Name: Cryo - 전자 현미경에 의해 HIV - 1 Capsid 어셈블리의 구조와 반복 나선형 실제 공간 재건 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: 배우세요 HIV-1 캡시드 어셈블리의 반복 나선형 실제 공간 3D 재건 방법을 크라이오-전자현미경으로. 이 프로토콜은 고해상도 밀도 맵 생성을 위한 상세한 이미지 처리 및 구조 생물학 연구에 활용됩니다.

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저자는 기술 지원을위한 박사 Gongpu 조 및 Danxia 애 감사드립니다. 우리는 DRS 감사합니다. 자신의 이미지 처리 소프트웨어를 공유하기위한 에드워드 Egelman와 니코 Grigorieff. 우리는 또한 구조 cryo - EM 시설 생물학과 의학의 피츠버그 학교의 대학에서 베오울프 클러스터와 그리드를 지원하는 직원을 인정합니다. 이 작품은 GM082251와 GM085043 지원했다.

1. 냉동 수산화 EM 표본 준비 HIV - 1 capsid 단백질 (CA)이 어셈블리 9 단 cryo - EM 이미지에 강한 배경 소음을 기여 높은 소금 (1M NaCl) 버퍼에 안정되기 때문에, 우리는 transiently 소금을 줄이기 위해 빠른 희석 다시 사이드 모래 바닥 방법을 사용 농축 냉동 수산화 EM 격자를 준비할 때. <ol><li> 25초에 대한 25mA 이하 200 메쉬 R2 / 1 Quantifoil 구리 격자의 글로우 방전은 탄소 측면. </li><li> 80 % 환경 챔버에서 습도, 집에서 만든 수동 중력 플런저를 데리고 천식 환자용 호흡 보조기를 두시 라고요을 사용합니다. </li><li> 페이 Vitrobot 플러져 듀어, 액체 질소를 사용하여 냉각 액체 에탄에서. 수동 중력 플런저에 뛰어들다 - 냉동 듀어를 탑재합니다. </li><li> 포셉에 장착할 수있는 격자의 탄소쪽으로 preassembled CA 솔루션 2.5 μl를 적용하고, 당신을 멀리 직면하고있는 격자의 탄소 사이드와 플런저에 포셉를로드합니다. </li><li> 그리드의 뒷면에 낮은 소금 희석 버퍼 (100 MM NaCl) 3 μl를 추가하고 즉시 필터 종이와 그리드의 뒷면에 얼룩. 그리드의 전체 배면은 필터 용지를 제거하기 전에, 약 6 초 동안 필터 종이와 긴밀한 연락을해야합니다. 즉시 필터 용지를 제거한 후 액체 에탄으로 격자를 뛰어들다. </li><li> 플런저의 집게를 제거하고 신속하게 그리드 스토리지 상자에 격자를 전송합니다. </li></ol> 2. CA 관형 어셈블리 Cryo - 전자 현미경 <ol><li> 200kv에서 황비홍 폴라라 G2 전자 현미경 운영에 냉동 수산화 격자를로드하고 Gatan 4Kx4K CCD 카메라가 장착되어. </li><li> ~ 200x의 확대에 낮은 선량 - 검색 모드에서와 복용 &lt;0.001e과 함께 - / 2, 스크린 적합한 얼음 무대 파일에 이러한 영역의 위치를 저장과 영역에 대한 전체 그리드. </li><li> 낮은 선량 - 검색 모드에서 3,900 X의 확대에 저장된 위치와 추가 화면이 영역을 회수. 데이터 수집을 위해 구멍을 통해 잘 구분된 긴 튜브를 포함하는 얼음의 유니폼, 얇은 레이어로 영역을 선택합니다. 두 번째 단계 파일에서 이러한 영역의 위치를​​ 저장합니다. </li><li> 59,000 X, 삽입된 페이지 100 μm의 목표 구멍의 확대에 노출 모드로 전환하고, ~ 15 E의 복용에 대한 객관적 stigmatism 및 빔 강도를 조정 - 노출 당 / A 2. </li><li> 낮은 복용량 - 검색 모드로 돌아갑니다, 저장된 위치로 이동하고 CCD 카메라를 사용하여 좋은 튜브를 파악하고 중심. 초점 모드로 전환, 초점을 조정하고, defocus 값을 설정, 일반적으로 사이 0.5-2.5 μm의. 노출 모드로 전환, 15 E의 복용량을 위해, 0.3-0.5 초 노출 시간을 설정 - / 2, 그리고 이미지를 수집합니다. 