Cryo - 전자 현미경에 의해 HIV - 1 Capsid 어셈블리의 구조와 반복 나선형 실제 공간 재건

이 절차의 전반적인 목표는 초저온 전자현미경(cryo-electron microscopy)을 사용하여 헬릭스 조립 분자의 3차원 구조를 얻는 방법을 제공하는 것입니다. 프로토콜은 동결 수화 EM 그리드를 준비할 때 염 농도를 일시적으로 낮추기 위해 급속 희석 및 후면 블로팅 방법을 사용하는 초저온 EM 시료 준비로 시작합니다. 이 과정은 단백질의 안정성을 보장하는 동시에 배경 노이즈를 줄여, 이후 진행되는 초저온 EM 저선량 데이터 수집 단계에서 신호 대 잡음비를 향상시킵니다.

회절 패턴의 나선형 인덱싱이 완료되었습니다. 이후 이미지 프로세싱을 수행하고, 이어서 실공간 3D 재구성을 통해 HIV 단일 캡시드 또는 ca 튜브의 최종 밀도 맵을 얻습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 개인은 최적의 데이터 수집 및 분석을 위한 몇 가지 중요한 지점들이 있기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.

예를 들어, HIV의 경우 특정 몰 농도 소스 용액에서만 형성되는 하나의 캡시드 관상 구조체가 구조에 영향을 주지 않으면서 염 농도를 빠르게 감소시킬 때 나타납니다. 고품질의 cryo EM 이미지를 얻는 것이 매우 중요합니다. 튜브 이미지가 주어졌을 때, 주요 튜브를 인덱싱하기 위해 무엇을 해야 하는지, 그리고 3D 재구성을 위해 어떤 소프트웨어를 고려해야 하는지를 파악하는 것은 매우 어렵습니다.

이 영상은 물리적 객체의 3D 재구성물을 얻기 위한 상세하고 간단한 방법을 제공하며, 귀하의 실험에 참고 자료로 활용될 수 있습니다. 저는 Puja 박사와 함께 이 절차를 시연하겠습니다. 저희는 두 사람 모두 Dr.Laboratory의 박사후 연구원입니다. cryo EM을 위한 HIV-1 캡시드 단백질 어셈블리를 준비하기 위해, 먼저 200 mesh 구리 그리드의 탄소면을 25 mA에서 25초 동안 글로우 방전 처리하십시오.

네뷸라이저를 사용하여 수제 수동 중력 플런저인 환경 챔버 내의 습도를 80%로 맞춥니다. 그동안 액체 질소로 vitro bott 플런저 도어 내의 액체 에탄을 냉각시킨 후, 플런지 냉동 도어를 수동 중력 플런저에 장착합니다. 다음으로, 포셉을 사용하여 그리드 가장자리를 집어 고정합니다.

미리 준비된 단백질 용액 2.5 µL를 그리드의 탄소 쪽에 도포합니다. 그 다음, 그리드의 탄소 면이 바깥쪽을 향하도록 하여 핀셋으로 플런저에 적재합니다. 그리드의 뒷면에 저염 희석 완충액 3 µL를 추가합니다.

그리드의 동일한 면을 여과지로 즉시 흡수시킵니다. 그리드의 뒷면 전체가 여과지에 약 6초 동안 밀착되도록 유지하십시오. 여과지를 제거한 후, 즉시 그리드를 액체 에탄에 침전시킵니다.

마지막으로, 플런저에서 포셉을 제거하고 그리드를 그리드 보관함으로 빠르게 옮깁니다. 냉동 수화된 그리드를 FEI polar G two 전자현미경에 로딩하여 저온 전자현미경 분석을 시작합니다. 해당 장비는 200 kilovolts에서 작동하며 gatin 4K by 4K CCD 카메라가 장착되어 있습니다.

저선량 탐색 모드에서 배율을 약 200 x로 설정합니다. 그리드 전체를 스캔하여 적절한 얼음 두께를 가진 영역을 찾습니다. 이러한 영역의 위치를 스테이지 파일에 저장합니다.

저장된 위치를 불러와 해당 영역들을 추가로 스크리닝합니다. 저선량 탐색 모드에서 3,900 x 배율을 추가합니다. 구멍 위에 매달려 있는 긴 튜브들이 포함되어 있는, 데이터 수집에 적합한 균일하고 얇은 얼음 층 영역을 선택합니다.

