단백질-포스포이노시티드 상호작용을 검출하기 위해 지원되는 지질 이중층에 대한 pH 조절 분석

포스파티딜이노시톨 4,5-중인산염 또는 PIP2는 미량의 막 결합 인산화 인지질입니다. 특정 PIP2 결합 도메인을 가진 포스포리파제 C 또는 PLC는 PIP2에 결합하여 여러 세포 과정에 필수적인 2차 메신저를 생성합니다.

시험관 내에서 PLC-PIP2 상호작용을 검출하려면 PIP2와 인지질 혼합물을 포함하는 작은 단층 소포, SUV, 산성 현탁액으로 시작하며, 그 중 하나는 pH에 민감한 형광 염료에 접합됩니다.

용액을 사전 조립된 제작된 미세유체 장치의 입구에 피펫팅하고 출구 튜브를 연결합니다. 장치를 형광 현미경 스테이지로 옮기고 고정합니다. 중력을 통해 SUV는 친수성 유리 커버슬립으로 만들어진 마이크로채널 바닥을 통과합니다.

SUV는 유리 표면에 흡착되어 용액의 pH가 둘 사이의 정전기 반발력을 감소시킵니다. SUV는 표면과 상호 작용하여 변형 및 융합되어 큰 소포를 형성합니다.

임계적인 표면 피복 후 소포는 자발적으로 파열되어 지지된 지질 이중층인 SLB를 형성합니다. 채널을 통해 완충액을 통과시켜 흡착되지 않은 소포를 제거합니다.

적절한 형광 채널을 사용하여 마이크로채널을 이미지화하여 SLB에서 pH에 민감한 염료 형광(낮은 pH에서 높은 형광)을 시각화하고 측정합니다.

조합 PLC 솔루션을 마이크로채널에 도입합니다. PLC의 등전점 아래에 있는 용액의 중성 pH는 PLC를 양전하를 띤다.

PIP2 결합 도메인이 있는 재조합 PLC는 PIP2에 결합하여 음전하를 띤 수산화물 이온을 이중층 표면으로 모집합니다. 이것은 이중층 표면을 보다 염기적으로 만들어 염료의 양성자 화 상태를 이동시키고 형광 소멸을 일으켜 PLC-PIP2 상호 작용을 나타냅니다.

작은 단층 소포를 포함하는 포스파티딜 이노시톨-4 5-중인산 100마이크로리터를 0.65밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 0.2 일반 염산의 6.4마이크로리터를 첨가하여 용액의 pH를 약 3.2로 조정합니다.

pH로 조정된 작은 단층 소포 용액 10마이크로리터를 입구를 통해 각 채널에 피펫을 넣고 용액이 출구에 도달할 때까지 피펫을 통해 압력을 가합니다. 피펫에서 팁을 분리하고 장치에 부착한 상태로 둡니다. 각 채널에 대해 이 단계를 반복한 후 장치를 실온에서 10분 동안 배양합니다.

마이크로채널에 소포를 주입하는 것은 장치 조립 직후에 수행해야 합니다. 한편, 입구 및 출구 튜브 세트를 절단합니다. 핀셋을 사용하여 출구 튜브 세트를 장치에 연결한 다음 장치를 현미경 스테이지에 테이프

추형 튜브에 포함된 25밀리리터의 실행 완충액 세트에 흡입 튜브 세트의 한쪽 끝을 담그고 테이프로 붙여 튜브가 고정되었는지 확인합니다. 실험실 잭을 사용하여 중력 흐름을 통해 마이크로 채널을 통해 용액을 밀어내기 위해 원추형 튜브를 장치보다 높은 지면에 놓습니다.

각 입구 튜브에 대해 주사기를 사용하여 튜브의 자유 끝에서 1밀리리터의 러닝 버퍼를 끌어옵니다. 흡입구에서 피펫 팁을 제거하고 흡입구 튜브의 자유 끝을 장치에 삽입합니다. 이 과정을 반복하여 모든 입구 튜브 조각을 장치에 연결합니다. 채널을 통해 흐르는 실행 완충액은 과도한 파열되지 않은 소포를 제거하고 이중층을 실험 조건으로 평형을 유지하는 데 도움이 됩니다.

그런 다음 현미경 제어 소프트웨어를 엽니다. 왼쪽 패널에서 "현미경" 탭을 클릭하고 "10x" 대물렌즈를 선택합니다. "라이브"를 클릭한 다음 도구 모음에서 "Alexa 568" 이미지 아이콘을 클릭합니다. 미세 및 거친 조정 노브를 사용하여 마이크로 채널에 초점을 맞춥니다. 장치를 스캔하여 SLB 및 채널의 품질을 확인합니다.

그런 다음 도구 모음에서 "FL 셔터 닫힘" 이미지 아이콘을 클릭합니다. "획득" 탭을 클릭하고 "기본 조정"에서 노출 시간을 선택합니다. 노출 시간을 200밀리초로 설정합니다. 왼쪽 패널에서 "다차원 획득"을 클릭합니다. "필터" 메뉴에서 빨간색 채널을 선택합니다. 그런 다음 "타임랩스" 메뉴를 클릭합니다. 시간 간격을 5분, 지속 시간을 30분으로 설정하고 경과 메뉴

"측정" 탭에서 "원" 도구를 선택하고 모든 채널에 원을 그립니다. 원이 선택된 상태에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 "속성"을 선택합니다. "프로필" 탭에서 "모든 T"를 선택하여 형광 강도를 시간의 함수로 봅니다. 다음 단계로 진행하기 전에 이 곡선이 평형을 나타내는 고원에 도달하는지 확인하십시오.

완충 용액을 장치와 동일한 접지로 낮추어 흐름을 멈춥니다. 한 번에 하나씩 각 출구 튜브를 분리하고 피펫을 사용하여 각 단백질 희석액 200마이크로리터를 출구 채널에 도포합니다. 압력을 가하지 마십시오. 중력이 일을 하도록 하십시오. 피펫에서 팁을 분리하고 미세유체 장치에 부착한 상태로 둡니다. 각 채널에 대해 이 과정을 반복하고 이 과정에서 기포가 채널에 유입되지 않도록 합니다.

다음으로, 입구 튜브를 미세유체 장치 아래의 지면으로 내려 마이크로채널을 통해 단백질을 흐르게 시작합니다. 튜브의 자유 끝을 폐기물 용기에 테이프로 붙입니다. Pleckstrin 상동성 도메인의 희석액을 30분 동안 흐르게 합니다. 소프트웨어 왼쪽 패널의 "타임랩스" 탭에서 "시작"을 클릭하여 이미징을 다시 시작합니다.