Cryo - 전자 현미경에 의해 HIV - 1 Capsid 어셈블리의 구조와 반복 나선형 실제 공간 재건

이 절차의 전반적인 목표는 초저온 전자 현미경을 사용하여 나선 조립 분자의 3차원 구조를 얻는 방법을 제공하는 것입니다. 프로토콜은 동결된 수화 EM 그리드를 준비할 때 염 농도를 일시적으로 줄이기 위해 급속 희석 및 후면 블로팅 방법을 사용하는 cryo EM 시료 준비로 시작합니다. 이 프로세스는 데이터 수집 이후 이어진 cryo EM 저선량 데이터 수집 중에 배경 소음을 줄이고 신호 대 잡음비를 개선하는 동시에 단백질 안정성을 보장합니다.

회절 패턴의 나선형 인덱싱이 완료되었습니다. 그런 다음 이미지 처리를 수행한 다음 실제 공간 3D 재구성을 수행하여 HIV one capsid 또는 ca 튜브의 최종 밀도 맵을 생성합니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 최적의 데이터 수집 및 분석을 위한 몇 가지 중요한 지점이 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.

예를 들어, HIV의 경우 하나의 어금니 소스 용액에서만 형성되는 하나의 캡시드 관형 어셈블리가 구조에 영향을 주지 않고 염 농도를 빠르게 감소시킵니다. 고품질 cryo EM 이미지를 얻는 것이 중요합니다. 튜브 이미지가 주어지면 중요한 튜브를 인덱싱하기 위해 무엇을 해야 하는지, 어떤 소프트웨어가 3D 재구성을 수행하는 것으로 간주될 수 있는지 배우기가 매우 어렵습니다.

이 비디오는 물리적 물체의 3D 재구성을 얻기 위한 상세하고 간단한 접근 방식을 제공하며 실험의 참조로 사용할 수 있습니다. Dr.Puja와 함께 절차를 시연할 것입니다. 우리는 둘 다 Dr.Laboratory의 박사후 연구원입니다.HIV one 캡시드 단백질 어셈블리를 cryo em에 준비하기 위해 글로우로 시작하여 25 초 동안 25 밀리 암페어 미만의 200 메쉬 구리 그리드의 탄소 측을 방전합니다.

분무기를 사용하여 수제 수동 중력 플런저인 환경 챔버의 습도를 80%로 높입니다. 한편, 액체 질소가 포함된 시험관 보트 플런저 도어의 시원한 액체 에탄은 수동 중력 플런저에 플런지 냉동 도어를 장착합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 집게를 그리드 가장자리에 닫습니다.

2.5마이크로리터의 사전 조립된 단백질 용액을 그리드의 탄소 쪽에 적용합니다. 그런 다음 그리드의 탄소 면이 반대쪽을 향하도록 하여 집게를 플런저에 로드합니다. 3마이크로리터의 저염 희석 완충액을 그리드 뒷면에 추가합니다.

즉시 같은 면에 있는 여과지 조각으로 그리드를 닦아내십시오. 그리드의 전체 후면을 약 6초 동안 여과지와 밀접하게 접촉하도록 합니다. 여과지를 제거한 후 즉시 그리드를 액체 에탄에 담그십시오.

마지막으로 플런저에서 집게를 제거하고 그리드를 그리드 보관 상자로 빠르게 옮깁니다. 얼어붙은 수화 그리드를 FEI polar G two 전자 현미경에 로드하여 초저온 전자 현미경을 시작합니다. 200kV에서 작동하며 gatin 4K by 4K CCD 카메라가 장착되어 있습니다.

저선량 검색 모드에서 약 200배의 배율을 추가합니다. 적절한 얼음이 있는 영역에 대해 전체 그리드를 스크리닝합니다. 이러한 영역의 위치를 스테이지 파일에 저장합니다.

저장된 위치를 불러오고 이러한 영역을 추가로 스크리닝합니다. 저선량 검색 모드에서 3, 900 배의 배율을 추가합니다. 데이터 수집을 위해 균일한 박층 얼음이 있는 영역을 선택하며, 구멍 위에 매달려 있는 긴 튜브를 포함하는 것이 특징입니다.

