RNA-단백질 상호작용을 식별하기 위한 SELEX 기반 체외 결합 분석

기하급수적 농축에 의한 리간드의 체계적인 진화인 SELEX를 통해 단백질 결합 RNA 서열을 식별할 수 있습니다.

먼저, 고도로 특이적인 구조로 접히는 무작위 서열을 가진 방사성 표지 RNA를 포함하는 무작위 RNA 풀을 얻습니다. 표적 단백질과 함께 배양합니다. 단백질은 특정 서열과 3차원 구조를 가진 RNA 분자에 결합하는 반면, 비특이적 RNA는 결합되지 않은 상태로 유지됩니다.

혼합물을 니트로셀룰로오스 필터에 통과시킵니다. 결합되지 않은 RNA는 필터 기공을 통과하는 반면 RNA-단백질 복합체는 유지됩니다.

RNA-단백질 복합체 함유 필터를 조각으로 자릅니다. 표적 단백질 농도가 감소된 RNA 풀을 배양하여 RNA-단백질 상호작용을 반복하여 고친화성 서열 결합만 허용하고 저친화성 서열은 결합하지 못합니다.

이 혼합물을 폴리아크릴아미드 겔에 로드하고 전기영동을 수행합니다. RNA-단백질 복합체는 친화성이 낮고 결합되지 않은 RNA에 비해 겔을 통해 천천히 이동합니다. X선 겔 이미징은 RNA-단백질 복합체 위치에 해당하는 밴드 이동을 보여줍니다.

복합체 함유 젤 부분을 슬라이스합니다. 필터 조각과 겔 슬라이스에 Proteinase K를 첨가하여 단백질을 소화하고 복합체에서 RNA를 방출합니다. 페놀-클로로포름을 첨가하고 원심분리하여 소화된 단백질에서 RNA를 분리합니다.

RNA 함유 상청액을 아세트산나트륨 및 에탄올과 혼합합니다. RNA를 침전시키기 위해 원심분리기. RNase가 없는 물에 재현탁합니다. RNA를 상보적인 DNA로 역전사하고 DNA를 PCR 증폭합니다.

필터 기반 및 겔 기반 분리를 여러 차례 반복하여 표적 단백질 특이적 DNA 서열 풀을 얻습니다.

100마이크로리터의 반응 부피로 단백질과 RNA를 결합하려면 먼저 50밀리몰 염화칼륨, 1밀리몰 DTT, 마이크로리터당 0.09마이크로그램의 소 혈청 알부민, 마이크로리터당 0.5단위의 RNAsin, 0.15마이크로그램의 tRNA 및 1밀리몰 EDTA를 포함하는 pH 7.5에서 10밀리몰 트리스-염산염을 준비합니다. 그런 다음 적절한 풀에서 30마이크로리터의 재조합 단백질 PTB와 10마이크로리터의 RNA를 추가합니다.

결합 반응이 들어 있는 튜브를 섭씨 25도에서 약 30분 동안 온도 블록에 넣습니다. 다음으로, 결합되지 않은 RNA에서 결합된 RNA를 4차례의 선택 및 증폭을 통해 분획합니다. 먼저, 진공 매니폴드에 부착된 니트로셀룰로오스 필터를 통해 실온에서 100마이크로리터 샘플을 여과합니다. RNA-단백질 복합체는 필터에 남아 있습니다.

멸균 면도날을 사용하여 필터를 조각으로 자르고 원심분리기 튜브에 삽입합니다. 필터 조각을 프로테이나제 K 완충액에 담그고 텀블러 위에 최소 3시간 또는 밤새 놓아 RNA를 회수합니다.

RNA 샘플을 탈단백질화하려면 동일한 부피의 페놀-클로로포름, 소용돌이를 추가합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 고속으로 원심분리합니다. 수성상을 얻고 다시 클로로포름으로 추출합니다. 그 후, 상청액을 pH 5.2에서 1/10 부피의 3몰 아세트산나트륨 및 2-3부피의 무수 에탄올과 혼합합니다.

튜브를 섭씨 -80도의 냉동실에 30분 동안 방치한 다음 고속으로 10분 동안 원심분리합니다. 70% 에탄올로 세척 및 건조 단계를 반복하고 RNA를 DEPC 처리수에 가용화합니다. 필터 결합 분석의 첫 번째 라운드 후 세 라운드를 더 수행합니다.

다음으로, 두 차례의 전사, 결합 및 증폭을 수행하여 단백질 결합 RNA 분획을 결합되지 않은 분획에서 분리합니다. 0.5x TBE 완충액에 60:1 아크릴아미드 비사크릴아미드 비율의 천연 5% 폴리아크릴아미드 겔을 프리캐스트합니다. 그런 다음 RNA-단백질 결합 반응을 설정합니다.

젤을 섭씨 4도의 냉장실에서 0.5x TBE 완충액으로 채워진 전기영동 장치에 넣습니다. 250볼트를 15분 동안 바르고 결합 반응을 다른 웰에 피펫팅합니다. 그 후에, 더 나아가, 250볼트에서 1 내지 2시간 동안 전기영동을 실행하여 결합되지 않은 RNA로부터 결합된 RNA를 분획한다.

다음으로, 겔을 X선 필름에 노출시키고 자가방사선 촬영을 사용하여 결합된 RNA의 위치를 식별합니다. 결합된 RNA로 겔 슬라이스를 잘라내어 튜브에 삽입합니다. 겔 슬라이스를 분쇄하고 단백질분해효소 K 완충액에서 3시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다. 앞서 설명한 대로 페놀-클로로포름과 클로로포름으로 추출을 반복합니다. 용해된 RNA에서 cDNA를 합성합니다.

10x RT 완충액 2마이크로리터, AMV 역전사 효소 2마이크로리터, 역프라이머 1마이크로리터, 물 5마이크로리터, 용존 RNA 10마이크로리터를 포함하여 20마이크로리터의 반응을 준비합니다. 섭씨 42도에서 60분 동안 배양합니다.

앞서 설명한 대로 20-25 PCR 주기를 사용하여 cDNA를 증폭합니다. RNA 합성, 단백질 결합, 단백질 결합 및 비결합 분획의 분리 과정을 반복합니다.