이미지는 접시 카메라 수집하고, 노출이 촬영되기 전에 필름은 10 초 동안 정착을 허용해야합니다. </li><li> 다음 저장된 위치로 이동하고 더 많은 이미지를 수집하기 위해 5 단계를 반복합니다. </li><li> 영화 12 분 동안 풀 가동 D19에서 개발하고 6.35 μm의의 픽셀 크기 니콘 슈퍼 coolscan 9000 ED 스캐너를 사용하여 디지털됩니다. 이미지 파일의 형식은 TIFF 있습니다. </li></ol> 3. 나선형의 색인 나선형 개체는 두 개의 매개 변수에 의해 색인을 생성할 수 있습니다 베셀 주문, N, 및 레이어 줄 번호, 난 있습니다. 로 (N, L)에 의해 특징 푸리에 변환의 각 계층 라인, 2D 격자의 표기법을 사용하여, (H, K)에 의해 인덱스를 표시된 나선형 오브젝트의 표면 격자에 라인의 집합에 해당합니다. 모든 (H, K)의 경우, (N 홍콩, 난 HK) 레이어 라인의 N과 나는 가치 두 가지 기본 벡터 (N 10 리터 10)와 (N 01, 전 01)의 선형 ​​조합입니다 두 주요 레이어 라인 (1, 0)과 (0, 1). 리터는 푸리에 변환의 Z 축을 따라 측정의 레이어 라인 높이에서 구할 수 있습니다. N의 값은 다음 방정식 10을 사용 예상 수 πRr ≈ J N ≈ 1.1 | N | -0.9 .....................( 1) J n은 N의 번째 레이어 라인의 강도를 결정하는 베셀 함수이고, R은 나선형 객체의 반경이고, R은 레이어 라인의 최대 진폭의 반경이다. 레이어 라인 번호, 전, 선택 규칙 11 N과 관련이 L = TN + 음 ....................( 2) T와 U는 나선형의 상수 어디. 특정 나선형 들어, (또는 매우 밀접하게) 정확히에서 T C U 정확히 단위가있을 수 있습니다omplete이 바뀝니다. <ol><li> EMAN의 프로그램 12 helixboxer 및 MRC 포맷으로 이미지를 저장을 사용하여 균일한 직경이 비교적 직선과 긴 튜브 밖으로 상자. </li><li> MRC 패키지 13 등 'imgccf'와 같은 교차 상관 기반 프로그램을 사용하여 나선형 반복 거리, C를,,, 확인하십시오. </li><li> 반복 거리, C의 핵심입니다 새로운 상자 길이와 푸리에 변환을 계산합니다. </li><li> 두 가지 기본적인 표면 격자 벡터 (1,0)을 정의하고 (0,1) 2 주요 레이어 라인을 선택합니다. </li><li> 튜브의 반경, R 및 푸리에 변환, 전 10, R 10, 각각 01 리터 R 01, (그림 1)에서 두 개의 주요 레이어 라인의 높이와 반경을 측정합니다. </li><li> N 10 방정식 (1)에 따라 N 01 계산. </li><li> N 값은 추정하기 때문에, N 10 N 01의 몇 가지 조합이 프로그램 패키지 IHRSR를 사용하여 올바른 나선형 대칭을 찾아 (단계 4.2 참조) 나중 단계에서 테스트합니다. </li><li> subunits (Δφ)과 한 별 나선의 축 리즈 (Δz) (N = 1) 사이의 순환 두 개의 현실 번호에 의해 설명하는 나사 대칭을 계산합니다. 리터 10 리터 01, N 10, N 01 가치를 감안할 때, U와 t는 m 값의 범위 (예를 들어, -50 &lt;m &lt;50) 선택 규칙에 따라. 테스트하여 구할 수 있습니다 마지막으로, Δφ 및 Δz이 사용하는 계산됩니다 Δφ = 360t / U 및 Δz = C / U. </li></ol> 4. 입체 재건 <ol><li> 입자 세분화 <ol><li> EMAN 패키지 프로그램입니다 그래픽 프로그램 복서를 사용, 나선형 입자를 포함하는 현미경을 엽니다. </li><li> 중복 세그먼트로 나선형 입자를 잘라. 복서의 제어판에서 헬릭스 모드를 선택하고 복싱에 대한 매개 변수를 설정 상자의 크기는 입자의 직경과 'OLAP'이 상자 크기의 ~ 90 %되어야합니다에 대한 값보다 커야합니다. </li><li> 나선형 입자의 양쪽 끝에 왼쪽 버튼으로 클릭한 후, 복서가 자동으로 나선형의 길이를 따라 입자 박스 시리즈를 생성합니다. </li><li> 박스 세그먼트뿐만 아니라 자신의 좌표를 저장합니다. </li></ol></li><li> IHRSR 프로그램을 사용하여 초기 3 차원 재구성 <ol><li> cryo - EM 이미지의 명암을 반전하고 반복 헬리컬 실제 공간 재구성 방법 (IHRSR)로 처리하기 전에 14 (옵션) 필터링 낮은 패스를 적용합니다. </li><li> "생성기"를 입력하여 IHRSR 프로그램의 그래픽 인터페이스를 엽니다. 