모든 영역을 2단계 파일에 저장합니다. 노출 모드로 전환합니다. 59, 000배의 배율을 추가하고 100마이크로미터 대물렌즈 조리개를 삽입합니다.

그런 다음 객관적인 낙인과 빔 강도를 노출당 옹스트롬 제곱당 약 15개의 전자의 선량으로 조정합니다. 저선량 검색 모드로 돌아가서 저장된 위치로 이동합니다. 양호한 튜브를 식별하고 중앙에 배치합니다.

CCD 카메라 스위치를 사용하여 초점 모드로 전환하고 초점을 조정하고 디포커스 값을 일반적으로 0.5에서 2.5마이크로미터 사이로 설정합니다. 그런 다음 노출 모드로 전환하고 0.3 옹스트롬 제곱당 전자 0.5 전자의 선량에 대해 노출 시간을 15-15초로 설정합니다. 플레이트 카메라에서 이미지를 수집하여 노출을 촬영하기 전에 10초 동안 필름이 가라앉을 수 있도록 합니다.

이미지를 수집한 후 다음 저장된 위치로 이동하고 이 과정을 반복하여 더 많은 이미지를 수집합니다. 12분 동안 최대 강도 D 19로 필름을 현상합니다. 그런 다음 6.35마이크로미터의 픽셀 크기에서 Nikon Super cool scan 9, 000 ED 스캐너를 사용하여 이미지를 디지털화합니다.

나선형 객체는 두 개의 매개변수로 인덱싱할 수 있습니다. 베셀 차수 N과 레이어 선 번호 L은 나선형 물체의 표면 격자의 포러 변환에서 사용됩니다. 각 레이어 라인은 N과 L로 특징지어지며 H 및 K 인덱스로 표시되는 표면 격자의 선 집합에 해당합니다.

헬리컬 인덱싱을 시작하려면 Iman의 프로그램인 Helix boxer를 사용하여 직경이 균일한 비교적 길고 곧은 튜브를 박스아웃하고 이미지를 MRC 형식으로 저장합니다. 그런 다음 Iman의 프로그램 복서를 사용하여 튜브의 반경을 측정합니다. MRC 패키지의 I-M-G-C-C-F와 같은 교차 상관 기반 프로그램을 사용하여 HEL 반복 거리를 결정합니다.

그런 다음 로비를 계산합니다. 반복 거리의 정수인 새 상자 길이로 변환합니다. 다음으로, FFT 픽셀 단위로 두 개의 기본 표면 격자 벡터 1 0과 0 1을 정의하는 두 개의 기본 레이어 라인을 선택합니다.

레이어 라인 번호와 푸리에 변환에서 두 개의 기본 레이어 라인에 대한 최대 진폭의 반지름을 결정합니다. 두 개의 기본 레이어 라인에 대한 레이어 라인 번호와 베셀 차수 값이 주어지면 서브유닛 간의 회전과 하나의 별 나선의 축 상승은 작성된 절차에 설명된 대로 선택 규칙을 사용하여 얻을 수 있습니다. 이 두 실수는 튜브의 나사 대칭을 설명합니다.

3D 재구성은 Iman 프로그램을 사용한 입자 분할로 시작됩니다. 복서. 나선형 입자가 포함된 현미경 사진을 연 후 Boxer의 제어판에서 입자를 겹치는 세그먼트로 자릅니다. 헬릭스 모드를 선택하고 복싱에 대한 매개변수를 설정합니다.

상자의 크기는 입자의 직경보다 커야 하며 OLA 값은 상자 크기의 약 90%여야 합니다. 왼쪽 후 입자 박서의 한쪽 끝을 클릭하면 나선 길이를 따라 일련의 입자 상자가 자동으로 생성되고 상자 세그먼트와 좌표가 저장됩니다. 다음 단계는 I-H-R-S-R로 처리하기 전에 반복 나선형 실공간 재구성 방법 I-H-R-S-R을 사용하여 초기 3D 재구성을 수행하는 것입니다.

cryo-EM 이미지의 대비를 반전시키고 LOWPASS 필터링을 적용합니다. 그런 다음 generator를 입력하여 I-H-R-S-R 프로그램의 그래픽 인터페이스를 엽니다. 스택의 이름과 경로, 스택의 이미지 수, 대칭 매개 변수 값을 포함하여 boxed particles 스택에 대한 모든 정보가 포함된 그래픽 인터페이스를 제공합니다.

