DNA Aptamer-Thermolabile Ligand 상호 작용을 연구하기 위한 시차 주사 열량계

시차 주사 열량계는 리간드의 부재 및 존재 시 생체 분자를 변성시키는 데 필요한 열을 측정하여 생체 분자-리간드 상호 작용을 연구하는 데 도움이 됩니다.

시작하려면 유리 DNA 압타머(구조화된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드)를 포함하는 참조와 열불안정한 리간드 결합 압타머를 포함하는 샘플을 채취합니다. 리간드는 압타머의 2차 구조를 안정화합니다.

용액을 가열하여 전방 스캔을 수행합니다. 용융 온도에 도달하면 자유 압타머가 변성됩니다.

리간드 안정화 압타머는 리간드에서 해리되어 상대적으로 높은 온도에서 변성되어 자유 압타머에 비해 용융 온도가 상승합니다. 고온에서 리간드의 하위 집합은 결합 친화력이 낮은 비가역적 2차 형태를 얻습니다.

다음으로, 압타머 구조를 회복하기 위해 용액을 냉각시켜 역스캔을 수행합니다. 낮은 온도에서 샘플의 초기 및 변환된 리간드가 압타머에 결합합니다.

두 번째 순방향 스캔 동안 변환된 리간드에 대한 약한 친화력으로 결합된 압타머는 초기 리간드 결합 압타머보다 낮은 온도에서 해리 및 변성되어 용융 온도의 하향 이동을 유발합니다.

연속적인 스캔을 통해 리간드는 계속해서 2차 형태로 전환되어 초기 형태가 완전히 고갈됩니다. 서모그램을 가져옵니다.

스캔할 때마다 리간드 결합 압타머의 용융 온도가 자유 압타머 쪽으로 이동하여 2차 형태의 약한 결합 친화력을 나타냅니다.

시차 주사 열량계(DSC)에 로딩하기 전에 탁상용 탈기 장치에서 완충액, 생체 분자 및 리간드 용액을 탈기합니다. DSC에서 압력 핸들을 풉니다. 그런 다음 작업 버퍼에서 실리콘 튜브를 실행하고 참조 모세관의 전면 플랜지에 부착합니다.

후면 참조 플랜지를 전면 샘플 플랜지에 연결하여 참조 모세관과 샘플 모세관 사이에 브리지를 만듭니다. 그런 다음 진공 라인이 부착된 폐기물 플라스크로 연결되는 후면 샘플 플랜지에 실리콘 튜브 조각을 부착합니다. 진공 라인을 켜서 200밀리리터의 작업 완충액으로 DSC를 세척합니다.

약 3-5cm 길이의 실리콘 튜브 섹션을 기준 모세관 플랜지에 부착합니다. 그런 다음 1밀리리터 피펫 팁을 후면 플랜지의 실리콘 튜브에 삽입합니다. 피펫으로 0.8밀리리터의 작업 완충액을 끌어당기고 완충액이 있는 피펫 팁을 전면 기준 플랜지의 실리콘 튜브에 삽입합니다.

피펫 플런저를 부드럽게 눌러 작업 버퍼가 전면 실리콘 튜브를 통해 기준 모세관으로 통과하고 후면 플랜지의 부착된 피펫 팁으로 위로 통과시킵니다. 작업 버퍼 레벨이 전면 실리콘 튜브 바로 위에 도달할 때까지 피펫 플런저를 아래로 누릅니다. 그런 다음 작업 버퍼 레벨이 후면 실리콘 튜브 바로 위에 도달할 때까지 피펫 플런저를 놓습니다. 기준 모세관에서 작업 버퍼를 앞뒤로 계속 통과시켜 기포의 부피를 제거합니다.

그런 다음 집게손가락으로 후면 피펫 팁의 뚜껑을 덮고 후면 피펫 팁과 전면 피펫을 부드럽게 위로 당겨 실리콘 튜브가 부착된 기준 플랜지에서 제거합니다. 이전과 같이 작업 완충액으로 샘플 모세관을 로드합니다.