이름과 경로 스택의 스택에서 이미지의 숫자를 포함하여 박스 입자 스택에 대한 모든 정보와 그래픽 인터페이스를 제공, 대칭 매개 변수의 값은 등 재구성 스크립트를 만들려면 버튼 "마침"을 클릭 b25.spi. </li><li> 초기 참조로 고체 또는 속이 빈 실린더를 사용하여 보통 몇 사이클 후에 발생하는 정의 나사 대칭에 변화가 없을 때까지 사이클로 프로 시저를 허용합니다. 오른쪽 나선형 대칭이 안정적으로 수렴 재건을 줘야한다. 지난주기에서 생성된 재건은 더욱 정제에 대한 최초의 레퍼런스로 사용됩니다. IHRSR 스파이더 프로그램을 사용하여 3 차원 재구성을 수행합니다. </li></ol></li><li> 반복 상세 15 재건은 IHRSR에 의해 생성 3D 재구성은 현재 추가적인 정제를위한 초기 참조로 사용됩니다. 상세 동안 나선형 대칭은 Δφ 및 IHRSR 절차에서 결정됩니다 Δz에서 고정됩니다. <ol><li> 프로그램 CTFFIND3 및 CTFTILT 16을 사용하여 현미경에서 defocus 및 난시의 현재를 확인합니다. </li><li> 스파이더 프로그램 17을 사용하여 CTF에 의해 입자 세그먼트를 곱하면됩니다. 거미 스위트에서 FT를 칭했다 작업은 2D 이미지의 푸리에 변환 (FFT)을 계산하는 데 사용됩니다. 그 후, FFT는 거미 제품군 내에서 MU를 칭했다 작업을 사용하여 이전 단계에서 결정, CTF 값을 곱한 것입니다. 얻은 값은 다음 역 거미 작업을 사용하여 실제 공간에 새로운 이미지 (CTF - 수정)을 양식으로 변형, FT 다시합니다. </li><li> 다중 참조 정렬을 사용하여 CTF - 수정된 이미지 참조 볼륨 계획을 비교하여 프로젝션 검색을 수행합니다. 아웃 - 오브 - 비행기의 기울기 각도의 편차는 + / -10 °로 제한하고 1 °의 단계로 샘플링됩니다. 각 세그먼트의 정렬 매개 변수에 대한 이러한 높은 상관 계수와 같은 제약, 0 ° 또는 180 °, 그리고 X - 교대 제한 근처에 - 평면 각도를 소개합니다. 제약을 만족 재건에만 세그먼트에 포함합니다. </li><li> 각 상세 검색 사이클을 반복하면, 3D 재구성은 CTF 이상 합계로 다시 투영을 사용하여 생성하고 나누어져 있습니다2. </li><li> symmetrized 볼륨을 생성하는 나선형 대칭을 부과. 새로운 3D 재건의 해상도에서 더 이상 개선이 발생 없을 때 반복 상세가 종료됩니다. </li><li> 이미지 프로세싱 패키지 거미는 상세 검색 단계를 대부분 사용됩니다. 작업 일련의 작업과 매개 변수 값의 시퀀스를 포함하는 사용자가 만든 배치 제어 파일입니다 스파이더 스크립트에 의해 제어됩니다. 최종 재건은 거미의 제품군에 프로그램을 사용하여 계산됩니다. </li></ol></li></ol> 5. 대표 결과 : 단일 HIV - 1 CA A92E 튜브 (그림 1A)은 박스 나오려고했는데 그 푸리에 변환 (그림의 1B)는 나선형 색인 계산되었다. 레이어 라인 (1, 0)과 (0, 1), 전 10 = 28 리터 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. 211.57Å의 튜브 반경을 감안할 때, 우리는 N 10 =- 12 N 01 approximated = 11 (여기서, handedness가 미리 정해진되었다). 5195.48Å의 반복 거리로 튜브의 나사 대칭이 Δz과 같이 결정되었습니다 = 6.8093Å, Δφ = 328.88 °. Δz과 Δφ는 7.1321Å과 328.86에 세련된했다 ° IHRSR (그림 2A) 및 초기 재건이 그림에 표시됩니다를 사용하여. 2B. 최종 재건 (그림 3), 상세 검색을 반복 후 IHRSR (그림 2B)로 계산 초기 모델에서 상당히 밀도지도를 향상되었습니다. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. HIV - 1 CA 헬리컬 튜브의 색인을 생성합니다. (A) 하나의 HIV - 1 CA A92E 관 이미지. 스케일 바, 30 NM. (B) 푸리에 (A)에 표시된 튜브의 변환. 