Name: 종양 세포의 Vasculogenic 활동을 평가 Matrigel 기반 튜브 형성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min
Description: 배우세요 Matrigel 튜브 형성 분석을 통해 종양 세포의 혈관 형성 활동을 평가하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 암 연구에서 세포의 혈관화 잠재력을 측정하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 NCI R01 CA120659 (RS)에 의해 지원되었다.

1. 종양 세포의 Vasculogenic 활동을 평가 Matrigel 기반 튜브 형성 분석 <ol><li> 종양 세포 및 microvascular 내피 세포의 준비 같은 U87 세포, 흑색증 세포 B16F1, 유방 암 MDA - MB - 435, 그리고 결장 세포 HCT116과 같은 뇌 종양 세포는 (10 % FBS 및 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 DMEM에서 재배되었다 Invitrogen에서 ). 내피 세포주 인간 microvascular 내피 세포 (HMVECs은) 1 μg / ML 하이드로코티손 1 NG / ML 표피 성장 인자 10 % FBS 및 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충 EBM2 중간 (Lonza)에 교양되었습니다. 세포는 PBS로 세 번 씻어와 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Invitrogen)로 분리되었다. 5 분 2,000 RPM과 원심 분리 후 세포 펠렛은 PBS로 다시 씻어되었습니다. 그런 다음 pelleted 전지는 hemocytometer로 집계되었다. </li><li> Matrigel 준비 : 성장 인자 - 나누어지는 감소 Matrigel이 (BD Bioscience) 실온에서 예열했다. 완전히 해동되기 전에, 그것은 얼음에 양도했고 그 액체는 적어도 10 분 얼음에 보관했다. 다음 Matrigel 50 μl가 Matrigel가 균일하게 배포 수있는 수평 레벨에서 96 - 웰 플레이트에 도금 및 37 ° C. 30 분 incubated되었습니다 </li><li> 튜브 형성 : 세포 (1-2 X 10 4)이 내피 세포 종양 세포 또는 EBM - 2 혈청 무료 DMEM으로 다시 중단하고, Matrigel의 위에 적재했다. 이 분석은 가느다란 관 개발에 일부 요원들의 효과를 측정에 사용되는 경우,이 요원 (stimulators 또는 억제제)은 혈청이없는 매체에 추가되었습니다. 각 조건 그룹은 4-6 우물이 포함되어 있습니다. </li><li> 이미지 및 데이터 분석 : 37에서 다음과 부화 ° C 야간 각 잘가 현미경으로 직접 분석했다. tubules가 고정에 필요한이라면 10 % 포르말린 생리 기반 솔루션 100 μl가 부드럽게 추가되었습니다 십 분 후, 분석을 위해 준비했습니다. 10X 위상 대조 현미경, 각 분야의 tubules이 몇 군데 있었다 각 우물에 3-5 임의의 분야에서 tubules의 평균이 계산되었습니다. </li></ol> 2. 대표 결과 : 이러한 tubules가 다각형 네트워크를 형성 연결 명확한 길쭉한 세포 기관에서 개발된 것처럼 HMVECs은 긍정적인 제어로 사용되었습니다. B16F1, U87, 그리고 MDA - MB - 435 세포에 의해 형성 HMVECs 비슷한 혈관 tubules을 개발하지만, HCT116 세포는 (그림 1)하지 않았다. 세포 투여량에 의존 튜브 형성 U87 세포에서 테스트되었습니다. 그림 2에서 보여주 10,000 전지는 중단 tubules을 형성. 세포가 두 배가되었습니다되면 고체 혈관 네트워크 HMVECs에서 본 것과 비교했다. 대조적으로, 5,000 이하 세포는 혈관 표현형를 형성하지 못했습니다. <img src="/files/ftp_upload/3040/3040fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. HMVECs, U87, MDA - MB - 435과 B16F1 세포에 의해 유도하지만, HCT116 세포. 모든 세포는 (2 × 10 4) Matrigel에 적재하고 하룻밤 incubated되지 않았습니다 튜브 형성. Tubules는 위상 콘트라스트를 사용하여 몇 군데 있었다. HMVECs은 긍정적인 제어로 사용되었습니다. 3-5 분야의 대표가 표시되었다. 바 : 100 μm의. <img src="/files/ftp_upload/3040/3040fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 휴대폰 번호 종속적인 방식으로 그림 2. U87 세포 유발 tubules.로서 모서리에 표시된 U87 세포의 서로 다른 숫자는 튜브 형성을 위해 사용되었습니다. HMVECs은 긍정적인 제어에 사용되었다. 바 : 100mm.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

