단백질-포스포이노시티드 상호작용을 검출하기 위해 지원되는 지질 이중층에 대한 pH 조절 분석

포스파티딜이노시톨 4,5-중인산염 또는 PIP2는 미량의 막 결합 인산화 인지질입니다. 특정 PIP2 결합 도메인을 가진 포스포리파제 C 또는 PLC는 PIP2에 결합하여 여러 세포 과정에 필수적인 2차 메신저를 생성합니다.

시험관 내에서 PLC-PIP2 상호작용을 검출하려면 PIP2와 인지질 혼합물을 포함하는 작은 단층 소포, SUV, 산성 현탁액으로 시작하며, 그 중 하나는 pH에 민감한 형광 염료에 접합됩니다.

용액을 사전 조립된 제작된 미세유체 장치의 입구에 피펫팅하고 출구 튜브를 연결합니다. 장치를 형광 현미경 스테이지로 옮기고 고정합니다. 중력을 통해 SUV는 친수성 유리 커버슬립으로 만들어진 마이크로채널 바닥을 통과합니다.

SUV는 유리 표면에 흡착되어 용액의 pH가 둘 사이의 정전기 반발력을 감소시킵니다. SUV는 표면과 상호 작용하여 변형 및 융합되어 큰 소포를 형성합니다.

임계적인 표면 피복 후 소포는 자발적으로 파열되어 지지된 지질 이중층인 SLB를 형성합니다. 채널을 통해 완충액을 통과시켜 흡착되지 않은 소포를 제거합니다.

적절한 형광 채널을 사용하여 마이크로채널을 이미지화하여 SLB에서 pH에 민감한 염료 형광(낮은 pH에서 높은 형광)을 시각화하고 측정합니다.

재

조합 PLC 솔루션을 마이크로채널에 도입합니다. PLC의 등전점 아래에 있는 용액의 중성 pH는 PLC를 양전하를 띤다.

PIP2 결합 도메인이 있는 재조합 PLC는 PIP2에 결합하여 음전하를 띤 수산화물 이온을 이중층 표면으로 모집합니다. 이것은 이중층 표면을 보다 염기적으로 만들어 염료의 양성자 화 상태를 이동시키고 형광 소멸을 일으켜 PLC-PIP2 상호 작용을 나타냅니다.

작은 단층 소포를 포함하는 포스파티딜 이노시톨-4 5-중인산 100마이크로리터를 0.65밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 0.2 일반 염산의 6.4마이크로리터를 첨가하여 용액의 pH를 약 3.2로 조정합니다.

pH로 조정된 작은 단층 소포 용액 10마이크로리터를 입구를 통해 각 채널에 피펫을 넣고 용액이 출구에 도달할 때까지 피펫을 통해 압력을 가합니다. 피펫에서 팁을 분리하고 장치에 부착한 상태로 둡니다. 각 채널에 대해 이 단계를 반복한 후 장치를 실온에서 10분 동안 배양합니다.

마이크로채널에 소포를 주입하는 것은 장치 조립 직후에 수행해야 합니다. 한편, 입구 및 출구 튜브 세트를 절단합니다. 핀셋을 사용하여 출구 튜브 세트를 장치에