Name: RNA 함유 Exosomes의 분리 및 특성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 배우세요 RNA 함유 엑소좀의 초고속 원심분리법을 이용한 분리 및 전자현미경, 유세포분석을 통한 특성 분석 방법. 이 기술은 세포 간 신호전달 연구에 필수적입니다.

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이 연구는 스웨덴 연구 협의회 (K2008 - 57X - 20 676-01-3)에 의해 재정되었다.

1. Exosome 격리 <ol><li> exosome 무료 혈청 매체 세포를 성장. 따라서, 모든 혈청은 세포 배양 매체에 추가이 4 박 120 000 XG에 ultracentrifugation에 의해 exosomes의 고갈되어야 ° C를 사용하기 전에. </li><li> 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 4 10 분 300 XG에 원심 분리기 ° 펠렛 셀 C. </li><li> 초원 심 분리기 튜브를하고 그렇지 않으면 완전한 추가 PBS로 뜨는을 전송합니다. </li><li> 4 20 분 동안 16 500 XG에서 샘플을 원심 ° C 추가 세포와 세포 파편을 제거합니다. </li><li> 200 NM보다 큰 입자를 제거하는 필터 0.2 μm의를 통해 뜨는을 필터링합니다. </li><li> 새로운 초원 심 분리기 튜브에 필터링된 뜨는을 전송 4 70 분 120 000 XG에 초원 심 분리기 전에 튜브를 밀봉 ° C를 펠렛 exosomes 수 있습니다. </li><li> 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 최대한 exosome 검색은 exosome을 풍부하게 resuspend적절한 버퍼의 작은 볼륨 (~ 3 X 50 μl)에 반복 에드 펠릿. 이 버퍼 exosome 절연 다음과 같은 계획 스트림 실험에 따라 달라집니다. 예를 들어, 용해 버퍼는 단백질과 RNA 분리에 사용되는, PBS는 전자 현미경과 유동세포계측법 및 기능 연구 매체가 선호하는 수에 사용됩니다. </li></ol> 참고; exosomes도 세포 배양 매체에 대한 동일한 절차를 사용하는 등 플라즈마와 같은 다른 체액, 격리 수 있습니다. 점성 유체에 대한 그것은 전에 원심 분리와 여과 단계로 PBS와 함께 샘플을 희석해야 할 수도 있습니다. 포인트 위의 5 원심 분리 속도와 관련하여, 그것은 29 500 XG로 증가 수 있으며, 포인트 7 ultracentrifugation은 90분 18 확장될 수 있습니다. 샘플 더 정화해야하는 경우 exosome 펠렛은 자당 기울기에 떠내려 수 있으며 exosomes는 분획 represe에서 주로 발견됩니다1.13-1.19 g / ML 2 밀도를 nting. 2. 전자 현미경에 의해 Exosome 식별 <ol><li> 을 추가, 오염 단백질을 제거 4 70분 120 000 XG ° C로 다시 펠렛 exosomes에서 exosome 풍부한 PBS의 펠렛과 초원 심 분리기를 resuspend. </li><li> 단백질 분리 및 총 단백질 측정을위한 시료의 작은 나누어지는를 가져가라. 샘플의 극히 일부는 단백질 측정 lysed 및 사용되었는지 확인하고 얼음에 별도의 또는 -80 ° C에서 추가 실험 PBS에서 해결 그대로 exosomes을, 유지. </li><li> Parafilm에 드롭, PBS에 resuspended 그대로 exosomes의 exosomal 단백질의 약 10 μg을 넣으십시오. 그런 다음, 집게와 함께 부드럽게 30~60분 각 드롭 위에 formvar 탄소 코팅 니켈 격자 위치. 격자가 exosomes를 포함하는 드롭 직면하고 코팅 면을 위치입니다기만하면됩니다. </li><li> t에 PBS 세 방울, 각 30 μl, 장소그는 Parafilm하고 순차적으로 PBS의 방울 상단에있는 격자를 위치하여 격자를 씻어, 그리고 사이에 흡수 종이를 사용합니다. 부드럽게 막 코팅 영역과 접촉하지 않고, 격자의 측면에 밀접하게 그것을 잡고하여 흡수 종이를 사용하십시오. </li><li> 보증금으로 Parafilm에 2 % paraformaldehyde의 드롭을 예제​​를 수정하고 10 분 동안 드롭의 상단에있는 격자를 놓으십시오. </li><li> 적절한 항체와 immunostaining 전에 포인트 4 세정 단계를 반복합니다. 일반적으로 사용되는 항체 안티 CD63 및 안티 MHC 클래스 II 수 있습니다. 전자 현미경은 또한 exosomes는 전적으로 크기와 형태에 따라 확인할 수 있습니다대로 immunostaining없이 수행할 수 있습니다. 그러나, 우리는 크기, 형태 및보다 확실한 검증을 위해 막 단백질의 존재를 평가하는 것이 좋습니다. </li><li> 선택의 주요 항체의 30 μl 드롭으로 격자를 전송하고 40 분 알을 품다. 포인트 4를 반복하여 씻어지만, PB에서 알부민 0.1 % 소 혈청을 사용대신 PBS 혼자의 S. </li><li> 포인트 7를 반복하지만, 10 nm의 - 골드 라벨 ​​차 항체와 PBS로 세척 혼자와. </li><li> Parafilm 2.5 %의 글루 타 알데히드의 드롭을 추가하여 샘플을 포스트 수정하고 10 분 동안 드롭의 상단에있는 격자를 품어. 포인트 4의 세척을 반복하지만, 탈이온수 다섯 방울 대신 PBS 세 방울을 사용합니다. </li><li> Parafilm에 2 % uranyl 아세트산의 드롭을 추가하고 15 분 동안 드롭의 상단에있는 격자를 부화하여 명암 샘플을. </li><li> Parafilm에 0.13 %의 메틸 셀룰로오스의 방울 및 0.4 %의 uranyl 아세트산을 추가하여 샘플을 포함하고 10 분 동안 드롭의 상단에있는 격자를 품어. </li><li> 최대 코팅된 면을 종이에 격자를 위치하기 전에, 부드럽게 흡수 종이를 사용하여 여분의 액체를 제거하고 공기를 5 분 건조하자. </li><li> 전자 현미경으로 준비를 검사하거나 향후 작업에 대한 격자 상자에 그리드를 저장합니다. </li></ol> 3.