Magnetofection-based Transfection In vitro: 자성 나노 입자를 사용하여 플라스미드를 1차 마우스 신경 세포에 전달하는 자기장 보조 기술

형광 단백질을 암호화하는 플라스미드 DNA 또는 pDNA 현탁액으로 배지로 시작합니다. 생체 적합성, 양이온성 폴리머 코팅 자성 나노입자를 pDNA 현탁액에 첨가하고 배양합니다.

양전하를 띤 양이온 폴리머는 정전기적으로 상호 작용하고 음전하를 띤 pDNA와 접합하여 pDNA가 응축되고 전체 양전하를 띤 '자성 다중체'가 형성됩니다.

이제 폴리플렉스 혼합물을 부착된 1차 마우스 신경 세포 배양물을 포함하는 멀티웰 플레이트로 옮깁니다. 멀티웰 플레이트를 마그네틱 플레이트 위에 장착하고 배양합니다.

자기판에 의해 생성된 자기장은 폴리플렉스를 침전시키고 신경 세포 표면에 축적시킵니다. 세포 표면과의 이러한 긴밀한 접촉은 양전하를 띤 폴리플렉스가 음전하를 띤 세포막 관련 프로테오글리칸에 대한 비특이적 결합을 촉진합니다.

그 후, 다중체는 세포막의 국소 영역이 함입하고 꼬집어 엔도좀이라고 하는 막 결합 소포를 형성하는 과정인 엔도사이토시스를 통해 내재화됩니다.

세포질 내부에서 폴리플렉스의 양이온 중합체는 엔도좀에 양성자 축적을 유도합니다. 전하 중성을 유지하기 위해 염화물 이온이 동시에 유입되면 엔도솜 이온 강도가 증가하여 물 유입이 발생합니다.

결국 엔도좀은 삼투압으로 인해 팽창하고 파열되어 다중체를 세포질로 방출합니다. 폴리플렉스 내의 응축된 pDNA는 세포질 운동성 증가를 촉진하는 반면, 양이온 중합체는 세포질 뉴클레아제 분해로부터 pDNA를 보호합니다.

다중체의 해리 후, 핵막이 일시적으로 분해되는 적절한 세포 주기 단계 동안 방출된 pDNA는 핵으로 전좌됩니다. pDNA로 성공적으로 형질감염된 세포는 형광 단백질을 발현합니다.

운동 뉴런을 배양하려면 24웰 플레이트에서 웰당 500마이크로리터의 배양 배지에서 5,000 내지 10,000개의 세포로 희석합니다. 그런 다음 P1000 피펫 팁으로 라미네이트 용액을 제거합니다. 건조를 피하기 위해 배양 배지에 희석된 운동 뉴런을 즉시 코팅 플레이트로 옮깁니다.

DNA를 준비하려면 1마이크로그램의 DNA를 50마이크로리터의 신경 배양 배지에 재현탁하고 5초 동안 소용돌이치게 합니다. 비드 튜브를 준비하려면 1.5마이크로리터의 비드를 50마이크로리터의 신경 배양 배지에 재현탁합니다. 50마이크로리터의 DNA 용액에 50마이크로리터의 비드 용액을 첨가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.

이 배양 동안 형질감염될 웰에서 100마이크로리터의 배양 배지를 꺼냅니다. 그 후, 100마이크로리터의 DNA-비드 혼합물을 각 웰로 옮기고, 24웰 플레이트를 섭씨 37도의 마그네틱 플레이트에서 20-30분 동안 배양합니다.