모든 영역을 2단계 파일에 저장하십시오. 노출 모드로 전환하십시오. 배율을 59,000 x로 설정하고 100 micrometer 대물렌즈 조리개를 삽입하십시오.

그런 다음 대물렌즈 비점수차와 빔 강도를 조정하여 1회 노출당 약 15 electrons per angstrom squared의 선량이 되도록 합니다. 저선량 탐색 모드로 돌아가 저장된 위치로 이동하십시오. 적절한 튜브를 식별하여 중앙에 맞춥니다.

CCD 카메라를 포커스 모드로 전환하여 초점을 조절하고, 디포커스 값을 통상적으로 0.5에서 2.5 µm 사이로 설정합니다. 그다음 노출 모드로 전환하고, 15 electrons per angstrom squared의 선량에 대해 노출 시간을 0.3에서 0.5초로 설정합니다. 플레이트 카메라로 이미지를 수집하며, 노출을 시작하기 전 필름이 안정화되도록 10초 동안 대기합니다.

이미지 수집 후, 다음으로 저장된 위치로 이동하여 이 과정을 반복해 더 많은 이미지를 수집합니다. 필름을 원액 D 19에서 12분 동안 현상합니다. 그런 다음 Nikon Super cool scan 9, 000 ED 스캐너를 사용하여 6.35 micrometers의 픽셀 크기로 이미지를 디지털화합니다.

나선형 객체는 두 가지 매개변수로 인덱싱할 수 있습니다. 나선형 객체 표면 격자의 푸리에 변환에서 베셀 차수 N과 층선 번호 L입니다. 각 층선은 N과 L로 특징지어지며, H 및 K 인덱스로 표시되는 표면 격자의 일련의 선들에 대응합니다.

나선형 인덱싱(helical indexing)을 시작하려면, Iman 프로그램의 Helix boxer를 사용하여 직경이 균일하고 비교적 길고 곧은 튜브 영역을 박스 처리하고 이미지를 MRC 형식으로 저장하십시오. 그런 다음 Iman 프로그램의 boxer를 사용하여 튜브의 반지름을 측정하십시오. MRC 패키지의 I-M-G-C-C-F와 같은 상호 상관 기반 프로그램을 사용하여 HEL 반복 거리를 결정하십시오.

그런 다음 foyer를 계산합니다. 반복 거리의 적분 값인 새로운 box 길이로 변환하십시오. 다음으로, FFT 픽셀 단위에서 1 0 및 0 1로 정의되는 두 개의 기본 표면 격자 벡터를 결정하는 두 개의 주 층 선(principle layer lines)을 선택하십시오.

푸리에 변환에서 두 개의 주 층선(principle layer lines)에 대한 층선 번호와 최대 진폭 반지름을 결정하십시오. 두 주 층선의 층선 번호와 베셀 함수 차수(Bessel orders) 값을 통해, 서면 절차에 기술된 선택 규칙(selection rule)을 사용하여 서브유닛 간의 회전각과 1-성 헬릭스(one star helix)의 축 방향 상승 거리를 구할 수 있습니다. 이 두 실수는 튜브의 나선 대칭성(screw symmetry)을 나타냅니다.

3D 재구성은 Iman 프로그램인 Boxer를 이용한 입자 분할로 시작됩니다. 헬릭스 입자가 포함된 마이크로그래프를 연 후, Boxer의 제어 패널에서 입자를 겹치는 세그먼트로 자릅니다. 헬릭스 모드를 선택하고 박싱을 위한 매개변수를 설정합니다.

박스의 크기는 입자의 직경보다 커야 하며, OLA 값은 박스 크기의 약 90%여야 합니다. 설정 후 입자 박스의 어느 한쪽 끝을 클릭하면 헬릭스 길이를 따라 일련의 입자 박스가 자동으로 생성되며, 박스 처리된 세그먼트와 해당 좌표가 저장됩니다. 다음 단계는 I-H-R-S-R로 처리하기 전, 반복적 헬릭스 실공간 재구성 방법인 I-H-R-S-R을 사용하여 초기 3D 재구성을 수행하는 것입니다.

cryo-EM 이미지의 대비를 반전시키고 LOWPASS 필터링을 적용합니다. 그런 다음 generator를 입력하여 I-H-R-S-R 프로그램의 그래픽 인터페이스를 엽니다. 스택의 이름과 경로, 스택 내 이미지 수 및 대칭 매개변수 값을 포함하여 박싱된 입자 스택에 대한 모든 정보를 그래픽 인터페이스에 입력합니다.