유동세포계측법에 의해 Exosome 특성화 exosomes 현재 유동세포계측법 장치에 의해 감지가 너무 작아 있으므로, 먼저 항체 코팅 비즈 (그림 1)로 exosomes를 바인딩하는 것이 필요합니다. 이 구슬은 어느 준비가 만들어진 제품으로 구입하거나 선택의 항체와 실험실에서 만들 수 있습니다. exosomal 세포 기원에 따라, 서로 다른 항체가 자기 또는 라텍스 문자 중 하나가 될 수 있습니다 구슬에 결합하실 수 있습니다. 우리는 현재이 분석을 위해 안티 MHC 클래스 II 또는 방지 CD63 코팅 구슬을 사용합니다. <ol><li> "수제"항체 코팅 구슬의 사용을 위해, 우리는 안티 CD63 항체로 코팅된 4 μm의 라텍스 구슬을 사용합니다. 두번 100 μl MES 버퍼에 25 μl 4 μm의의 라텍스 비즈 (30 X 10 6 구슬) 15-20분 3 000 XG 씻으 100 μl MES 버퍼의 펠렛을 redissolve. MES 버퍼의 동일한 볼륨 12.5 μg 항체 동등한 볼륨을 포함하는 항체 혼합물을 준비합니다. 추가항체 혼합물과 실온에서 하룻밤 동안 교반에 따라 부화 구슬. PBS (20 분 3 000 XG)와 항체 코팅된 비즈 세 번이나 씻고 (300 000 구슬 / μl의 최종 농도)를 저장 버퍼의 100 μl의 펠렛을 디졸브. </li><li> 각 샘플에 대한 (각 항체) ~ 100 000 항체 코팅 비즈 당 exosomal 단백질 30 μg의 최소 (PBS에서 해결 그대로 exosomes의)에 동일한 볼륨을 계속합니다. </li><li> 4 박 이상, 300 μl PBS의 총 볼륨에 exosomes와 구슬을 품어 ° C 부드러운 움직임에 따라. </li><li> 30 분 200 MM 글리신과 부화 300 μl를 추가하여 차단합니다. </li><li> 두 번 씻어 버퍼에있는 exosome - 구슬 단지 (PBS에서 1-3% 혈청), 10 분 동안 600 XG 씻으십시오. </li><li> 4시 50 μl IgG 항체와 exosome - 비드 단지 ° C.를 품어 5 단계에서 설명한대로 세척 버퍼에 두 exosome - 비드 단지 씻으십시오. </li><li> 90 μl 세척 버퍼와 10 μl를 추가부드러운 움직임에 따라 40 분 exosome - 비드 단지와 부화 선택의 항체 (이상적으로, 안티 - 안티 - CD9 CD63 또는 항 CD81). 로 5 단계에서 설명한 세척 버퍼에있는 exosome - 비드 단지 두 번 씻으십시오. </li><li> 300 μl 세척 버퍼를 추가하고 유동세포계측법을 사용하여 데이터를 취득. </li></ol> 설명한대로 위에서 다른 구슬들은 다음과 같은 프로토콜이나 자기 구슬에 설명​​된 라텍스 구슬로 사용할 수 있습니다. 자석 구슬 대신 사용하는 경우 프로토콜이 약간 다르다는 것을,주의하시기 바랍니다. 차단 단계 (4 점)가 필요되지 않고 세척 대신 원심 분리의 자기 스탠드에 튜브를 삽입하여 수행됩니다. "수제"항체 코팅 비즈에 사용되는 저장 버퍼는 0.1 % 글리신 및 7.2의 산도와 PBS에 azid 0.1 %의 나트륨이 포함되어 있습니다. 중요한 것은 어떤을 피하기 위해, 유동세포계측법 세척 버퍼 (PBS에 혈청 1-3%)에 대한 exosome 고갈 혈청을 사용해야합니다분석을 오염 혈청 exosomes. 참고; 항체 결합 구슬을 사용하여 exosome 특성화를 수행할 때 그것은 격리 및 특징입니다 사용되는 항체에 대한 구체적인 특정 subpopulation,임을 인정하는 것이 중요합니다. 4. 서양 얼룩으로 Exosome 검출 서양 얼룩은 물론 기존의 방법이며 우리는 그 방법 자체에 관한 세부 사항에 들어가지만, 서양 얼룩 및 사용 다른 항체 전에 적당한 단백질 분리의 중요성에 초점을하지 않습니다. <ol><li> 선택의 단백질 용해 버퍼에 exosome 펠렛을 해산하고 와동 - 믹싱 다음, 철저 pipetting. 더욱 exosomes을 lyse하려면 물 목욕 3 샘플을 sonicate 사이에 와동 - 믹싱과 X 5 분 거리에 있습니다. 마지막으로 상온에서 5 분, 13 000 XG를 샘플을 원심, 새로운 eppendorf 튜브에 뜨는을 전송. </li><li> 현 대 적 인선택의 방법에 의해 총 단백질을 다시하고 당 잘 단백질의 20-50 μg을로드합니다. </li><li> 별도의 겔 전기 영동과 electroblotting하여 단백질을 전송합니다. </li><li> 블록과 exosomes에 풍부한 단백질에 대한 immunostaining를 수행하기 전에 막을 씻으십시오. </li><li> chemiluminescence, 디지털 이미징 시스템 및 분석 소프트웨어에 의해 특정 단백질을 감지합니다. </li></ol> 모든 다른 세포 기원부터 exosome 특정 마커, exosomes에 풍부한 아르 단백질은 없습니다로서, 일반적으로 exosome 감지에 사용됩니다. 이들은 같은 tetraspanins (예 : CD9, CD63과 CD81), cytoskeleton 연결 단백질 (예 : ezrin) 및 multivesicular biogenesis (예 : Tsg101 및 alix)에 관여 단백질로 단백질입니다. 또한 일반적으로 exosomes에서 검색된 다른 단백질이 Flotillin, Hsc70 및 다른 rab 단백질 등을하는 것은 그러나, A33 (창자 상피 세포)로 exosomes에서 발견 세포 특정 단백질, 인 경우에는 3 번 CD도 있습니다(T 세포)와 MHC 클래스 II (항원 제시 세포). 따라서 exosomes이 검출을위한 마커에서 출시된 어떤 휴대폰 종류에 따라 달라질 수 있습니다. 세포의 다른 구획도 vesicles를 생산 수 있듯이, 그것은 더 이상 이러한 endoplasmic reticulum (예 : calnexin 및 Grp78)와 잠돌군 Zz 장치 (예 : GM130) 이러한 구획에서 단백질의 존재를 확인하는 것이 좋습니다. 따라서, 이러한 단백질 부족은 연구 샘플에있는 다른 구획의 vesicles 전혀 또는 거의 오염을 나타냅니다 없습니다. 5. exosomal RNA 및 RNA 분석의 분리 <ol><li> 선택의 RNA의 용해 버퍼에 exosome 펠렛을 분해 및 RNA 추출을 수행합니다. 