마침 버튼을 클릭하여 재건 스크립트를 작성합니다. B 25 SP. 저는 솔리드 또는 중공 실린더를 초기 참조로 사용하고 일반적으로 몇 사이클 후에 발생하는 정의된 나사 대칭에 변경 사항이 없을 때까지 절차가 순환하도록 합니다. 오른쪽 나선 대칭은 안정적으로 수렴된 재구성을 제공해야 합니다.

마지막 주기에서 생성된 재구성은 추가 개선을 위한 초기 참조로 사용됩니다. 마지막으로, I-H-R-S-R에 의해 생성된 3D 밀도 맵을 미세 조정 중 추가 미세 조정을 위한 초기 참조로 사용하여 반복 미세 조정과 함께 3D 재구성을 수행합니다. 나선형 대칭은 소단위와 축 상승 사이의 회전에 고정되며, 이는 I-H-R-S-R 절차에서 결정됩니다.

다음으로, CTF find three와 CTF tilt 프로그램을 사용하여 현미경 사진에 존재하는 디포커스 및 난시를 FT 및 mu multiply particle segments라고 하는 스파이더 프로그램을 사용하여 대비 전달 함수에 의해 결정합니다. 약식 CTF는 다중 참조 정렬을 사용하여 기준 볼륨의 투영을 CTF 보정된 이미지와 비교하여 투영 일치를 수행합니다. 평지 밖 기울기 각도의 변화는 플러스 또는 마이너스 10도로 제한되며 1도 단계로 샘플링하면 0도 또는 180도에 가까운 평각의 높은 상관 계수 및 제한된 X 이동과 같은 제약 조건이 발생합니다.

각 세그먼트의 정렬 매개변수의 경우, 구속조건을 충족하는 세그먼트만 재구성에 포함합니다. 각 반복 미세 조정 주기 후에 백 프로젝션을 사용하여 3D 재구성이 생성되고 CTF 제곱에 대해 일부로 나누어 나선형 대칭을 적용하여 대칭 볼륨을 생성합니다. 반복 미세 조정은 새로운 3D 재구성의 해상도가 더 이상 개선되지 않을 때 종료됩니다.

단일 HIV 1 캡시드 어셈블리, 92 e 튜브를 박스아웃하고 2개의 반경, 레이어 라인 번호 및 레이어 라인 1 0 및 0 1에 대한 최대 진폭의 반지름을 헬릭 인덱싱하기 위해 푸리에 변환을 계산했습니다. 그런 다음 음수 12와 11의 끝 값을 각각 1개의 0과 0 1에 대해 5195.48 옹스트롬의 반복 거리로 계산했습니다. 튜브의 스크류 대칭은 델타 Z가 6.81 옹스트롬, 델타 5가 328.88 옹스트롬, 델타 Z 및 델타 5가 I-H-R-S-R을 사용하여 7.13 옹스트롬 및 328.86도로 미세 조정되었으며 10 반복 주기 후에 초기 재구성이 생성되었습니다.

반복 미세 조정 후 최종 재구성은 I-H-R-S-R로 계산된 초기 모델에서 밀도 맵을 크게 개선했습니다. capsid assembly tubes의 밀도 맵은 tube axis에 평행하고 표면에 가깝고, tube 축에 수직이며, tube 축에 평행하고 tube 축을 통과하는 3개의 직교 슬라이스로 표시됩니다. 표시된 구조는 100% 부피를 둘러싸는 1.8 시그마로 윤곽이 잡힌 3D 밀도 맵의 표면 렌더링에서 비롯됩니다.

이 비디오를 시청한 후에는 까마귀 전자 현미경을 사용하여 동맹 조립 분자의 3D 구조를 얻는 방법을 매우 잘 이해하게 될 것입니다.