Name: 발달 연구를위한 윈도우 치킨 계란 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: 배우세요 닭 계란 윈도우 기법을 신경생물학 실험에 활용하는 방법을. 배아 생존 시간을 연장하여 세포 운명 매핑 연구에 유용한 최적화된 프로토콜을 제공합니다.

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1. 인큐베이터에서 계란을 제거합니다 <ol><li> 37 ° C 유지 60% 위에 설정된 상대 습도. </li><li> 계란을 제거, 계란 90 ° 회전 큰 기지가 수평으로 놓여 있도록. </li></ol> 2. 면봉 계란 소독을 <ol><li> 70 % 에탄올과 비 멸균 거즈의 스택을 포화. </li><li> 5 달걀까지 면봉에 2 ~ 3 조각을 사용합니다. 거즈가 더러워진 경우 폐기하십시오. </li></ol> 3. 준비 횐자위 제거 사이트 <ol><li> 그냥 알부민이 밖으로 그려진 것입니다 지역을 보호하기 위해 기본 왼쪽 3M 플라스틱 테이프 1 &quot;X 1&quot;조각을 잘라 장소. </li></ol> 4. 횐자위 제거 <ol><li> 테이프의 중간에 작은 구멍을 만들기 위해 가위의 요점을 사용합니다. </li><li> 18 게이지 1 인치 바늘과 10 CC 주사기를 사용하면 천천히 가위에 의해 만들어진 구멍을 통해 바늘을 드릴. </li><li> 계란의 바닥을 향해 45 ° C 각도에서 바늘을 아래로 드라이브. </li><li> 중앙쪽으로 바늘을 기울이기 및 횐자위의 3-4 ML을 그립니다. </li></ol> 5. 윈도우 <ol><li> 플라스틱 테이프 3 &quot;X 3&quot;조각을 잘라 계란의 상단에 맞게 그것을 스트레칭. 너무 열심히 끌어 않도록 조심하고, 계란의 수평 표면의 둥근 끝을 주변 광장의 모서리를 확장합니다. 그것이없이 주름과 달걀의 표면에 대한 꽉되도록 테이프를 당겨. </li><li> 날카로운 직선 4 &quot;해부 가위의 쌍을 사용하여 테이프가 위치했던 지역의 하단 중앙에 구멍을 비꼬아. 천천히 안쪽에 대한 도움말을 계속해야되는 계란에 가위의 낮은 블레이드 안내 쉘은. 기본 향해 칼날을 직접 천천히 껍질을 잘라 시작합니다. 시계 반대 방향으로 방식으로 진행 그냥 맨 중심에 도달하기 전에 중지.만이 작은 비트까지 가위를 제거하고 반대 방향으로가는 반복 계란 첨부. 난자가 수정된 있는지 확인 확인은. 창을 닫아 남아있다. </li></ol> 6. 폐쇄 재개와 계란을 씰링. <ol><li> 넓은 비닐 테이프 &quot;2분의 1의 길이&quot;2-3에 대한 절단하고 절단했던 구멍으로 다시 맞는 있도록 창을 종료. 테이프의 다른 한 X 1 &quot;조각을 가지고 계란이 말라 버린하는 구멍을 밀봉. 모든 조작을 할 수있는 계란을 재개하기 위해 포셉의 한 켤레를 사용. 당신은 인큐베이터에 달걀을 반환하는 준비가되면, 한 조각 잘라 창문을 봉인하고 계란의 전체 수평 표면을 충당하기 위해 충분히 큰 테이프. </li></ol>

<ol><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 224, 138-151 (2000).</li>
<li>Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. Dev Biol. 269, 26-35 (2004).</li>
<li>Cramer, K. S., Cerretti, D. P., Siddiqui, S. A. Dev Biol. 295, 76-89 (2006).</li>
<li>Huffman, K. J., Cramer, K. S. Dev Neurobiol. 67, 1655-1668 (2007).</li>
<li>Krull, C. E. Dev Dyn. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Gerlach-Bank, L. M., Cleveland, A. R., Barald, K. F. Dev Dyn. 229, 219-230 (2004).</li>
</ol>