다른 RNA 분리 키트는 하류 실험에 따라 사용하지만, 컬럼 기반의 방법은 RNA의 넓은 스펙트럼과 샘플을 제공하실 수 있습니다. 현재 Exiqon로 miRCURY RNA 격리 키트를 사용하고 있지만, 다른 키트는 SC에 따라 적절한 수 있습니다손을 ientific 질문입니다. </li><li> RNA 분리를 수행할 때 그것은 RNase가없는 환경에서 작업하는 것이 중요합니다. 따라서 핵산과 nuclease 무료 피펫 팁을 사용하여 오염 물질과 RNases에서 무료로 벤치와 장비 모두를 닦으십시오. </li><li> RNA 분리에 대한, miRCURY RNA 격리 키트를 사용하여 용해 용액 350 μl의 exosome 펠렛을 해산하고 15 초 동안 와동 - 혼합을 수행합니다. </li><li> 95 %의 에탄올과 10 초 와동 - 혼합 200 μl를 추가합니다. </li><li> 컬렉션 튜브에 열을 놓고 열 lysed exosomes을 전송 14 000 X G.에서 1 분 원심 </li><li> 14 000 X G.에서 1 분 exosomal RNA와 원심 분리기를 포함하는 컬럼에 씻으 솔루션 400 μl를 추가하여 세 번 씻으십시오 </li><li> 컬럼이 건조하고 RNase없는 eppendorf 튜브의 건조한 열을 곳이 있는지 확인하기 위해 XG 14 000에서 2 분 동안 열을 원심. </li><li> 2 열 및 원심 50 μl 용출 버퍼를 추가합니다 200 XG에 분 14 000 X G.에서 일분 뒤에 </li><li> 분리된 RNA를 계속하거나 -80에 저장 ° C. </li></ol> 압축을 푼 총 exosomal RNA의 검출 및 분석, RNA 6000 나노 또는 RNA 6000 피코 키트와 애질런트 2100 Bioanalyzer를 사용합니다. 분석 exosomal RNA 수율 및 크기 분포를 보여줍니다. 6. 대표 결과 Exosomes 사용할 수 유동세포계측법 방법에 의해 감지가 너무 작아 있으며, 따라서 (그림 1) 분석되기 전에 항체 - 코팅 구슬에 붙어 있습니다. exosome - 구슬 단지가 집계 가능한 유동세포계측법의 분산형 줄거리는 싱글, 더블, 트리플 구슬의 다른 인구 (그림 2A)을 포함할 수 있습니다. 화살표는 더 분석하는 하나의 구슬을 나타냅니다. 의 isotype 제어에 비해 CD63 양성 단일 비드 - exosome 인구는 그림 2B에 표시됩니다. e_content은 "exosomes의 작은 크기로&gt; 때문에, 그들은 그저 가벼운 현미경에 의한 전자 현미경 직접 시각되고, 수 없습니다. exosomes의 전형적인 형태학의 특성이 원형 모양 30-100 nm의 크기의 멤브레인 vesicles 있습니다. 그림 3, 전자 현미경에서 사진 exosomes은 CD63에 대한 골드 라벨 항체 (화살표로 표시)과 비 immunostained exosomes (B)와 (A) immunostained 보여줍니다. 격리 vesicles 실제로 exosomes 것을 확인하고 더욱 exosomal 단백질을 특성화하기 위해 서양의 얼룩은 일반적으로 사용됩니다. 그림 4 calnexin, endoplasmic reticulum의 마커의 부재를 보여줍니다. 이것은 endoplasmic reticulum에서 vesicles 거의 오염을 나타냅니다. 또한, 그림 4는 일반적으로 exosomes의 풍부한 tetraspanin입니다 exosomes에서 CD81의 presences를 보여줍니다. 세포 RN​​A는 주로 포함되어 있습니다Bioanalyzer 분석 (그림 5A)에서 18S rRNA와 28S subunits에 대한 두 눈에 띄는 봉우리로 볼 수의 ribosomal RNA (rRNA). exosomes는 두 rRNA의 봉우리 (18S와 28S)을 부족과 같은 mRNA와 miRNA (그림 5B)로 짧은 RNA에 풍부한 아르 그러나 exosomal RNA 자신의 프로필에서 다릅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 유동세포계측법로 분석하면 exosomes (30-100 nm의)의 작은 크기로 인해, 그들은 소음과 배경에서 구분할 수 없습니다. 따라서 다음 레이저로 시각 수있는 exosomes가 분석되기 전에 항체 코팅 구슬로 그들을 첨부할 필요가 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 복잡한가 서로 양식을 더블, 트리플 구슬로 집계 수 exosome - 구슬 (A). 화살표는 단일 비드 - 엑소을 보여주는 것입니다 문이 추가적인 분석에 사용되는 몇 가지 인구. 이 인구는 직접 exosomes의 멤브레인 분자의 존재를 확인하기 위해 isotype 제어 (채워진 회색 피크)에 비해 것입니다. CD63 양성 exosomes는 (블랙 오픈 피크) 그림 B에 표시됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 일반적인 형태 및 크기 (40-80 nm의) (A와 B)과 exosomes의 전자 micrographs. 그림에서 화살표는이 exosome는 막 표면에 CD63이 있는지 확인, 보조 항체의 황금 입자를 나타냅니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. endoplasmic reticulum 단백질 calnexin의 부재하지만, 일반적으로 exosomes, tetraspanin CD81에 풍부한 단백질의 존재를 보여주는 서양 얼룩 결과입니다. ve_content "&gt; <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 5"> 그림 5. 전지 (A)과 exosomes (B)에 존재 RNA를 보여주는 Bioanalyzer 결과입니다. 화살표는 18S와 28S를 나타냅니다 rRNA의 subunits는 세포에 존재. exosomal RNA 남성이 작은 RNA를 포함하는으로 아무거나 작은 rRNA는 exosomes에서 확인되지 않습니다.