나선형 지표는 (N 10 =- 12 N 01 = 11) 표시된 있습니다. 23A 해상도에서 레이어 라인에 애로를 가리 킵니다. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. IHRSR를 사용하여 초기 재건. 각 반복주기 (A) 나사 대칭 결정. 10 상세 검색 사이클을 반복 후 Δφ과 Δz은 초기 값부터, 안정적인 값으로 수렴. (B) 10 일 이후 최초 3D 밀도지도 사이클을 반복. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 반복 상세 후 3D 밀도지도. (AC) CA 튜브의 밀도지도는 세 직교 조각으로 표시됩니다 튜브 축에 평행하고 튜브 축 (B)에 수직, 표면 (A) 가까이 및 병렬 튜브 축 (C)와 통해 . 스케일 바, 10 NM. (D) 3D 밀도지도의 표면 렌더링 100 % 볼륨을 둘러싸고 1.8s에서 contoured.

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</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

우리는 나선형 오브젝트의 3D 구조를 얻기 위해 직접적인 접근을 제공하는 프로토콜의 집합을 제시한다. 설명한 절차를 사용하여, 우리는 하나의 튜브 이미지 (176 세그먼트)에서 HIV - 1 capsid 어셈블리의 3D 구조를 인수했다. 높은 해상도의 구조는 더 많은 이미지 데이터를 포함하여 얻을 수 있습니다. 최적의 데이터 수집 및 분석을위한 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다 첫 번째는 cryo - EM 표본의 준비 기간 동안, 샘플 솔루션은 표본의 크기보다 약간 두껍 솔루션의 유니폼, 얇은 레이어를 떠나 멀리 blotted해야합니다. 예제를 얼룩하는 여러 가지 방법이 있습니다. 특히 백 측면에서, 한 측면에서 모래 바닥 세균 세포와 같은 HIV - 1 CA 어셈블리로 관형 표본, 들어 가장 적합합니다. 둘째, 나선형의 handedness이가 나선형 색인을 생성하거나 재구성하여 수행할 수 없으므로, 결정되어야합니다. 일반적인 연습은 로타리가 handedness을 결정하는 18 붙인 다음 냉동 에칭을 사용하는 것입니다. 밀도지도의 해상도가 충분히 높은 경우 Handedness 또한 이후 재건을 결정 수 있으며 정확한 handedness를 가정하면 개별 구성 요소의 3D 모델은 원자 밀도지도에 잘 맞지도한다. 그렇지 않으면, 반대 handedness을 가정해야합니다. 셋째, 위너 필터는 잡음 증폭을 줄이기 위해, 위상과 진폭 보정 모두, 이미지 처리하는 동안 사용해야합니다. 하나의 이미지에서 CTF는 항상 제로 횡단을 가지고 있기 때문에, 상호 공간에서 정보의 일부가 손실됩니다. 따라서 다른 defocus 값에서 3D 재구성, 각각의 몇 군데에 포함 여러 투영 데이터 집합이 필요합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 출처 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 100X 글로우 방전 장치 </td><td> 100X 글로우 방전 장치 </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai 폴라라 전계 방출 총으로 F30 현미경 </td><td> 황비홍, 힐스 보로, OR </td><td></td></tr><tr><td> Gatan 4K X 4K CCD 카메라 </td><td> Gatan, 플레즌턴, CA </td><td></td></tr><tr><td> 플런지 - 냉동 장치 </td><td></td><td> 집에서 만든 수동 중력 플런저 </td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200 메쉬 holely - 탄소 구리 격자 </td><td> Quantifoil 마이크로 도구, 예나, 독일 </td><td></td></tr><tr><td> EM 소프트웨어 EMAN </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EM 