특성화 Herbivore 저항 메커니즘 : Spittlebugs에 Brachiaria 종. 예로

안녕하세요, 제 이름은 Ush Bara이며 국제열대농업센터(International Center for Tropical Agriculture)의 곤충학자입니다. 본 영상의 전반적인 목적은 협력 노력의 일환으로, 침노린재(spit bug) 저항성을 강화하기 위한 육종 계획을 지원하기 위해 기주 식물의 해충 저항성 메커니즘을 특성화하는 방법을 시연하는 것입니다. 여기서는 화본과 식물(grasses)을 예시로 들어 설명하겠습니다.

침뱉기 벌레(Spit bugs)는 열대 초지, 사탕수수, 옥수수를 포함하여 경제적으로 중요한 많은 화본과 식물의 심각한 해충입니다. 미국 열대 지방에서는 gen 박테리아에 속하는 초지가 이들의 가장 중요한 기주 식물입니다. 식물은 세 가지 광범위한 메커니즘을 통해 초식 동물의 피해에 저항할 수 있습니다.

Antixenosis(기피성)는 때로 비선호성이라고도 하며, 초식 곤충이 식물을 선택할 수 있을 때 해당 식물을 피하는 정도를 의미합니다. Antixenosis는 일반적으로 초식 곤충이 두 개 이상의 유전자형에 접근할 수 있는 선택 시험을 통해 검출됩니다. Antibiosis(항생성)는 식물이 이를 섭식하는 초식 곤충의 적응도에 영향을 미치는 정도를 말합니다.

마지막으로, 내성은 HBO의 성장과 번식에 지장을 주지 않으면서 식물이 HBO에 의해 유발된 피해를 견디거나 복구할 수 있는 정도를 의미합니다. 항생 작용과 내성은 모두 HBO가 제한된 구역 내에서 단일 식물만을 섭식하도록 강제하는 무선택 검정(no choice test)을 통해 가장 잘 검출됩니다. 본 영상에서는 spit bug IV의 항생 작용 내성을 추정하기 위해 설계된 무선택 검정을 시연하겠습니다. aria grass의 경우, 기주 식물의 저항성이 spit bug 관리의 핵심 전략입니다.

하지만 강력한 항생제에 기반한 저항성은 더 독성이 강한 해충 생물형에 대한 선택압을 형성할 수 있습니다. 반면, 내성에 기반한 저항성은 침샘 벌레 개체군이 식물을 압도할 때까지 계속 성장하도록 방치할 수 있습니다. 따라서 지속적인 저항성을 확보하기 위해서는 항생제와 내성 모두가 어느 정도 수준으로 필요할 수 있습니다.

본 프로토콜에서는 침뱉개미(spit bug) 저항성에 대한 각 요인의 상대적 기여도를 추정하는 방법을 설명합니다. Aria 유전자형은 국제 열대 농업 센터(International Center for Tropical Agriculture)의 생식질 은행(germ Plasm Bank)에서 얻은 것입니다. 식물은 실험 단위로 사용된 성숙한 식물에서 단일 줄기 꺾꽂이를 통해 영양 번식시켰습니다.

식재 재료의 균일성을 확보하고 식물 병원균에 의한 오염을 방지하기 위해 삽수를 10 centimeters 길이로 다듬습니다. 삽수를 3% sodium HypoChlor 용액에서 2분 동안 세척한 후, 수돗물로 충분히 헹굽니다. 각 삽수를 스티로폼 컵 하단부로 밀봉하고 PVC 부싱으로 캡을 씌운 PVC 튜브 내의 약 36 grams 멸균 토양에 식재합니다.

절단된 식물체는 부싱의 중앙 개구부에 배치된 폼 링으로 고정합니다. 식물에 시비를 실시하고, 적절한 토양 수분을 유지하기 위해 관수합니다. 곤충을 접종하기 전 한 달 동안 식물을 성장시켜 표층 뿌리가 발달하도록 하며, 이 뿌리는 뿌리 섭식의 먹이처 역할을 하게 됩니다.