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</ol>

JL은 세포에 RNA의 전송을위한 벡터로 exosomes의 활용에 관한 특허의 공동 소유자이다.

분자 컨텐츠 및 / 또는 exosomes의 기능을 공부하면 적절한 수율 및 오염의 가장 낮은 가능한 학위를 제공하는 우수한 품질의 절연 방법을 사용하는 데있어 매우 중요합니다. 이 문서에서 설명하는 방법론 exosomes를 분리하고 RNA 내용 및 생물 학적 기능을 연구하기 위해 설립 잘 접근이다. 또한, 전자 현미경, 유동세포계측법, 그리고 서양의 얼룩을 포함하여 서로 다른 방식의 조합에 의해 격리 exosomes의 특성의 중요성이 강조 표시됩니다. exosomes를 분리하면, 최초의 원심 분리 단계 (300 XG)은 세포 현탁액 또는 공부 생물 학적 액체에 존재있을 펠렛 전지하는 데 사용됩니다. 16 500 XG의 요구에 두 번째 원심 분리는 펠렛 죽은 세포, 큰 파편, apoptotic 기관 및 기타 organelles 충분히 강해 져야합니다. 이 원심 분리 후, 일부 프로토콜은 나노 여과 단계지만, 몇 가지 인보이스를 포함estigators이 단계를 제외했습니다. 그러나, 우리는 근절 파편 200 NM보다 크고 따라서 강력하게 여과 단계를 포함시키는 것이 좋습니다 vesicles의 중요성을 강조. 더 엄격한 격리가 필요한 경우, 100 nm의 필터를 사용하지만, 점성 유체를 사용하는 경우 이러한 필터가 쉽게 차단하고 exosomal 자료가 손실 될 수 있습니다 수 있습니다. 또한, 100 nm의 여과는 exosomes의 형태에 영향을 미칠 수 있으며 exosomes가 큰 규모로하는 경우뿐만 아니라 그들은 손실될 수 있습니다. 따라서 200 nm의 필터는 exosome 격리에 적합한 것 같습니다. 여과 후, 120,000 XG에서 필수 ultracentrifugation는 펠렛 exosomes하는 데 사용됩니다. exosomes는 더욱 항체 코팅 구슬에 바인딩하고 씻어, 또는 오염 물질의 단백질을 제거하는 자당 기울기에 위치, PBS로 씻어하실 수 있습니다. 시작 샘플 볼륨이 작은 및 / 또는 RNA 내용 O 특히 경우에는, 이것은 우리가 필요하지 않는 주장은 매우 리소스를 소모 과정 수추가 단계가 실질적으로 더 자료를 저하되므로 F exosomes가 낮습니다. 그러나, 다시 절연 vesicles의 특성은 특정 단백질의 존재와 부재에 의해 입증되어야합니다. 지금까지 exosomes에 대한 절대적으로 고유한 단백질 마커는 샘플 exosomes 진통제가 포함되어 있는지 확인하기 위해 확인되지 않았습니다. 따라서, 방법의 조합은 크기와 전자 현미경에 의해 exosomes의 형태의 결정을 포함하여 exosomes을 특성화해야합니다. 이 방법은 같은 microparticles, apoptotic 기관이나 세포 파편으로 큰 vesicles와 예를 들어 샘플의 오염 수준의 개요를 제공할 수로 또한, 시료의 순도는 전자 현미경에 의해 결정하실 수 있습니다. 또한 exosomes의 단백질 내용은 유동세포계측법과 서양 얼룩에 의해 결정 될 수 있으며, 모두 막의 분석에서 이러한 두 가지 방법 결과의 조합 (예 : CD63을 구속하고exosomes의 CD81)와 내면 단백질 (예 : Tsg101 및 alix). 이러한 CD63, Tsg101 및 alix, 그리고 endoplasmic reticulum 단백질 calnexin로 단백질의 부재로 exosomes에 풍부한 단백질의 탐지, exosome 풍부한 펠렛은 실제로 exosomes과 세포의 다른 구획에서하지 오염 vesicles는 것을 나타냅니다. exosomes에서 감지되는 RNA의 프로필이 손상 세포에서 발견 RNA의에 근본적으로 다릅니다. 따라서 Bioanalyzer 또는 겔 기반의 RNA 분석 방식에 분석 exosomal RNA는 세포의 RNA 분석 저명한있는 18S rRNA와 28S subunits에 대한 두 봉우리 부족합니다. 따라서 샘플에서 rRNA의 상당한 양의 검출은 절연 방법 개선과 품질을 보장​​해야 할 것을 따라서 추출한 총 RNA 혼자 exosomal 원산지되지 않았음을 나타냅니다, 그리고 주장한다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 (옵션) </td></tr><tr><td> Exosome 격리 </td></tr><tr><td> Optima L - 90K의 초원 심 분리기 </td><td> 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 65,670 </td><td></td></tr><tr><td> 빠른 시일 초원 심 분리기 튜브 </td><td> 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td></td><td> 회전자에 따라 사용하는 다른 튜브가 필요합니다. Ti70 (342414), Ti45 (345776) </td></tr><tr><td> 빠른 - 인감 무선 튜브 토퍼 키트 </td><td> 베크 만 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 </td><td> 358,312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur 주사기 필터, 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> 에 대한 VWR 인터내셔널에서 viscose 유체 및 / 또는 대용량, 진공 여과 시스템, 0.2 μm의은 (514-0600) 대신 사용할 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 전자 현미경 </td></tr><tr><td> Formvar / 탄소 코팅 니켈 그리드 </td><td> 테드 펠라 Inc의 </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> 마우스 안티 인간 CD63 </td><td> Bioscience BD </td><td> 556,019 </td><td> 최종 conc : 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Isotype 제어, IgG1κ (MOPC 21) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M9269 </td><td> 최종 conc : 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> 안티 - 마우스 IgG 골드 공액, 10 NM </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G7777 </td><td> 최종 conc : 1 % </td></tr><tr><td> LEO 912AB 오메가 전자 현미경 </td><td> 칼 자이스 혈구 국세청 </td><td></td><td> 또는 동급 장비. </td></tr><tr><td> 유동세포계측법 </td></tr><tr><td> 4μm aldehyd / 황산염 라텍스 비즈 </td><td> 계면 역학 </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> 라텍스 구슬 코팅에 대한 항체 </td><td></td><td></td><td> Bioscience BD (556019)에서 예를 들어 안티 CD63에 대한 </td></tr><tr><td> Intelli - 믹서 RM - 2L </td><td> ELMI </td><td></td><td> 또는 동급 장비. </td></tr><tr><td> 인간의 혈청에서 IgG </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> 검출에 대한 항체 </td><td> Bioscience BD </td><td></td><td> 예를 들면 다음과 같습니다 PE 방지 CD63 (556020) PE 안티 CD9 (555372) PE 안티 CD81 (555676) Isotype 제어 (555749) </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td> Bioscience BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 서양 얼룩 </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 DH </td><td> 앨마 </td><td></td><td> 또는 동급 장비. </td></tr><tr><td> exosomal RNA 및 RNA 분석의 분리 </td></tr><tr><td> miRCURY RNA 격리 키트 </td><td> Exiqon A / S </td><td> 300,110 </td><td></td></tr><tr><td> 애질런트 2100 Bioanalyzer </td><td> 애질런트 테크놀로지 </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