이 방법은 실험 조작에 따라 긴 생존 시간을 허용합니다. 예를 들어, 염료 라벨링 연구는 나중에 운명 매핑 연구 (1) E10 또는 생존을 허용했다. 또한, 그것은 유전자 발현 수준의 변경 및 나중에 발달 단계 (2-6)를 진행하는 데 필요한 개발을 제공 비켜 electroporation 연구에 사용되었습니다. 이 윈도우 기술은 배아에 조작 후 생존을 요구하는 절차와 함께 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>회전 인큐베이터</td><td> </td><td>Profi</td><td></td><td>상대 습도를 60% 이상으로 설정하여 37&amp;deg; 도로 유지</td></tr><tr><td>70 % EtOH</td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>거즈</td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>3M 플라스틱 테이프</td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>10cc 주사기</td><td> </td><td></td><td></td><td>알 1개당 1개</td></tr><tr><td>18G 바늘</td><td> </td><td></td><td></td><td>1&amp;#189; 인치 바늘, 주사기당 1개</td></tr><tr><td>해부용 가위</td><td> </td><td></td><td></td><td>4&quot; 예리한 직선형 날</td></tr><tr><td>수정란</td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr></tbody></table>

발달 연구를위한 윈도우 치킨 계란

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

개발의 연구는 크게 실험 모델로 여자의 배아를 사용하여 주었되었습니다. 배아의 접근의 용이성은 여자 퀘일 chimeras 및 초점 염료 라벨 등 여러 방법을 사용하여 세포의 운명을지도하기 위해 실험에 사용할 수 있습니다. 또한, 그것은 단백질 코팅 구슬과 비켜 electroporation을 사용하여 플라스미드 DNA의 도입의 배치를 포함한 여러 종류의 분자 perturbations에 대한 수 있습니다. 이러한 실험은 중앙과 주변 신경 시스템의 개발에 중요한 데이터를 굴복했습니다. 이러한 연구의 많은 경우, 그것은 달걀 껍질을 열고 배아의 성장을 perturbing없이 reclose 필요합니다. 배아는 달걀 껍질을 다시 열어 연속 발달 단계에서 검사를하실 수 있습니다. 이 문서에서, 닭고기 계란을 열 몇 가지 훌륭한 방법이 있지만 우리는 긴 생존 시간에 대한 최적화된 한 가지 방법을 보여줍니다. 이 방법에서, 계란은 측면에 달려 있으며 작은 창이 껍질에 상처입니다. 실험 절차 후, 쉘은 개발 기간 동안 계란을 커버하는 데 사용됩니다. 달걀 껍질을 overlying 투명한 플라스틱 테이프는 배아를 보호하고 부화 기간의 남은 기간 동안 수화를 유지하는 데 도움이됩니다. 이 방법은 배양이 이틀 동안에 처음 사용되었으며, 성숙 배아 세를 통해 생존을 허용하고 있습니다.

배아의 접근의 용이성은 여자 퀘일 chimeras 및 초점 염료 라벨 등 여러 방법을 사용하여 세포의 운명을지도하기 위해 실험에 사용할 수 있습니다. 이 문서에서 우리는 긴 생존 시간에 최적화된있는 하나의 계란 준비 방법을 보여줍니다.

발생학 연구는 실험 모델로서의 병아리 배아 활용을 통해 큰 도움을 받아왔습니다. 배아의 접근 용이성은...