완료 버튼을 클릭하여 재구성 스크립트를 생성하십시오. B 25 SP.I 초기 참조로 중실 또는 중공 실린더를 사용하며, 정의된 나사 대칭에 더 이상 변화가 없을 때까지 절차를 반복합니다. 이는 일반적으로 몇 차례의 사이클 후에 발생합니다. 우선성 헬릭스 대칭을 사용하면 안정적으로 수렴된 재구성 결과를 얻을 수 있습니다.

마지막 사이클에서 생성된 재구성은 추가 정밀화를 위한 초기 참조로 사용됩니다. 마지막으로, I-H-R-S-R에 의해 생성된 3D 밀도 맵을 정밀화 과정 중 추가 정밀화를 위한 초기 참조로 사용하여 반복적 정밀화를 통한 3D 재구성을 수행합니다. 나선 대칭은 I-H-R-S-R 절차에서 결정된 서브유닛 간의 회전과 축 방향 상승 값으로 고정됩니다.

다음으로, spider 프로그램의 FT 및 mu 모듈인 CTF find three와 CTF tilt 프로그램을 사용하여 마이크로그래프에 존재하는 디포커스(defocus)와 난시(astigmatism)를 결정하고, 입자 세그먼트에 대비 전달 함수(contrast transfer function, CTF)를 곱합니다. 다중 참조 정렬(multi reference alignment)을 사용하여 참조 볼륨의 투영 이미지와 CTF가 보정된 이미지를 비교함으로써 투영 매칭(projection matching)을 수행합니다. 평면 외 기울기 각도의 변화는 ±10°로 제한하고 1° 단계로 샘플링하며, 0° 또는 180°에 가까운 평면 내 각도에서의 높은 상관 계수 및 제한된 X축 이동과 같은 제약 조건을 도입합니다.

각 세그먼트의 정렬 파라미터의 경우, 제약 조건을 충족하는 세그먼트만 재구성에 포함합니다. 각 반복 정밀화 주기 이후, 역투영(back projection)을 사용하여 3D 재구성을 생성하고 이를 CTF 제곱 값으로 나누어 나선 대칭을 적용함으로써 대칭 평균화된 볼륨을 생성합니다. 새로운 3D 재구성의 해상도에서 더 이상의 개선이 나타나지 않을 때 반복 정밀화를 종료합니다.

단일 HIV 캡시드 어셈블리인 92 e 튜브를 박스 아웃(boxed out)하고 푸리에 변환을 계산하여 헬릭스 인덱싱(helic indexing)을 수행하였으며, 두 반지름, 층선(layer line) 번호 및 층선 10과 01의 최대 진폭 반지름을 결정하였습니다. 이후 10과 01에 대해 각각 -12와 11의 끝값을 계산하였으며, 반복 거리(repeat distance)는 5195.48 angstroms였습니다. 튜브의 나선 대칭(screw symmetry)은 delta Z = 6.81 angstroms 및 delta five = 328.88 degrees로 결정되었습니다. I-H-R-S-R을 사용하여 delta Z와 delta five를 각각 7.13 angstroms와 328.86 degrees로 정밀화하였으며, 10회의 반복 사이클 후에 초기 재구성(reconstruction) 결과가 생성되었습니다.

반복적 정밀화를 거친 최종 재구성은 I-H-R-S-R로 계산된 초기 모델에 비해 밀도 맵을 상당히 개선하였습니다. 캡시드 조립 튜브의 밀도 맵은 튜브 축과 평행하며 표면에 근접한 세 개의 직교 단면, 튜브 축에 수직인 단면, 그리고 튜브 축과 평행하게 축을 관통하는 단면으로 표시됩니다. 표시된 구조는 100% 부피를 포함하도록 1.8 Sigma에서 등고선 처리된 3D 밀도 맵의 표면 렌더링 결과입니다.

이 영상을 시청하고 나면, 저온 전자 현미경(cryo electron microscopy)을 사용하여 조립된 분자의 3D 구조를 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.