소프트웨어 IHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /</a> </td><td> 에드워드 H. Egelman에서 제공 프로그램 </td></tr><tr><td> EM 소프트웨어 스파이더 </td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRC 기반 헬리컬 처리 소프트웨어 </td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td> 코지 요네쿠라에서 제공 프로그램 </td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILT과 실제 공간 헬리컬 상세 검색 소프트웨어 </td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

cryo - 전자 현미경에 의해 hiv - 1 capsid 어셈블리의 구조와 반복 나선형 실제 공간 재건

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

이미지 프로세싱과 결합 Cryo - 전자 현미경 (cryo - EM)는, macromolecular 단백질 단지와 어셈블리의 구조 결정에 대한 점점 더 강력한 도구입니다. 사실, 단일 입자 전자 현미경 1 (2D) 2 차원은 전자 crystallography 2 상대적으로 일상적인 방법론과 구조의 많은되고있는 이러한 방법을 사용하여 해결했습니다. 동시에, 이미지 처리 및 헬리컬 객체의 세 차원 (3D) 재건은 빠르게 특히 나선형 대칭과 함께 단일 입자 분석 도구를 사용하여 나선형 실제 공간 재건 (IHRSR) 방법 3을 반복, 발전시켜 왔습니다. 나선형 엔티티의 3D 밀도지도가 하나의 투영에서 획득 할 수 있기 때문에 대부분의 생물 학적 실체가 filamentous 또는 헬리컬 굴지의 필라멘트 4, microtubules 5, 아밀로이드 섬유 6, 담배 모자이크 바이러스 7, 박테리아 flagella 8 포함한 양식, 그리고에 기능 IHRSR 방식이 아닌 나선형 오브젝트의 3D 재건에 필요한 다양한 이미지, 등 유연하고 무질서 나선형 어셈블리의 구조 분석에 비해 이미지는 지금 실현합니다. 이 비디오를 문서에서, 우리는 cryo - EM으로 cryo - EM 시료 준비, 저용량 데이터 수집을위한 프로토콜을 포함 헬리컬 단백질 어셈블리의 3D 밀도지도 (HIV - 1 capsid 9의 예입니다), 인덱싱를위한 상세한 프로토콜을 제공합니다 헬리컬 회절 패턴, 그리고 IHRSR를 사용하여 이미지 프로세싱 및 3D 재건. 다른 기술에 비해, cryo - EM은 근처 기본 조건 하에서 최적의 표본 보존을 제공합니다. 샘플은 빠른 냉동으로 유리 얼음의 얇은 레이어에 포함된, 그리고 방사선 피해를 최소화하기 위해 저용량 조건 하에서 액체 질소 온도에서 전자 현미경으로 몇 군데 있습니다. 샘플 이미지는 낮은 신호 및 기록 micrographs 낮은 콘트라스트의 비용으로 근처 기본 조건 하에서 얻을 수 있습니다. 다행히, 나선형 재구성하는 과정은 크게 헬리컬 회절 패턴을 색인을 제외하고, 자동되었습니다. 여기, 우리는 인덱스 헬리컬 구조 방식을 설명하고 디지털 micrographs, 3D 나선형 재건을위한 필수적인 단계에서 나선형 symmetries을 (헬리컬 매개 변수)를 결정합니다. 간단히, 우리는 IHRSR 방법을 적용하여 초기 3D 밀도지도를 구하십시오. 이 초기지도는 다음 반복함으로써 자신의 자유도를 조절, 각 세그먼트의 정렬 매개 변수에 대한 제약을 도입하여 세련됩니다. 더 개선은 전자 현미경 (진폭 및 위상 보정)의 대비 전송 기능 (CTF)을 수정하여하고 어셈블리의 나선형 대칭을 최적화하여 이루어진다.

이 문서는 cryo - 전자 현미경을 사용하여 나선형으로 조립 분자의 3 차원 (3D) 구조를 구하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 반복 나선형 실제 공간 재건 방법에 의해 밀도지도를 달성하기위한 세부적인 3D 재건 절차를 설명하기 위해 HIV - 1 capsid 어셈블리를 사용합니다.