rna 함유 exosomes의 분리 및 특성

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

exosome 연구 분야는 급속하게 최근 몇 년 동안 출판에 극적인 증가, 확장됩니다. endocytic 원산지 이러한 작은 vesicles (30-100 NM)는 첫번째 적혈구 한으로 자라고있는 동안 reticulocytes는 트랜스페린 수용체를 근절하기위한 방법으로 함수를 제안했고, 나중에 exosomes를 선정되었습니다. Exosomes는 multivesicular 기관 (MVBs)를 생산, endosomes 후반의 신진 안쪽에 의해 형성되며, 플라즈마 막 2 MVBs의 융합에 의해 환경에 발표됩니다. exosomes의 첫 발견 이래, 세포의 광범위한 이러한 vesicles 발표 보여왔다. Exosomes 또한 플라즈마, 코와 세척 유체, 타액과 모유 3-6 포함한 여러 생물 학적 체액에서 발견되었습니다. 또한, 그것은 exosomes의 내용과 기능은 원래 세포와 그들이 생산되는 아래의 조건에 따라 해당 증명되었습니다. 기능의 다양한 귀신을했습니다이러한 알레르기 항원 7,8, 마우스 9, T 세포 규제 13, T 세포 증식 14 자극으로 자연 킬러 세포의 억제 및 활성화 10-12, 분화 촉진 설립 종양의 근절에 대한 내성의 유도로 exosomes, 그리고 대한 trated 15 apoptosis T 세포의 유도. 2007 년 우리는 마스트 세포에서 발표 exosomes 메신저 RNA (mRNA)와 microRNA (miRNA)를 포함하고 RNA는 세포 하나에서 exosomes를 통해 다른 shuttled 수있다는 것을 보여주었다. 받는 사람 세포에서 exosomes로 shuttled mRNA는 RNA 양도 16 규제 기능을 제안, 단백질로 번역되는 표시했다. 또한, 우리는 또한 산화 스트레스가 성장 세포에서 파생된 exosomes받는 사람 세포에 대한 스트레스에 대한 내성을 유발하기 때문에 exosomal 셔틀 RNA 17 생물 학적 기능을 제안할 수 것으로 나타났습니다. 세포 배양 매체와 생물 학적 유체의 공동vesicles의 혼합물을 ntain과 조각을 창고. exosomes을위한 고품질의 절연 방식은, 특성화 및 exosomes과 콘텐츠의 식별 다음, 따라서 다른 vesicles과 입자의 exosomes를 구별하는 데있어 매우 중요합니다. 여기, 우리는 세포 배양 매체와 체액 모두에서 exosomes의 고립을위한 방법을 제시한다. 이 분리 방법은 exosomes이 pelleted하는 최종 ultracentrifugation 단계 다음 반복 원심 분리 및 여과 단계에 따라 달라집니다. exosomes를 식별하고 exosomal 형태 및 단백질 함량을 특성화하는 것이 중요합니다 방법은 전자 현미경, 유동세포계측법 및 서양 얼룩을 포함하여 강조 표시됩니다. 전체 exosomal RNA의 정화는 스핀 칼럼 크로마 토그래피에 기반하고 exosomal RNA 수율 및 크기 분포는 Bioanalyzer를 사용하여 분석합니다.

본 논문은 격리, 정화 및 exosomes의 감지,뿐만 아니라 분자의 콘텐츠 분석 기술에 대한 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 세포 배양 매체와 생물 학적 체액 모두에서 exosome 고립에 대한 적응력, 그리고 분자 내용의 분석을 넘어도 기능성 연구에 유용할 수 있습니다.

RNA 함유 Exosomes의 분리 및 특성

엑소좀 연구 분야는 최근 몇 년 사이 출판물 수가 급격히 증가하며 빠르게 확장되고 있습니다. 이 작은 소포체(30-100 nm)는 ...