성공이 분석하기 위해서, Matrigel의 품질 먼저 테스트해야합니다. 작은 샘플 HMVECs를 사용하여 분석을 미리 실행 Bioscience BD에서 구할 수 있습니다. 다른 배치 제품은 일부 많은 튜브 형성을위한 최적의 조건을 제공하지 않는에 ...와 비슷하지 않은 자질을 표시할 수 있습니다. Matrigel의 나누어지는가 96 - 웰 플레이트에 로드할 때 거품이 가느다란 관 형성을 방해 할 수 있기 때문에 둘째, 모든 거품은 피해야한다. 작은 거품이 잘 발견하는 경우, Matrigel은 즉시 실험 도중 얼음에 보관해야합니다 원래 Matrigel 튜브로 다시 이동할 수 있습니다. 또한, 테스트 전지 로그 단계에서 성장률 유지되어야합니다. 세포의 느린 성장을 나타내는 어떤 교양 조건이 발생하면, 그들은 건강한 세포로 대체해야합니다. 감소 온도 (실온)는 튜브 형성에 영향을 미칠 수 있기 때문에 튜브가 해결되지 않은 경우 마지막으로, 현미경으로 튜브의 분석을 한 시간보다 더 이상이어야합니다. 전체 분석은 세포 죽음으로 유도 관...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11,995 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> 성장 인자 - 할인 Matrigel </td><td> Bioscience BD </td><td> 47743-720 </td></tr><tr><td> EBM2 키트 </td><td> Lonza </td><td> CC - 3156 </td></tr><tr><td> 니콘 이클립스 TS100 현미경 </td><td> 니콘 </td><td></td></tr></tbody></table>

종양 세포의 vasculogenic 활동을 평가 matrigel 기반 튜브 형성 분석

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

지난 몇 년간, 튜브 형성 분석 성장을 사용하는 인자 - 감소 Matrigel 일반적으로 체외 1-5에서 혈관 내피 세포의 angiogenic 활동을 입증하기 위해 채용되었습니다. 그러나, 최근에 성장 증거는이 분석은 내피 세포에 대한 혈관 동작을 테스트하기 위해 제한 아니라는 것을 보여주었다. 대신, 그것은 또한 혈관 표현형 6-8을 개발하는 종양 세포의 숫자의 능력을 테스트하는 데 사용되었습니다. 이 기능은 xenotransplanted 동물, vasculogenic 흉내 (VM) 9라는 과정에서 확인된 그들의 vasculogenic 행동과 일치했다. 그 종양 세포 매개의 VM이 내피 세포 angiogenesis 6, 10-13의 독립 종양 개발에 중요한 역할을 보여주는 증거 다수가있다. 예를 들어, 종양 세포는 흑색증 및 glioblastoma 환자 8, 10, 11 조직 샘플에서 혈액 perfused, 혈관 채널 형성에 참여하는 발견되었습니다. 여기, 우리는 종양 세포의 vasculogenic 활동의 평가에 유용한 도구로 관형 네트워크 분석을 설명했다. 우리는 이러한 흑색증 B16F1 세포, glioblastoma U87 세포와 유방암 MDA - MB - 435 세포와 같은 일부 종양 세포 라인 혈관 tubules를 형성 할 수있다는 사실을 발견했다,하지만 일부는 결장암 HCT116 세포와 같은하지 않습니다. 또한,이 혈관 표현형는 Matrigel에 도금 휴대폰 번호에 따라 좌우됩니다. 따라서이 분석은 혈관 세포, 종양 세포뿐만 아니라 다른 세포를 포함한 세포 유형의 다양한 혈관 가능성을 화면에 강력한 유틸리티로 사용될 수 있습니다.