후면 참조 및 샘플 플랜지에 검은색 플라스틱 캡을 놓고 전면 플랜지는 덮지 않은 상태로 둡니다. 압력 핸들을 DSC에 부착한 다음 DSC 소프트웨어를 열고 전력 판독값이 안정화되면 인터페이스 상단의 빨간색 "위쪽" 화살표를 클릭하여 기기에 압력을 가합니다. DSC 전력은 기기 온도 및 압력 판독값과 함께 인터페이스 오른쪽 상단의 상자에 표시됩니다.

정방향 및 역방향 스캔을 수행하여 DSC를 작업 버퍼와 평형화합니다. 화면 왼쪽의 "실험 방법" 탭에서 DSC를 온도 스캔 모드에서 실행하려면 "스캔" 옵션이 선택되어 있는지 확인합니다.

"실험 방법" 탭 아래의 "온도 매개변수" 삽입물에서 가열 버튼을 클릭합니다. 하한 및 상한 실험 온도의 경우 섭씨 1도와 100도, 스캔 속도의 경우 분당 섭씨 1도, 평형 기간의 경우 60초를 입력합니다. 평형 기간에 대한 입력 필드 아래의 "시리즈 추가" 버튼을 클릭합니다. 팝업 창의 "추가할 단계 " 필드에 2를 입력하고 "대체 난방/냉방" 상자를 선택합니다. "확인"을 클릭합니다.

추가된 스캔은 인터페이스의 아래쪽 부분에 나타납니다. 각 검사의 매개변수가 원하는 대로인지 확인하십시오. 인터페이스 상단의 녹색 "재생" 버튼을 클릭하여 실험을 시작합니다. 원하는 창으로 이동하여 팝업 창에 실험을 저장할 파일 이름을 입력합니다. '실험 방법' 탭 오른쪽에 있는 '데이터' 탭을 클릭하여 실험 진행 상황을 확인합니다.

두 모세혈관의 작업 버퍼로 DSC를 다시 로드하여 샘플 데이터의 기준선 빼기를 위한 참조 실험을 실행합니다. 분당 섭씨 1도의 적절한 온도 범위에서 120초의 상한 평형 시간으로 여러 정방향 및 역방향 스캔을 수집합니다.

인터페이스의 아래쪽 부분에서 이전 버퍼 평형 스캔을 삭제하려면 각각을 개별적으로 강조 표시하고 인터페이스의 오른쪽 가운데에 있는 빨간색 "X"를 클릭합니다.

"시리즈 추가" 버튼을 클릭하고 "추가할 단계 " 필드에 20을 입력한 다음 "대체 난방/냉방" 상자를 선택하여 새 스캔을 추가합니다. 그런 다음 "확인"을 클릭하고 이전과 같이 녹색 "재생" 버튼을 클릭하여 실험을 실행합니다.

리간드에 대한 참조 실험을 얻기 위해 양쪽 모세혈관에 원하는 농도의 리간드를 포함하는 작업 완충액을 사용하여 이 단계를 반복합니다. 열불안정한 리간드 변환을 위한 속도 상수를 획득하는 데 사용할 두 개의 개별 실험을 수집합니다.

유리 생체 분자 데이터 세트의 경우, 참조 모세관에 작업 완충액이 포함되어 있고 샘플 모세관에 작업 완충액에 원하는 농도의 유리 생체 분자가 포함되어 있는지 확인했습니다. 다음으로, 참조 스캔에 사용된 것과 동일한 DSC 로딩 절차와 실험 매개변수를 사용하여 샘플 실험을 실행합니다.

리간드 결합 실험의 경우, 리간드가 기준 모세관의 작업 완충액에 있고 생체 분자와 리간드가 샘플 모세관의 작동 완충액에 있는지 확인합니다. 이전과 같이 다른 리간드를 추가하는 사이에 시스템을 세척합니다.

고온 평형 기간이 600초로 증가하고 다른 모든 실험 매개변수는 이전과 동일한 열불안정성 리간드에 결합된 생체 분자를 사용하여 한 번 추가 실험을 수행합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터 처리 및 분석을 진행합니다.