Kramer Lab에 오신 것을 환영합니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스 신경생물학 및 행동학과의 Matt Korn입니다. 오늘은 비드 배치, 염료 주입 또는 ovum 내 탐색을 포함한 다양한 조작을 위해 닭 달걀을 준비하는 방법을 보여드리겠습니다.그럼 더 지체하지 않고 바로 시작하겠습니다. 먼저 알을 세척하겠습니다. 그 이유는 인큐베이터 안에 들어갈 수 있는 이물질이 많기 때문입니다.이 부분을 테이프로 밀봉하겠습니다. 윈도우를 통해 알에 접근할 때 작은 이물질이 들어가는 것을 방지하여, 배아를 꺼내고자 하는 시점까지 배아가 사멸할 가능성을 줄이기 위함입니다. 인큐베이터에서 보셨듯이, 알들은 넓은 쪽이 위를 향하도록 놓여 있습니다.이제 알을 옆으로 눕히겠습니다. 이렇게 하면 두 가지 효과가 있습니다. 첫째, 관찰창이 바로 이 위치에 오게 되며, 둘째, 배아가 위로 떠올라 다양한 조작을 수행할 수 있는 상태가 됩니다.이제 인큐베이터에 있던 랙에서 몇 개의 알을 꺼내 골판지 계란 홀더로 옮기겠습니다. 이것은 원래 알이 배송될 때 상자에 함께 들어있는 부품입니다. 오늘은 단순히 알을 받쳐두는 용도로 사용하겠습니다.이제 배치는 여러분의 선택에 달려 있습니다. 저는 언제든 모든 알에 접근할 수 있고 알들이 서로 닿지 않기 때문에 이 방식을 선호합니다. 혹시라도 금이 가서 헐거워진 알을 발견해 떨어뜨리더라도, 알들 사이에 어느 정도 간격이 있기 때문입니다.이제 거즈를 가져와서 이렇게 적당한 양을 쌓은 다음 두 개로 나눕니다. 여기에 70% alcohol을 사용하여 바닥 부분이 촉촉해지는 것이 느껴질 때까지 적십니다. 이 거즈 뭉치 전체를 사용하여 모든 알을 닦아낼 것이기 때문입니다.그러면 상단에서 몇 개를 떼어내어, 우선 상단 위주로 진행하되 결과적으로는 알 전체를 거의 다 감싸도록 하겠습니다. 이 작업이 끝나면 알코올이 상당히 빠르게 건조되므로, 바로 테이프를 붙일 수 있습니다. 테이프가 잘 밀착될 것이며, 한 세트 작업을 마칠 때쯤이면 보통 첫 번째 표본이 건조되어 알 준비의 다음 단계로 진행할 수 있습니다.다시 한번, 그것을 쓰레기통에 넣고 다음 단계로 넘어갈 준비를 하겠습니다. 이제 모든 달걀을 알코올로 닦아냈으므로, 달걀의 넓은 쪽인 하단부에 배출 구멍을 낼 수 있습니다. 이렇게 하면 알부민을 일부 추출할 수 있는데, 알부민을 추출하지 않으면 배아가 적절한 위치에 자리 잡지 못하기 때문입니다.어떠한 조작도 할 수 없는 상태입니다. 따라서 저는 칼날을 사용하여 이 플라스틱 테이프를 제거하기만 하면 됩니다. 약간의 탄성이 있어 매우 유용합니다.이는 구멍이 예상보다 약간 클 경우 이를 확장하여 덮을 수 있게 해줄 뿐만 아니라, 실제로 알 전체를 덮을 때 이 부분을 늘려야 하기 때문입니다. 따라서 윈도우가 위치할 영역이 완전히 덮이게 됩니다. 이제 이런 식으로 조각을 잘라낸 다음, 약 1mm 너비의 스트립을 만들겠습니다.그리고 이를 통해 약 1mm² 크기의 테이프 조각을 만들 수 있습니다. 그런 다음, 이 조각을 날짜의 왼쪽 바로 위에 배치하겠습니다. 여기에 바로 놓으면 확인하실 수 있습니다.매우 잘 붙어 있습니다. 그런 다음 이미 만들어 둔 테이프 조각으로 돌아가서, 1mm 크기의 테이프를 다시 잘라냅니다. 그리고 다시 그 숫자의 왼쪽에 배치하는데, 이곳이 실제로 달걀의 상단 부분입니다.이제 옆으로 돌렸으므로, 오른쪽에 위치합니다. 