다음 실험의 전반적인 목적은 관심 대상인 세포 및 생체 시료 내의 생물학적 액체가 엑소좀을 포함하는 RNA를 방출하거나 포함하고 있는지 확인하는 것입니다. 엑소좀을 분리하기 위한 첫 번째 단계는 세포와 세포 파편을 제거하는 것입니다. 그 다음, 상층액을 필터링하여 더 큰 입자들을 제거합니다.그 다음 두 번째 단계로 초원심분리를 통해 엑소좀을 펠렛화합니다. 분리된 소포체가 엑소좀의 형태, 크기 및 단백질 조성을 가지고 있음을 보여주기 위해 전자현미경, 유세포 분석 및 웨스턴 블롯 분석으로 엑소좀의 특성을 분석합니다. 이어서 정제된 엑소좀으로부터 RNA를 분리합니다.엑소좀이 어떤 RNA를 함유하고 있는지 결정하기 위해, 확립된 엑소좀 정제, 검출 및 특성 분석 방법으로 얻은 결과는 엑소좀의 생물학적 기능과 같은 추가적인 연구를 촉진할 수 있습니다. 따라서 본 발표에서는 다양한 방법으로 엑소좀을 분리하는 방법을 보여줄 예정이며, 발표를 진행할 두 사람은 저의 박사 과정 학생인 Maria와 Cecelia입니다. 행운을 빕니다.엑소좀 분리 절차를 시작하기 위해, 이번 엑소좀 분리 시연에서는 인간 비만세포주인 HC one을 사용합니다. 먼저, 엑소좀이 제거된 혈청이 포함된 배지에서 세포를 배양합니다. 그다음, 세포 현탁액을 원추형 튜브로 옮기고 4°C에서 300 ×g로 10분 동안 원심분리합니다.세포를 펠렛화하기 위해 상층액을 초원심분리 튜브로 옮기고, 4°C에서 16,500 ×g로 20분 동안 원심분리하여 세포와 세포 파편을 추가로 제거합니다. 다음으로, 0.2 µm 필터로 상층액을 여과하여 200 nm보다 큰 입자들을 추가로 제거합니다. 마지막으로, 여과된 상층액이 담긴 초원심분리 튜브를 밀봉하고 4°C에서 120,000 ×g로 70분 동안 초원심분리하여 엑소좀을 펠렛화합니다.초원심분리관을 절단하여 개봉한 후, 상층액은 버리고 엑소좀이 농축된 펠렛을 재현탁하여 엑소좀을 회수합니다. 엑소좀 회수율을 극대화하려면, 적절한 완충액의 소량만을 사용하여 엑소좀 농축 펠렛을 엔도어프(eend orph) 튜브 내에서 반복적으로 재현탁하십시오.이전과 동일한 부피의 버퍼로 두 번 헹굽니다. 버퍼는 엑소좀 분리 이후 진행될 실험의 종류에 따라 달라집니다. 전자 현미경 관찰의 경우, 손상되지 않은 엑소좀에서 약 10 micrograms의 엑소좀 단백질을 사용하십시오.PBS로 재부유를 수행하였습니다. 엑소좀은 크기와 형태만으로 식별이 가능하므로, 탄소 코팅된 니켈 그리드 전자현미경 관찰 시 면역염색 없이도 수행할 수 있습니다. 다만, anti CD 63 또는 anti MHC Class two와 같은 1차 항체를 사용한 후, 10 nm 금 표지 2차 항체를 사용하는 것이 권장됩니다.엑소좀은 현재의 유세포 분석 장비로 검출하기에는 크기가 너무 작기 때문에, 먼저 엑소좀을 항체가 코팅된 비드에 결합시켜야 합니다. 엑소좀의 세포 기원에 따라 자성 비드 또는 라텍스 비드에 서로 다른 항체가 결합됩니다. 본 시연에서는 각 샘플에 대해 anti CD 63이 코팅된 라텍스 비드를 사용합니다.손상되지 않은 엑소좀의 엑소좀 단백질 30~40 µg에 해당하는 부피를 사용하십시오. PBS에 부유시킨 엑소좀을 비드와 함께 4 °C에서 부드럽게 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 200 mM glycine 300 µL를 첨가하여 블로킹하고 30분 동안 배양합니다.엑소좀 비드 복합체를 세척 버퍼로 2회 세척하고, 4°C에서 50 µL의 IgG 항체와 함께 엑소좀 비드 복합체를 인큐베이션합니다. 엑소좀 비드 복합체를 2회 세척한 후, 세척 버퍼 90 µL와 선택한 항체 10 µL를 엑소좀 비드 복합체에 첨가하고 암소에서 40분 동안 인큐베이션합니다. 부드럽게 흔들어주며 엑소좀 비드 복합체를 2회 세척하고, 세척 버퍼 300 µL를 첨가한 뒤 샘플을 유세포 분석 튜브로 옮겨 유세포 분석기로 데이터를 획득합니다.본 웨스턴 블롯 시연에서는 웨스턴 블롯 전 적절한 단백질 분리의 중요성과 사용되는 다양한 항체에 초점을 맞춥니다. 엑소좀 펠렛을 선택한 단백질 용해 버퍼에 녹인 후, 파이펫으로 충분히 섞고 볼텍스 믹싱하여 엑소좀을 더욱 용해시키십시오. 