충해 유발 8일 전부터 Spittle bog NIMS의 식물을 뒤집어 놓으면 표면 뿌리의 성장이 더욱 촉진되어, 뿌리 구조의 내재적 차이를 부분적으로 조정할 수 있습니다. 이 단계에서는 인공 광원이 필요하며, 24시간 내내 빛을 제공합니다. 표면 뿌리가 거의 없거나 전혀 없는 식물들입니다.

이후 이러한 역전 처리는 실험에서 제외됩니다. 식재 30일 후, 각 식물의 토양 표면에 저희의 거품벌레 군락에서 얻은 성숙한 알 6개를 접종합니다. 이 군락을 형성하기 위해, 야외에서 수집하여 종을 확인한 성체 거품벌레를 케이지에 넣고 먹이로 감수성 aria 잎을 제공합니다. 암컷은 케이지 바닥에 배치한 얕은 제거 트레이 속의 토양에 알을 낳습니다.

며칠 후, 토양을 물에 현탁시키고 일련의 체에 걸러 알을 수집합니다. 30% saline 용액에 처리된 물질을 현탁시키면 성숙한 알은 떠오르고, 미성숙한 알은 잔류 유기물에 남게 됩니다. 곤충 병원균에 의한 오염을 방지하기 위해 알을 0.5% sodium hypochlorite 용액으로 5분 동안 소독한 후 증류수로 헹굽니다. 이후 부화 직전의 성숙한 알만을 선택하여 감염에 사용합니다.

곤충의 눈에 해당하는 전단부에 두 개의 붉은 점이 있는 것으로 이들을 식별할 수 있습니다. 곤충의 복부에 해당하는 후단부에는 분홍색 표시가 있으며, 아perm이 완전히 확장되어 있습니다. 부화 성공 여부는 4일 후에 확인하며, 부화하지 않은 알은 신생 유충 블록으로 교체합니다.

콜로니 테스트 결과입니다. 식물은 6회 반복의 랜덤화 완전 블록 설계(randomized complete block design)로 배치되었습니다. 실험은 침입 후 약 30일 후에 평가되었습니다.

식물 피해 점수를 측정함으로써 내성을 추정할 수 있습니다. 반면, 곤충의 생존 점수는 항생제의 효능을 추정하는 지표가 됩니다. 피해 점수는 1에서 5까지의 시각적 척도를 사용하며, 1은 가시적인 피해가 없는 상태, 5는 식물이 고사한 상태에 해당합니다.

다음으로, 최종 인설트(ins insert) 또는 성충 단계에 도달한 곤충의 수를 세어 생존율을 평가합니다. 저항성 기작을 분류하기 위해, X축에는 곤충의 생존율을, Y축에는 식물 피해도를 표시한 도표를 사용하여 결과를 시각화하는 것이 유용합니다. 왼쪽으로 이동할수록 항생성(Antibias)이 증가합니다.

반면, 위에서 아래로 내려갈수록 내성은 증가합니다. 초식 곤충에 대한 반응이 이 도표의 하단 절반에 해당하면 해당 식물을 저항성이 있는 것으로 간주합니다. 만약 이 반응이 왼쪽 사분면에 위치한다면, 주된 저항 기전은 항생물질입니다.

반응이 우측 사분면에 위치하면 주된 저항 기제는 내성입니다. 다음은 저희 스크리닝 데이터의 대표적인 샘플입니다. 상단의 점들은 감수성 식물을 나타냅니다.

왼쪽 하단 사분면의 점들은 항생 작용에 의해 저항성을 갖는 식물을 나타냅니다. 오른쪽 하단 사분면의 점들은 내성에 의해 저항성을 갖는 식물을 나타냅니다. 우리는 방금 항생 작용과 내성이 식물 저항성에 기여하는 상대적 정도를 추정하기 위한 무선택 검정(no choice assay) 시연을 살펴보았습니다.

우리는 Aria의 침 뱉는 벌레 저항성을 예로 들어 설명하였으나, 제시된 원리는 다른 시스템에도 적용될 수 있을 것입니다. 저희의 영상이 여러분의 연구에 도움이 되기를 바랍니다. 행운을 빕니다.