튜브 형성 분석은 종양 세포의 혈관 활동을 평가하는 데 사용됩니다.

종양 세포의 Vasculogenic 활동을 평가 Matrigel 기반 튜브 형성 분석

지난 수십 년 동안, 성장 인자가 감소된 Matrigel을 이용한 관 형성 분석(tube formation assay)이 혈관 신생 능력을 입증하기 위해 일반적으로 사용되어 왔습니다.

다음 실험의 전반적인 목적은 in vivo의 혈관 활성을 측정하는 방법으로, 다양한 종양 세포 유형의 in vitro 튜브 형성을 측정하는 것입니다. 이는 튜브 형성을 유도하기 위해 매트리젤(matrigel) 위에 종양 세포를 추가함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로서.Matrigel 상의 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양하여 관 형성이 이루어지도록 합니다. 다음으로, 각 세포 유형에 의해 생성된 관을 이미지화합니다. 각 세포 유형별로 형성된 평균 관 수를 정량화함으로써, 이종 이식 종양 모델을 기반으로 이러한 세포들이 in vivo에서 혈관 구조를 형성할 수 있는 잠재적 능력을 보여주는 결과를 얻습니다.이 방법은 시험관 내(in vitro)에서 혈관 활성을 측정하는 방법과 같이 암 연구 분야의 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 종양 세포를 준비하려면 UAD seven melanoma, B 16 F1 MDA, MB 4 35 또는 colon HCT one 16 세포를 배양하는 것으로 시작하십시오. 10% FBS와 penicillin이 보충된 DMEM에서 배양하십시오. 인간 미세혈관 내피세포(HMVECs 또는 H ECS)는 1 µg/mL hydrocortisone, 1 ng/mL epidermal growth factor, 10% FBS 및 penicillin이 보충된 EBM two 배지에서 배양하십시오.PBS로 세포를 세척한 후, 0.05% trypsin EDTA로 세포를 떼어내고 2000 RRP M에서 5분간 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다. 그 다음 PBS로 다시 세척합니다. 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정하고 Matrigel을 가온하여 준비합니다.성장 인자가 감소된 Matrigel 1 mL를 실온으로 해동합니다. 그 다음 즉시 얼음 위에 10분 동안 둡니다. 96-웰 플레이트의 각 웰에 50 µL씩 피펫으로 분주합니다.플레이트를 37 °C에서 30분 동안 배양하고, 1~2 × 10⁵개의 종양 세포 또는 혈관 내피 세포를 각각 DMEM 또는 eBM2에 재현탁하여 Matrigel 상단에 분주합니다. 시약이 세관 형성에 미치는 영향을 연구하는 경우, 무혈청 배지에 해당 시약을 첨가하여 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이미지 분석을 위해 10% 포르말린 식염수 용액 10 µL를 첨가하고 10분 동안 둡니다.그 다음 10배 대물렌즈가 장착된 위상차 현미경을 사용하여 촬영합니다

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

관 형성 분석법은 시험관 내 혈관 신생을 측정하기위한 신속하고 정량적 방법이다. 내피 세포는 조절 된 미디어와 결합 기저막 추출물에 도금된다. 튜브 형성은 시간 이내에 발생하고 새로 형성된 세관은 쉽게 정량화.

에 대한 내피 세포의 관 형성의 분석<em&gt; 체외</em&gt; 혈관 신생 연구

우리는 암세포가 분비하는 인자 풀의 혈관 형성 가능성을 설명하기 위해 초음파와 내시경이라는 두 가지 상보적인 이미징 방식을 사용하여 마트리겔 플러그 분석을 설명합니다. 세포외 기질(ECM)-모방 겔인 마트리겔(matrigel)은 조건화된 배지(C.M.)로 분비되는 혈관 형성 인자를 숙주(마우스)에 도입하는 데 사용됩니다.

