RNA-단백질 상호작용을 식별하기 위한 SELEX 기반 체외 결합 분석

기하급수적 농축에 의한 리간드의 체계적인 진화인 SELEX를 통해 단백질 결합 RNA 서열을 식별할 수 있습니다.

먼저, 고도로 특이적인 구조로 접히는 무작위 서열을 가진 방사성 표지 RNA를 포함하는 무작위 RNA 풀을 얻습니다. 표적 단백질과 함께 배양합니다. 단백질은 특정 서열과 3차원 구조를 가진 RNA 분자에 결합하는 반면, 비특이적 RNA는 결합되지 않은 상태로 유지됩니다.

혼합물을 니트로셀룰로오스 필터에 통과시킵니다. 결합되지 않은 RNA는 필터 기공을 통과하는 반면 RNA-단백질 복합체는 유지됩니다.

RNA-단백질 복합체 함유 필터를 조각으로 자릅니다. 표적 단백질 농도가 감소된 RNA 풀을 배양하여 RNA-단백질 상호작용을 반복하여 고친화성 서열 결합만 허용하고 저친화성 서열은 결합하지 못합니다.

이 혼합물을 폴리아크릴아미드 겔에 로드하고 전기영동을 수행합니다. RNA-단백질 복합체는 친화성이 낮고 결합되지 않은 RNA에 비해 겔을 통해 천천히 이동합니다. X선 겔 이미징은 RNA-단백질 복합체 위치에 해당하는 밴드 이동을 보여줍니다.

복합체 함유 젤 부분을 슬라이스합니다. 필터 조각과 겔 슬라이스에 Proteinase K를 첨가하여 단백질을 소화하고 복합체에서 RNA를 방출합니다. 페놀-클로로포름을 첨가하고 원심분리하여 소화된 단백질에서 RNA를 분리합니다.

RNA 함유 상청액을 아세트산나트륨 및 에탄올과 혼합합니다. RNA를 침전시키기 위해 원심분리기. RNase가 없는 물에 재현탁합니다. RNA를 상보적인 DNA로 역전사하고 DNA를 PCR 증폭합니다.

필터 기반 및 겔 기반 분리를 여러 차례 반복하여 표적 단백질 특이적 DNA 서열 풀을 얻습니다.

100마이크로리터의 반응 부피로 단백질과 RNA를 결합하려면 먼저 50밀리몰 염화칼륨, 1밀리몰 DTT, 마이크로리터당 0.09마이크로그램의 소 혈청 알부민, 마이크로리터당 0.5단위의 RNAsin, 0.15마이크로그램의 tRNA 및 1밀리몰 EDTA를 포함하는 pH 7.5에서 10밀리몰 트리스-염산염을 준비합니다. 그런 다음 적절한 풀에서 30마이크로리터의 재조합 단백질 PTB와 10마이크로리터의 RNA를 추가합니다.

결합 반응이 들어 있는 튜브를 섭씨 25도에서 약 30분 동안 온도 블록에 넣습니다. 다음으로, 결합되지 않은 RNA에서 결합된 RNA를 4차례의 선택 및 증폭을 통해 분획합니다. 먼저, 진공 매니폴드에 부착된 니트로셀룰로오스