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형광 변동 분광법은 샘플에서 단백질의 올리고머화 상태를 결정할 수 있습니다.
시작하려면 형광 표지된 단백질 단량체 용액이 들어 있는 챔버 슬라이드를 가져옵니다. 슬라이드를 공초점 현미경 아래에 놓습니다. 레이저 빔을 샘플의 작은 부분(공초점 부피)에 집중시켜 단백질 단량체를 여기시킵니다.
단백질 분자는 브라운 운동으로 인해 공초점 부피 안팎으로 확산됩니다. 이러한 움직임은 형광 강도의 급격한 변화를 일으켜 시간이 지남에 따라 형광 강도의 변동을 초래합니다.
두 단백질 단량체가 결합하여 이량체를 형성하는 데 도움이 되는 2가 리간드인 이량체화제를 추가합니다. 이량체화로 인해 두 개의 형광 표지가 함께 모여 단일 입자를 형성하여 입자당 형광 강도, 즉 분자 밝기를 증가시킵니다.
이량체화로 인한 분자 밝기의 증가는 두 개의 형광 표지가 공초점 부피에 함께 들어오고 나가기 때문에 형광 변동의 진폭을 증가시킵니다.
이량체화제를 첨가하기 전과 후의 시간에 따른 공초점 부피의 이미지를 얻습니다.
공초점 이미지에서 개별 픽셀의 밝기를 계산하고 시간 경과에 따른 평균 밝기 곡선을 얻습니다.
이량체화제를 첨가하면 각 입자의 이중 형광 신호로 인해 밝기가 2배 증가하는 반면 총 단백질 분자 수는 동일하게 유지되어 이량체의 형성을 나타냅니다.
멀티웰 플레이트 어레이를 설정하려면 먼저 크기 배제 크로마토그래피에 사용되는 것과 동일한 완충액에 100나몰 정제된 FKBP12 용액을 준비합니다. 골재 형성을 방지하기 위해 13,000RPM의 빠른 회전으로 초음파 처리 및 원심 분리.
이제 희석된 단백질 100-200마이크로리터를 바닥이 유리로 있는 8웰 관찰 챔버에 피펫팅합니다. BB 이량체를 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 및 500 나노몰의 최종 농도로 첨가합니다. 참고로 100나노몰 mVenus 단독으로 용액을 준비하여 잠재적인 응집 및 침전 효과를 평가하고 동일한 획득 설정으로 단량체에 대한 밝기 값을 복구합니다.
디지털 검출기 또는 잘 특성화된 아날로그 검출기가 장착되어 획득한 모든 픽셀에 대해 일정한 체류 시간을 유지할 수 있는 모든 광주사 현미경 공초점 시스템을 사용할 수 있습니다. 형광 상관 분광법을 위해 설계된 칼라 보정 침수 대물렌즈를 선택하십시오.
이제 칼라 보정 침수 대물렌즈에 물 한 방울을 추가합니다. 8웰 관찰실을 스테이지에 장착합니다. 514나노미터 레이저를 켜고 대물렌즈 출구에서 20-100나노와트 전력으로 설정하여 여기 빔 경로를 설정합니다. 하나의 HyD 감지기를 켭니다. 광자 계수가 가능한 검출기가 바람직합니다. 520에서 560나노미터 사이의 방출 창을 선택합니다.
획득 모드의 경우 16 x 16 픽셀을 사용합니다.
프레임 시간이 단백질 확산보다 길고 픽셀 체류 시간이 훨씬 짧도록 픽셀 체류 시간을 설정합니다. 이는 이 데모에 사용된 시스템의 체류 시간을 약 13마이크로초로 설정하는 것과 일치합니다.
약 545나노미터의 해당 방출에 대해 핀홀을 하나의 Airy 단위로 설정합니다. xy-time 획득 모드를 선택하고 획득 및 웰당 획득할 프레임 수를 선택합니다. 이제 픽셀 크기를 약 120나노미터로 설정합니다.
시스템에 고처리량 모드가 장착되어 있는 경우 각 유정의 좌표와 유정당 획득 수를 도입하여 프로세스를 자동화합니다. 시스템에 관류 시스템이 장착되어 있는 경우 BB 용액을 로드하고 5,000번째 프레임 직후에 관류가 시작되도록 프로그래밍하여 10,000개의 이미지를 획득하면서 이량체화 동역학을 평가합니다.
올바른 웰을 선택하고 솔루션에 집중하십시오. 그런 다음 획득을 시작하고 결과 이미지 스택을 TIFF 형식으로 저장합니다.