고속 성장하는 종양 생성 세포에 의해 분비 요인에 의해 보충 모니터링 기능 및 혈관의 형태학

이 원고는 통제된 환경에서 내피 세포관 형성을 사용하여 혈관 신생에 대한 주어진 화합물 또는 조건의 효과를 정량화하기 위한 튜브 형성 분석을 설명합니다.

전략적 내피 세포 관 형성의 분석 : 감소 세포 외 매트릭스 세포 외 기질과 성장 인자를 비교

이 종이 여부를 평가 체 외에 고전적인 종양 신생 hemangioblastomas (HBs)와 HBs에서의 역할에 있는 포괄적인 절차를 제공 합니다. 결과 HB neovascularization의 복잡성을 강조 하 고는 것이 좋습니다이 일반적인 형태의 신생 HB neovascularization만 보완 메커니즘.

분석 결과 돋 아 회전 타원 체를 사용 하 여 상 상속 Hemangioblastoma Neovascularization의 생체 외에서 성능을 평가 하는 포괄적인 절차

여기서, 우리는 겔화 된 지하 매트릭스에 튜브 형성 분석을 사용하여 혈관 네트워크 형성에 루타 graveolens의 물 추출물의 효과를 평가한다.

HUVEC 튜브 형성 분석은 혈관 신생에 천연 물의 영향을 평가하기 위해

유도 된 만능 줄기 세포에서 파생 된 내피 전구체 (iPSC-EP)는 심혈관 질환 치료에 혁명을 일으킬 잠재력을 가지고 있으며 보다 충실한 심혈관 질환 모델을 생성 할 수 있습니다. 본 명세서에서, 3차원(3D) 콜라겐 미세환경에서 iPSC-EP의 캡슐화 및 이들 세포의 혈관전위액의 정량적 분석이 기재되어 있다.

iPSC 유래 내피 선조의 혈관 전위를 정량화하는 체외 3D 모델 및 전산 파이프라인

이 분석은 3D 콜라겐 젤에서 배양된 배아체로 분화된 마우스 배아 줄기 세포를 활용하여 시험관 내에서 발아 혈관신생을 제어하는 생물학적 과정을 분석합니다. 이 기술은 약물 테스트, 질병 모델링 및 배아적으로 치명적인 결실의 맥락에서 특정 유전자를 연구하는 데 적용될 수 있습니다.

체외 혈관 질환 모델링 및 약물 검사를 위한 마우스 배아 줄기 세포를 이용한 혈관신생의 3차원 발아 분석

여기에 제시된 방법은 염색 없이 생체 내에서 혈관신생 또는 혈관 투과성에 대한 시약의 효과를 평가할 수 있습니다. 이 방법은 꼬리 정맥을 통한 덱스트란-FITC 주입을 사용하여 신생 혈관 또는 혈관 누출을 시각화합니다.

혈관신생 연구를 위한 수정된 In Vivo Matrix Gel Plug Assay

현재 프로토콜은 영양막 세포와 같은 세포가 세포외 기저막 매트릭스 층에 걸쳐 모세관 같은 구조로 조직되는 고전적인 체외 혈관 형성 분석에서 형성된 튜브와 같은 구조를 복구할 수 있도록 합니다. 회수된 구조는 다양한 생화학 분석을 위한 RNA 및 단백질 분리에 사용됩니다.

분화 마커 발현 분석을 위한 Angiogenesis-Tube Formation Assay에서 영양막 세포 회수

이 연구는 2차원(2D) 스크래치 상처 이동 분석 및 3차원(3D) 스페로이드 발아 분석과 함께 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 각각의 다운스트림 분석 방법과 함께 in vitro 혈관 신생을 연구하는 데 적합한 분석법으로 제시합니다.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

배우세요 Matrigel 튜브 형성 분석을 통해 종양 세포의 혈관 형성 활동을 평가하는 방법을 알아보세요. 이 기술은 암 연구에서 세포의 혈관화 잠재력을 측정하는 데 활용됩니다.

종양 세포의 Vasculogenic 활동을 평가 Matrigel 기반 튜브 형성 분석

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