세포를 투과하는 펩타이드와 멤브레인의 상호작용을 연구하기 위한 형광 누출 분석

세포 침투성 펩타이드(CPP)는 짧고 양전하를 띤 펩타이드로, 세포막과 상호 작용하고 세포막을 가로질러 세포 불투과성 화물의 전달을 촉진할 수 있습니다.

세포막 모방을 사용하여 시험관 내에서 테스트 CPP의 막 투과 가능성을 연구하려면 큰 단층 소포, LUV, 현탁액으로 시작합니다.

LUV는 막 불투과성 형광 프로브와 해당 소광제 쌍으로 로드된 인지질 이중층으로 구성됩니다. 소포 내에서 소광제는 근접하기 때문에 형광 프로브와 상호 작용하여 형광 소멸을 일으킵니다.

LUV 현탁액을 석영 형광 큐벳에 피펫팅하고 완충액을 사용하여 희석합니다. 마그네틱 바를 추가합니다. 실행 중 LUV 침전을 방지하기 위해 자기 교반이 있는 분광형광계로 옮깁니다. LUV 누출을 제거하기 위해 배경 형광을 결정합니다.

원하는 농도의 CPP를 정기적으로 LUV 현탁액에 첨가합니다.

CPP의 아미노산 잔기의 소수성과 전하를 기반으로 LUV 지질 막을 교란하여 막 침투 및 투과화를 유도합니다.

소포막 손상으로 인해 형광 프로브와 소광제가 주변 용액으로 누출되어 공간적 분리가 증가합니다. 결과적으로 프로브는 형광을 나타냅니다.

추가 CPP 용액을 추가로 추가하면 LUV 투과화 및 형광 강도가 증가합니다. CPP 첨가로 형광 강도가 증가하면 펩타이드의 막 투과 가능성이 있음을 시사합니다.

형광 누출을 측정하려면 석영 형광 큐벳에 있는 HEPES 완충액 2 1밀리리터의 LUV를 100마이크로몰 최종 농도로 희석하고 실험 중 용액의 균질화를 용이하게 하기 위해 자기 교반기를 추가합니다.

처음 100초 동안 LUV만 측정하여 배경 형광을 평가한 후 다음 900초 동안 펩타이드 용액의 분취량을 추가할 때 형광 강도의 증가로 누출을 측정합니다.

양성 대조군으로 100% 형광 누출을 측정하려면 1마이크로리터의 Triton X-100을 LUV에 첨가하여 소포를 가용화하여 분석의 마지막 100초 동안 프로브가 완전히 소멸되지 않도록 합니다. 그런 다음 공식을 사용하여 각 시점의 누출 비율을 계산합니다.