Cryo - 전자 현미경에 의해 HIV - 1 Capsid 어셈블리의 구조와 반복 나선형 실제 공간 재건

이미지 처리 기술과 결합된 초저온 전자 현미경(cryo-EM)은 거대 분자 단백질의 구조 결정에 있어 점점 더 강력한 도구가 되고 있습니다...

이 절차의 전반적인 목표는 초저온 전자현미경(cryo-electron microscopy)을 사용하여 헬릭스 조립 분자의 3차원 구조를 얻는 방법을 제공하는 것입니다. 프로토콜은 동결 수화 EM 그리드를 준비할 때 염 농도를 일시적으로 낮추기 위해 급속 희석 및 후면 블로팅 방법을 사용하는 초저온 EM 시료 준비로 시작합니다. 이 과정은 단백질의 안정성을 보장하는 동시에 배경 노이즈를 줄여, 이후 진행되는 초저온 EM 저선량 데이터 수집 단계에서 신호 대 잡음비를 향상시킵니다.회절 패턴의 나선형 인덱싱이 완료되었습니다. 이후 이미지 프로세싱을 수행하고, 이어서 실공간 3D 재구성을 통해 HIV 단일 캡시드 또는 ca 튜브의 최종 밀도 맵을 얻습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 개인은 최적의 데이터 수집 및 분석을 위한 몇 가지 중요한 지점들이 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.예를 들어, HIV의 경우 특정 몰 농도 소스 용액에서만 형성되는 하나의 캡시드 관상 구조체가 구조에 영향을 주지 않으면서 염 농도를 빠르게 감소시킬 때 나타납니다. 고품질의 cryo EM 이미지를 얻는 것이 매우 중요합니다. 튜브 이미지가 주어졌을 때, 주요 튜브를 인덱싱하기 위해 무엇을 해야 하는지, 그리고 3D 재구성을 위해 어떤 소프트웨어를 고려해야 하는지를 파악하는 것은 매우 어렵습니다.이 영상은 물리적 객체의 3D 재구성물을 얻기 위한 상세하고 간단한 방법을 제공하며, 귀하의 실험에 참고 자료로 활용될 수 있습니다. 저는 Puja 박사와 함께 이 절차를 시연하겠습니다. 저희는 두 사람 모두 Dr.Laboratory의 박사후 연구원입니다. cryo EM을 위한 HIV-1 캡시드 단백질 어셈블리를 준비하기 위해, 먼저 200 mesh 구리 그리드의 탄소면을 25 mA에서 25초 동안 글로우 방전 처리하십시오.네뷸라이저를 사용하여 수제 수동 중력 플런저인 환경 챔버 내의 습도를 80%로 맞춥니다. 그동안 액체 질소로 vitro bott 플런저 도어 내의 액체 에탄을 냉각시킨 후, 플런지 냉동 도어를 수동 중력 플런저에 장착합니다. 다음으로, 포셉을 사용하여 그리드 가장자리를 집어 고정합니다.미리 준비된 단백질 용액 2.5 µL를 그리드의 탄소 쪽에 도포합니다. 그 다음, 그리드의 탄소 면이 바깥쪽을 향하도록 하여 핀셋으로 플런저에 적재합니다. 그리드의 뒷면에 저염 희석 완충액 3 µL를 추가합니다.그리드의 동일한 면을 여과지로 즉시 흡수시킵니다. 그리드의 뒷면 전체가 여과지에 약 6초 동안 밀착되도록 유지하십시오. 여과지를 제거한 후, 즉시 그리드를 액체 에탄에 침전시킵니다.마지막으로, 플런저에서 포셉을 제거하고 그리드를 그리드 보관함으로 빠르게 옮깁니다. 냉동 수화된 그리드를 FEI polar G two 전자현미경에 로딩하여 저온 전자현미경 분석을 시작합니다. 해당 장비는 200 kilovolts에서 작동하며 gatin 4K by 4K CCD 카메라가 장착되어 있습니다.저선량 탐색 모드에서 배율을 약 200 x로 설정합니다. 그리드 전체를 스캔하여 적절한 얼음 두께를 가진 영역을 찾습니다. 이러한 영역의 위치를 스테이지 파일에 저장합니다.저장된 위치를 불러와 해당 영역들을 추가로 스크리닝합니다. 저선량 탐색 모드에서 3,900 x 배율을 추가합니다. 구멍 위에 매달려 있는 긴 튜브들이 포함되어 있는, 데이터 수집에 적합한 균일하고 얇은 얼음 층 영역을 선택합니다.모든 영역을 2단계 파일에 저장하십시오. 노출 모드로 전환하십시오. 