로리터의 DNA 혼합물을 채웁니다. 바늘을 바늘 홀더에 삽입하고 자동 압력 펌프 튜브를 연결합니다. 슬라이드의 평면과 15도 각도가 되도록 바늘을 정렬합니다.

첫 번째 계란을 조심스럽게 만져 바늘 끝을 엽니다. 그런 다음 바늘 끝을 후극에 약 10마이크로미터까지 삽입합니다. 성공적인 주사는 난자 내에서 세포질의 작은 움직임으로 이어집니다.

현미경 동축 스테이지 컨트롤을 사용하여 다음 계란으로 이동하여 주입을 계속합니다. 바늘 끝이 열린 상태로 막히지 않았는지 확인하려면 다른 배아에 들어가기 전에 '주입' 버튼을 누르고 바늘 입구에 작은 물방울을 시각화하십시오. 바늘이 막히면 '지우기' 버튼을 눌러 바늘을 지우고 물방울 시각화 테스트를 반복합니다.

물방울 크기가 작게 유지되도록 바늘 끝 개구부가 약간 커지면 필요에 따라 압력을 조정하십시오. 한 바늘로 약 40-50개의 계란을 주입합니다. 주사가 완료되면 여과지를 깐 유리 용기에 계란을 헹구고 탈이온수 50밀리리터를 채웁니다.