그리고 여기에 한 조각이 더 있습니다. 현재 장갑을 착용하지 않았는데, 장갑을 끼면 테이프가 장갑에 달라붙기 때문이며 손은 이미 씻은 상태입니다.현재 단계에서는 활성 물질에 다른 것이 오염되는 것에 대해 크게 우려하지 않습니다. 따라서 끝이 뾰족한 가위를 사용하여, 테이프를 붙인 중앙 부분에 넣고 테이프가 약간 찢어질 때까지 시계 반대 방향으로 돌리겠습니다.그곳에 작은 구멍이 있는 것을 볼 수 있을 것입니다. 주사기를 삽입하면 구멍이 충분히 커지기 때문에, 처음부터 구멍을 아주 크게 만들 필요는 없습니다. 하지만 이는 바늘로 바로 찔러 알을 깨려고 시도하지 않기 위함이며, 그렇게 할 경우 알의 한쪽 면 전체가 깨지는 경우가 많기 때문입니다.그러면 더 이상 그 달걀을 사용할 수 없습니다. 이제 달걀의 내용물을 비우겠습니다. 측면에 작은 구멍이 나 있으므로, 10 mL 주사기와 비교적 굵은 게이지의 바늘을 사용하여 알부민을 추출하겠습니다.이제 3~4 mL 정도의 액체가 필요한데, 확실히 3 mL보다는 많아야 하며 4.5~5 mL를 크게 초과해서는 안 됩니다. 이렇게 하면 현재 상단에 놓인 배아가 난각에서 약간 떨어지게 되며, 이후 조작을 수행할 수 있게 됩니다.따라서 45도 각도로 진입하여 난황 아래로 들어갑니다. 그런 다음 오른쪽으로 약간 회전시켜 그 아래로 살짝 밀어 넣으면, 바늘 끝이 달걀 바닥에 닿는 느낌이 듭니다. 이제 약 3~4µL 정도를 추출하며, 매우 원활하게 추출됩니다.이제 알부민을 폐액 버킷에 넣고 다른 달걀들로 작업을 계속하겠습니다. 계속 진행하겠습니다. 보시는 것처럼 배출을 위해 뚫은 구멍이 생각보다 약간 크지만, 결과에는 지장이 없습니다.제가 주의하려는 점은 바늘을 찌를 때 더 이상 금이 가지 않게 하는 것입니다. 이제 진행하겠습니다. 네, 이미 알에 약간의 금이 간 것이 보입니다.이제 작은 균열은 괜찮지만, 균열이 알의 다른 면까지 확장될 때는 주의해야 합니다. 그리고 이 경우에는 그렇게 되었습니다. 구멍을 통해 이를 확인할 수 있습니다.거의 상단까지 뻗어 있습니다. 사실 이곳이 창문이 위치하게 될 자리입니다. 따라서 안타깝게도 이 알은 폐기해야 합니다.그리고 이를 폐기하는 데 특별한 방법은 없습니다. 별도의 프로토콜을 작성할 필요도 없습니다. 그냥 폐기물 버킷에 넣으시면 됩니다.동물성 폐기물임을 표시하기 위해 이 검은색 쓰레기통을 사용하지만, 그 외의 처리는 이미 완료되었습니다. 이제 다음 알로 넘어가겠습니다. 좋습니다, 모든 알의 배액이 끝났으므로 이제 배수 구멍을 덮어도 됩니다.이 과정은 매우 중요합니다. 인큐베이터 내부에서 조치를 취하지 않으면 남아 있는 알부민이 심하게 증발할 수 있기 때문입니다. 알이 마르게 되면 배아는 사망하게 됩니다. 따라서 비슷한 크기의 테이프를 사용하여 구멍을 덮어줌으로써, 다시 이 구멍을 통해 내부로 들어갈 필요가 없도록 하겠습니다.일부 경우, 달걀을 개봉한 후 알부민을 더 배출시키기로 결정했다면, 이 구멍이 일종의 밀폐 영역 역할을 하므로 여기에 바늘을 찔러 넣어도 알부민이 많이 소실되지 않습니다. 이제 적당한 크기의 테이프로 달걀을 덮어주겠습니다.이는 풍선에 핀을 꽂기 전에 테이프를 붙이는 것과 비슷하다고 생각합니다. 멋진 점은 풍선이 터지지 않는다는 것인데, 이 경우 달걀 위에 테이프를 조금 붙이는 것과 같습니다. 그렇게 하면 달걀이 여러 군데에서 깨지지 않으며, 이후 윈도우를 밀봉할 수 있습니다. 