배율을 59,000 x로 설정하고 100 micrometer 대물렌즈 조리개를 삽입하십시오.그런 다음 대물렌즈 비점수차와 빔 강도를 조정하여 1회 노출당 약 15 electrons per angstrom squared의 선량이 되도록 합니다. 저선량 탐색 모드로 돌아가 저장된 위치로 이동하십시오. 적절한 튜브를 식별하여 중앙에 맞춥니다.CCD 카메라를 포커스 모드로 전환하여 초점을 조절하고, 디포커스 값을 통상적으로 0.5에서 2.5 µm 사이로 설정합니다. 그다음 노출 모드로 전환하고, 15 electrons per angstrom squared의 선량에 대해 노출 시간을 0.3에서 0.5초로 설정합니다. 플레이트 카메라로 이미지를 수집하며, 노출을 시작하기 전 필름이 안정화되도록 10초 동안 대기합니다.이미지 수집 후, 다음으로 저장된 위치로 이동하여 이 과정을 반복해 더 많은 이미지를 수집합니다. 필름을 원액 D 19에서 12분 동안 현상합니다. 그런 다음 Nikon Super cool scan 9, 000 ED 스캐너를 사용하여 6.35 micrometers의 픽셀 크기로 이미지를 디지털화합니다.나선형 객체는 두 가지 매개변수로 인덱싱할 수 있습니다. 나선형 객체 표면 격자의 푸리에 변환에서 베셀 차수 N과 층선 번호 L입니다. 각 층선은 N과 L로 특징지어지며, H 및 K 인덱스로 표시되는 표면 격자의 일련의 선들에 대응합니다.나선형 인덱싱(helical indexing)을 시작하려면, Iman 프로그램의 Helix boxer를 사용하여 직경이 균일하고 비교적 길고 곧은 튜브 영역을 박스 처리하고 이미지를 MRC 형식으로 저장하십시오. 그런 다음 Iman 프로그램의 boxer를 사용하여 튜브의 반지름을 측정하십시오. MRC 패키지의 I-M-G-C-C-F와 같은 상호 상관 기반 프로그램을 사용하여 HEL 반복 거리를 결정하십시오.그런 다음 foyer를 계산합니다. 반복 거리의 적분 값인 새로운 box 길이로 변환하십시오. 다음으로, FFT 픽셀 단위에서 1 0 및 0 1로 정의되는 두 개의 기본 표면 격자 벡터를 결정하는 두 개의 주 층 선(principle layer lines)을 선택하십시오.푸리에 변환에서 두 개의 주 층선(principle layer lines)에 대한 층선 번호와 최대 진폭 반지름을 결정하십시오. 두 주 층선의 층선 번호와 베셀 함수 차수(Bessel orders) 값을 통해, 서면 절차에 기술된 선택 규칙(selection rule)을 사용하여 서브유닛 간의 회전각과 1-성 헬릭스(one star helix)의 축 방향 상승 거리를 구할 수 있습니다. 이 두 실수는 튜브의 나선 대칭성(screw symmetry)을 나타냅니다.3D 재구성은 Iman 프로그램인 Boxer를 이용한 입자 분할로 시작됩니다. 헬릭스 입자가 포함된 마이크로그래프를 연 후, Boxer의 제어 패널에서 입자를 겹치는 세그먼트로 자릅니다. 헬릭스 모드를 선택하고 박싱을 위한 매개변수를 설정합니다.박스의 크기는 입자의 직경보다 커야 하며, OLA 값은 박스 크기의 약 90%여야 합니다. 설정 후 입자 박스의 어느 한쪽 끝을 클릭하면 헬릭스 길이를 따라 일련의 입자 박스가 자동으로 생성되며, 박스 처리된 세그먼트와 해당 좌표가 저장됩니다. 다음 단계는 I-H-R-S-R로 처리하기 전, 반복적 헬릭스 실공간 재구성 방법인 I-H-R-S-R을 사용하여 초기 3D 재구성을 수행하는 것입니다.cryo-EM 이미지의 대비를 반전시키고 LOWPASS 필터링을 적용합니다. 그런 다음 generator를 입력하여 I-H-R-S-R 프로그램의 그래픽 인터페이스를 엽니다. 스택의 이름과 경로, 스택 내 이미지 수 및 대칭 매개변수 값을 포함하여 박싱된 입자 스택에 대한 모든 정보를 그래픽 인터페이스에 입력합니다.