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박테리아는 적절한 자극에 반응하여 뉴클레오티드 두 번째 메신저인 NSM(세포내 신호 분자)을 생성합니다. 이 분자는 표적 단백질에 결합하고 박테리아 기능을 조절합니다.
리간드 분석의 차등 방사형 모세관 작용을 사용하여 이러한 표적 단백질을 식별하려면 가용성 단백질을 포함하는 박테리아 세포 용해물이 있는 멀티웰 플레이트를 사용합니다. 이 단백질은 게놈에서 개별 ORF(개방형 판독 프레임)를 발현하는 다양한 박테리아 클론에서 파생되어 각 웰이 고유한 단백질을 갖도록 합니다.
구아노신 테트라 인산염과 펜타 인산염 - 방사성 인으로 표지된 NSM의 혼합물을 첨가하십시오. 이 분자는 용해물의 표적 단백질에 결합합니다. 핀 도구를 사용하여 각 우물에서 동일한 양의 액체를 수집합니다. 도구를 니트로셀룰로오스 멤브레인 위에 올려 액체를 반점으로 침전시킵니다.
표적 단백질은 비공유 상호 작용을 통해 막에 결합하여 확산을 방지합니다. 이것은 결합된 방사성 표지 NSM을 적용의 중심 지점에 격리합니다. 자유 NSM은 모세관 작용을 통해 액상과 함께 방사형으로 확산됩니다.
형광체 이미징을 사용하여 방사성 신호를 감지하고 반점의 디지털 이미지를 얻습니다. 두 개의 원을 사용하여 스폿을 정의합니다. 바깥쪽은 확산된 NSM의 주변을 나타냅니다. 내부 원은 격리된 NSM을 나타냅니다.
결합 분율을 계산합니다 - 확산 지점의 총 방사능에 대해 내부 원에서 감지된 방사능 강도입니다. 결합 분획이 높은 지점을 찾아 NSM 결합 표적 단백질이 있는 웰을 식별합니다.
표적 단백질의 DRaCALA 스크리닝을 위해, 해동된 전세포 용해물 20마이크로리터를 96웰 V-바닥 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰에 추가하고, 각 웰에 2.5단위의 Serratia marcescens 엔도뉴클레아제를 첨가한다. 섭씨 37도에서 15분 후 용해물을 얼음 위에 20분 동안 놓습니다.
다음으로, 동일한 부피의 인 32-표지 구아노신 펜타인산염과 구아노신 테트라포스페이트를 혼합하고 혼합물에 1x 용해 완충액 #1을 첨가하여 4나노몰 구아노신 오인산 용액을 얻습니다.
다중 채널 피펫과 여과된 피펫 팁을 사용하여 10마이크로리터의 구아노신 펜타인산염 혼합물을 세포 용해물과 혼합하여 실온에서 5분 동안 배양합니다.
배양이 끝나면 96X 핀 도구를 0.01% 비이온성 세제 용액으로 30초 동안 3회 세척한 후 세척할 때마다 종이 타월로 30초 동안 건조시킨 후 핀 도구를 96웰 샘플 플레이트에 넣습니다. 30초 후 핀 도구를 똑바로 들어 올려 니트로셀룰로오스 멤브레인 위에 30초 동안 똑바로 놓습니다.
5분 동안 건조한 후, 시연된 대로 저장용 형광체 스크린 노출 및 형광체 이미징에 의한 시각화를 위해 니트로셀룰로오스 멤브레인을 투명한 플라스틱 폴더에 넣습니다.
형광체 이미저와 관련된 분석 소프트웨어에서 잠재적인 표적 단백질을 정량화하고 식별하려면 시각화된 플레이트의 .gel 파일을 엽니다.
분석할 지점을 정의하려면 "배열 분석" 기능을 사용하여 12열 x 8행 그리드를 설정합니다. 전체 반점의 바깥쪽 가장자리를 경계로 묶으려면 큰 원을 정의합니다. 정의된 큰 원의 "Volumn+Background" 및 "Area"를 스프레드시트로 내보내 작은 내부 점을 경계합니다. 정의된 원의 크기를 줄입니다.
정의된 작은 원의 "Volumn+Background" 및 "Area"를 내보내고 모든 데이터를 스프레드시트에 저장합니다. 필요에 따라 스폿과 겹치도록 원을 배치하고 실제 스폿보다 약간 크게 크기를 조정합니다.
방정식을 사용하여 스프레드시트의 결합 분율을 계산하고 데이터를 플로팅합니다. 그런 다음 대부분의 다른 웰에 비해 높은 결합 분획을 나타내는 웰의 잠재적 결합 단백질을 식별합니다.