시료를 워터 배스에서 초음파 처리하고, 13,000 ×g에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 새로운 마이크로 튜브로 옮깁니다. 선택한 방법으로 총 단백질량을 측정하고 단백질을 젤에 로딩하십시오.그 후 젤 전기영동과 전기 블로팅을 통해 단백질을 분리 및 전이시키고, 엑소좀 특이적 마커가 없으므로 엑소좀에 농축된 단백질에 대한 면역염색을 수행하기 전에 멤브레인을 블로킹하고 세척합니다. 모든 서로 다른 세포 기원의 엑소좀에 농축된 단백질들이 일반적으로 엑소좀 검출에 사용됩니다. 이러한 단백질로는 테트라스파닌(tetraspanins), 예를 들어 CD9, CD63, CD81 등이 있습니다.ezrin과 같은 세포골격 관련 단백질과 TSG 1 0 1 및 LY와 같은 다소포체 생합성 관련 단백질을 확인하며, 음성 대조군으로는 소포체 유래의 kexin 및 GRP 78과 같이 다른 구획의 소포에서 흔히 발견되는 오염 단백질을 확인합니다. 계획된 실험에 따라 서로 다른 RNA 분리 키트를 사용할 수 있습니다. 본 시연에서는 RNA 분리 시 컬럼 기반 방법을 사용합니다.핵산 및 뉴클레아제 프리 피펫 팁을 사용하고, 벤치와 장비 모두 오염물질과 RNA가 없도록 닦아내는 것이 중요합니다. 엑소좀 펠렛을 350 µL의 용해액에 녹인 후 샘플을 볼텍싱합니다. 95% 에탄올 200 µL를 첨가하고 볼텍스를 사용하여 혼합합니다.컬렉션 튜브에 컬럼을 배치하고 용해된 엑소좀을 컬럼으로 옮긴 후 원심분리합니다. 컬럼이 완전히 건조되도록 400 µL의 세척액으로 3회 세척합니다. 마지막 세척 후 14,000 ×g에서 2분 동안 원심분리하고, 건조된 컬럼을 RNase-free 튜브에 넣습니다. 추출된 총 엑소좀 RNA의 검출 및 분석을 위해 50 µL의 용출 버퍼로 RNA를 용출합니다.엑소좀은 기존의 유세포 분석법으로는 검출하기에 크기가 너무 작기 때문에, RNA 6,000 nano 또는 RNA 6,000 pico 키트를 사용하여 Agilent 2100 bioanalyzer로 분석할 수 있습니다. 엑소좀은 분석 전 항체 코팅 비드에 부착됩니다. 이러한 엑소좀-비드 복합체는 응집될 수 있으므로, 유세포 분석 산점도에는 단일, 이중 및 삼중 엑소좀-비드 복합체로 구성된 서로 다른 집단이 포함될 수 있습니다.여기서 보는 바와 같이, 화살표는 단일 엑소좀 비드 복합체 집단을 나타내며, 이 집단이 추가 분석 대상이 됩니다. 유세포 분석 히스토그램은 CD 63 단백질에 대해 양성인 단일 엑소좀 비드 집단을 보여줍니다. 개방형 곡선이 오른쪽으로 치우칠수록 샘플의 CD 63 양성 반응이 더 강함을 의미합니다.엑소좀은 크기가 매우 작기 때문에 전자현미경으로만 시각화할 수 있습니다. 엑소좀의 전형적인 형태학적 특성은 30에서 100 nanometer 크기의 둥근 모양의 소포체입니다. CD 63에 대한 금 표지 항체를 이용한 엑소좀 면역 염색 결과가 화살표로 표시된 Western blot에 나타나 있습니다.결과에 따르면 엑소좀 샘플에서 소포체 단백질인 calnexin은 검출되지 않았으나, 엑소좀에 일반적으로 풍부하게 존재하는 단백질인 테트라스파닌 CD81은 검출되었습니다. 세포 RNA는 주로 리보솜 RNA를 포함하고 있으며, 본 바이오어낼라이저 분석에서는 왼쪽의 18 s 리보솜 RNA 하위 단위와 오른쪽의 28 s 하위 단위를 나타내는 두 개의 피크로 확인됩니다. 반면, 엑소좀 RNA는 리보솜 RNA를 거의 또는 전혀 포함하지 않고 messenger RNA 및 micro RNA와 같은 짧은 RNA가 풍부하다는 점에서 프로파일이 다릅니다.정확하게 수행한다면 약 3시간 만에 분리할 수 있습니다. 이 방법을 사용할 때는 더 큰 입자들의 오염을 방지하기 위해 비여과 단계를 포함한 모든 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 이 기술이 개발된 이후, 엑소좀을 생화학적으로나 생물학적으로 특성화하는 것이 훨씬 더 쉬워졌습니다.또한, 우리는 다양한 시스템에서 엑소좀 매개 세포 간 통신에 대해 훨씬 더 많은 것을 배우게 되었습니다. 아울러, 이 기술을 통해 다양한 질병에 대한 바이오마커로서 엑소좀을 개발하는 것이 가능해졌습니다. 경청해 주셔서 감사합니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