완료 버튼을 클릭하여 재구성 스크립트를 생성하십시오. B 25 SP.I 초기 참조로 중실 또는 중공 실린더를 사용하며, 정의된 나사 대칭에 더 이상 변화가 없을 때까지 절차를 반복합니다. 이는 일반적으로 몇 차례의 사이클 후에 발생합니다. 우선성 헬릭스 대칭을 사용하면 안정적으로 수렴된 재구성 결과를 얻을 수 있습니다.마지막 사이클에서 생성된 재구성은 추가 정밀화를 위한 초기 참조로 사용됩니다. 마지막으로, I-H-R-S-R에 의해 생성된 3D 밀도 맵을 정밀화 과정 중 추가 정밀화를 위한 초기 참조로 사용하여 반복적 정밀화를 통한 3D 재구성을 수행합니다. 나선 대칭은 I-H-R-S-R 절차에서 결정된 서브유닛 간의 회전과 축 방향 상승 값으로 고정됩니다.다음으로, spider 프로그램의 FT 및 mu 모듈인 CTF find three와 CTF tilt 프로그램을 사용하여 마이크로그래프에 존재하는 디포커스(defocus)와 난시(astigmatism)를 결정하고, 입자 세그먼트에 대비 전달 함수(contrast transfer function, CTF)를 곱합니다. 다중 참조 정렬(multi reference alignment)을 사용하여 참조 볼륨의 투영 이미지와 CTF가 보정된 이미지를 비교함으로써 투영 매칭(projection matching)을 수행합니다. 평면 외 기울기 각도의 변화는 ±10°로 제한하고 1° 단계로 샘플링하며, 0° 또는 180°에 가까운 평면 내 각도에서의 높은 상관 계수 및 제한된 X축 이동과 같은 제약 조건을 도입합니다.각 세그먼트의 정렬 파라미터의 경우, 제약 조건을 충족하는 세그먼트만 재구성에 포함합니다. 각 반복 정밀화 주기 이후, 역투영(back projection)을 사용하여 3D 재구성을 생성하고 이를 CTF 제곱 값으로 나누어 나선 대칭을 적용함으로써 대칭 평균화된 볼륨을 생성합니다. 새로운 3D 재구성의 해상도에서 더 이상의 개선이 나타나지 않을 때 반복 정밀화를 종료합니다.단일 HIV 캡시드 어셈블리인 92 e 튜브를 박스 아웃(boxed out)하고 푸리에 변환을 계산하여 헬릭스 인덱싱(helic indexing)을 수행하였으며, 두 반지름, 층선(layer line) 번호 및 층선 10과 01의 최대 진폭 반지름을 결정하였습니다. 이후 10과 01에 대해 각각 -12와 11의 끝값을 계산하였으며, 반복 거리(repeat distance)는 5195.48 angstroms였습니다. 튜브의 나선 대칭(screw symmetry)은 delta Z = 6.81 angstroms 및 delta five = 328.88 degrees로 결정되었습니다. I-H-R-S-R을 사용하여 delta Z와 delta five를 각각 7.13 angstroms와 328.86 degrees로 정밀화하였으며, 10회의 반복 사이클 후에 초기 재구성(reconstruction) 결과가 생성되었습니다.반복적 정밀화를 거친 최종 재구성은 I-H-R-S-R로 계산된 초기 모델에 비해 밀도 맵을 상당히 개선하였습니다. 캡시드 조립 튜브의 밀도 맵은 튜브 축과 평행하며 표면에 근접한 세 개의 직교 단면, 튜브 축에 수직인 단면, 그리고 튜브 축과 평행하게 축을 관통하는 단면으로 표시됩니다. 표시된 구조는 100% 부피를 포함하도록 1.8 Sigma에서 등고선 처리된 3D 밀도 맵의 표면 렌더링 결과입니다.이 영상을 시청하고 나면, 저온 전자 현미경(cryo electron microscopy)을 사용하여 조립된 분자의 3D 구조를 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

structure-hiv-1-capsid-assemblies-cryo-electron-microscopy-iterative

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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