단백질과 단백질의 상호작용을 검출하기 위한 Biotinylated Cell-Penetrating Peptide 프로브

세포에서 단백질은 구조의 특정 서열을 통해 상호 작용하는 단백질에 결합하여 세포 내 단백질 기능을 조절합니다.

세포 내 단백질 상호작용을 검출하려면 부착 세포 배양을 취하십시오. 매체를 흡인합니다.

비오티닐화된 세포 침투 펩타이드, BCPP 용액을 첨가하고 배양합니다.

각 BCPP에는 표적 세포내 단백질에 대한 특이적 결합을 돕는 펩타이드 서열이 포함되어 있습니다. 펩타이드는 펩타이드의 N-말단에 세포 침투성 펩타이드인 CPP를 가지고 있고 C-말단에는 비오틴이 있어 쉽게 검출할 수 있습니다.

배양하는 동안 양전하를 띤 CPP 영역은 결합된 펩타이드가 세포막을 통해 세포질에 도달하는 것을 촉진합니다. 펩타이드는 세포 내 상호 작용 단백질 파트너에 결합하여 BCPP-표적 단백질 복합체를 형성합니다.

세포막을 파열시키고 BCPP 표적 단백질 복합체 및 기타 세포 성분을 방출하는 세제 분자를 포함하는 완충액을 추가합니다.

BCPP의 비오틴에 특이적으로 결합하는 당단백질인 아가로스 비드 결합 아비딘 용액을 첨가합니다. 인큐베이팅하여 아비딘이 비오틴에 비가역적으로 결합하고 아비딘-BCPP-표적 단백질 복합체를 정제할 수 있도록 합니다.

원심분리하여 구슬을 펠릿화합니다. 비드를 완충액에 재현탁하여 단백질 사이의 비공유 결합을 절단하고 비오틴-아비딘 비드에서 CPP-펩타이드-단백질 복합체

웨스턴 블로팅으로 CPP-펩타이드-단백질 복합체를 분석합니다. CPP-펩타이드-단백질 복합체의 분자량 밴드가 복합체의 성분보다 높다는 것은 상호 작용하는 단백질 파트너 간의 성공적인 상호 작용을 나타냅니다.

BCPP의 원액 부피를 세포 배양에 첨가하여 효과적인 것으로 입증된 농도에 도달합니다.

따라서 배양 배지 밀리리터당 TAT-Connexin-43_266-283-비오틴 밀리리터당 2밀리그램 92.8마이크로리터를 첨가합니다. 세포를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 인큐베이터에 30분 동안 넣어 BCPP와 세포내 파트너 간의 상호 작용이 일어나

단백질 추출을 수행하려면 먼저 배양 배지를 완전히 흡인합니다. 그런 다음 세포 박리를 방지하기 위해 150cm당 10ml의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수로 세포를 매우 조심스럽게 세척합니다.

세포 용해물을 얻으려면 150제곱센티미터 플라스크당 3밀리리터의 용해 완충액을 첨가하고 세포 스크레이퍼를 사용하여 표면을 철저히 긁어냅니다. 플라스크를 약 45도로 기울이면 세포 용해물을 해당 튜브로 더 쉽게 모을 수 있습니다.

튜브당 세포 용해물 1밀리리터를 조건별로 표시된 1.5밀리리터 튜브 3개에 붓습니다. 풀다운의 경우 1.5밀리리터 튜브를 섭씨 4도에서 10분 동안 11,000 x g으로 원심분리합니다.

상청액을 A로 표시된 새 튜브로 옮깁니다. 조건별로 상청액의 분취량을 B로 표시된 다른 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 50마이크로리터의 용해물에 대해 16.6마이크로리터의 4x Laemmli 완충액을 첨가하고 섭씨 영하 20도에서 동결합니다. 다음으로, NeutrAvidin 아가로스를 부드럽게 흔들어 매우 잘 균질화합니다.

피펫 팁의 팁을 잘라 직경을 늘리고 비드의 피펫팅을 개선합니다. 그런 다음 A 튜브에 세포 용해물 밀리리터당 50마이크로리터의 NeutrAvidin 아가로스를 추가합니다. 세포 용해물을 섭씨 4도에서 밤새 매우 부드럽게 흔들면서 배양하여 NeutrAvidin이 세포 내 파트너에 결합된 BCPP와 상호 작용할 수 있도록 합니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 1분 동안 3,000배 g으로 원심분리하여 단백질과 NeutrAvidin의 복합체를 수집합니다. 상청액을 조심스럽게 제거하고 C라고 표시된 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 풀다운이 성공하지 못할 경우를 대비하여 보관하십시오.

NeutrAvidin의 복합체를 단백질로 세척하려면 A 튜브의 펠릿에 신선한 용해 완충액을 첨가하십시오. 펠릿을 반전시켜 재현탁하고 원심분리를 반복합니다. 이 세탁을 5회 더 반복합니다. 이 모든 상청액은 폐기될 수 있습니다.

다음으로, 150제곱센티미터의 합류 세포 플라스크에서 얻은 펠릿을 위해 1.5밀리리터 튜브당 40마이크로리터의 2x Laemmli 완충액을 추가합니다. 그런 다음 섭씨 100도에서 5분 동안 용리하여 단백질 간의 상호 작용을 해리합니다.

출 후, 8,200배 g에서 30초 동안 원심분리하여 NeutrAvidin 비드를 펠릿화합니다. 모세관 팁이 있는 해리된 단백질을 포함하는 상청액을 D로 표지된 새 튜브로 옮깁니다.

이러한 상청액은 이제 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 웨스턴 블롯에 로드할 준비가 되었거나 섭씨 영하 20도에서 동결될 수 있습니다.