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인간 면역결핍 바이러스(HIV) 입자에서 엑소좀을 분리하는 그래디언트 절차를 설명하는 기술을 설명합니다. 이 절차는 HIV에 감염된 사람의 인간 혈장에 있는 HIV 입자로부터 엑소좀을 분리하는 데 사용되었습니다. 분리된 엑소좀은 사이토카인/케모카인 함량을 분석했습니다.

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담즙액은 잠재적으로 중요한 바이오마커를 포함하는 세포 외 소포체/엑소좀의 귀중한 공급원입니다. 이 프로토콜은 miRNA 프로파일링을 포함한 추가 분석을 위해 인간 담즙에서 엑소좀을 분리하는 강력한 방법을 나타냅니다.

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Endogenously 구성 된 mRNA 단백질 복합물의 복구에 대 한 협동 RNA 격리 절차 (여행) 설명 되어 있습니다. 특히, RNA-단백질 복합물 가교 된에서 vivo에서, polyadenylated RNAs는 격리 oligo(dT) 구슬, 추출 물 이며 특정 한 mRNAs와 수정 된 RNA 센스 oligonucleotides 캡처됩니다. 단백질 mRNAs에 바인딩된 immunoblot 분석에 의해 검색 됩니다.

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여기, 두 세포 외 기 격리 프로토콜, 한 원심 분리 및 밀도 그라데이션 원심 분리, extracellular 소포 murine bronchoalveolar 게 액체 샘플에서 분리 된 ultracentrifugation 설명 합니다. 두 방법으로 murine bronchoalveolar 게 액체에서 파생 된 세포 외 소포는 계량 하 고 특징.

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