테이프를 사용했기 때문에 윈도우가 닫힐 때 적절한 밀봉 상태가 형성되어 증발에 대해 걱정할 필요가 없습니다.테이프의 크기를 보시면, 지금까지 자른 것 중 아마 가장 클 것입니다. 하지만 이 상태에서도 테이프를 약간 늘려 약간의 장력을 준 다음 달걀 위에 배치하겠습니다. 이제 뒤쪽으로 돌아와 달걀 위로 매우 조심스럽게 늘려 붙임으로써, 윈도우가 위치할 부분에 주름이 생기지 않도록 하겠습니다. 테이프의 위치는 조금씩 다시 조정할 수 있습니다.걱정하실 정도로 심하게 달라붙지는 않습니다. 일단 붙으면 그대로 고정됩니다. 여기 표시된 일반적인 영역이 제가 윈도우를 절개할 부위입니다.이제 모든 달걀에 테이프를 붙였으므로, 상단에 창을 낼 수 있습니다. 이 과정이 가장 까다로운 부분일 수 있으며, 종종 이 단계에서 대부분의 달걀을 손실하게 됩니다. 따라서 알코올을 묻힌 거즈로 가위를 깨끗이 닦아낸 다음, 물기를 완전히 말리겠습니다.알코올은 거의 저절로 마르지만, 알코올이 달걀 내부로 바로 들어가는 것은 피해야 합니다. 따라서 테이프가 붙은 중앙 부분을 공략하여, 약간의 균열 소리가 들릴 때까지 다시 시계 방향과 반시계 방향으로 움직여 줍니다. 그러면 칼날이 내부로 들어갔음을 알 수 있습니다.그런 다음 가위의 각도를 조절하여 달걀 표면에 거의 평평하게 밀착시킵니다. 그리고 가위 날 전체가 들어갈 때까지 조금씩 자릅니다. 약 반원 모양으로 자른 후 반대 방향으로 다시 돌아오는데, 창을 만들어야 하므로 원을 완전히 닫지는 않습니다. 그러면 이제 달걀을 열 수 있습니다.현재 상태를 보면 예상했던 연령대인 것으로 보이며, 혈관이 많지는 않지만 배아가 위치한 주변, 주로 혈액이 시작된 laion 영역 주변에 약간의 혈액이 보이고 심장 박동은 멈춘 상태입니다. 그래서 이제 이 부분을 닫고 그대로 위에 얹어둔 뒤, 다시 돌아와서 윈도우들을 닫겠습니다. 다시 한번, 표면에 평평하게 밀착시켜 반대 방향으로 밀어주십시오.좋습니다, 여기 기포가 몇 개 보이고 배아가 한쪽으로 치우쳐 있는 것을 확인할 수 있습니다. 현재 취할 수 있는 조치는 두 가지입니다. 난자가 충분하여 모든 난자를 사용할 필요가 없다면, 이 샘플은 폐기해도 됩니다.또는 창을 닫고 배아가 우리가 원하는 상단으로 다시 떠오를 수 있도록 설정할 수도 있습니다. 그렇게 하면 조작 단계에서 배아에 접근했을 때 원하는 위치에 있을 수 있습니다. 만약 그렇지 않다면, 그때 해당 배아를 폐기하면 됩니다.여기서는 단순히 각도를 기울여 놓았습니다. 알부민이 약간 흘러나오겠지만, 이는 배아가 필요한 위치로 되돌아가는 데 도움이 될 것입니다. 이제 이렇게 윈도우들을 모두 만들었으므로, 조작을 시작하기 전에 이들이 모두 닫혀 있는지 확인해야 합니다.그런 다음 달걀을 다시 밀봉하면 됩니다. 하지만 구멍이 열려 있으면 가끔 노른자가 흘러나올 수 있습니다. 다른 방으로 이동하는 동안 달걀이 약간 기울어질 때, 내용물이 전부 쏟아지는 상황은 피해야 합니다.따라서 제가 하는 작업은 플라스틱 테이프를 약 1mm 너비, 길이는 약 2~3mm 정도의 조각으로 자르는 것입니다. 그리고 이것을 중간 부분에 놓는 것을 선호합니다. 이를 알 앞쪽으로 당겨 내리면 어느 정도 단단하게 고정됩니다.윈도우가 다른 테이프가 있던 위치에 딱 맞게 들어가는 것을 볼 수 있습니다. 윈도우를 절개한 부분 덕분에 현재로서는 꽤 밀봉된 상태가 됩니다. 곧 조작 과정을 진행할 예정이므로 완전히 기밀 상태일 필요는 없습니다. 이것이 달걀을 준비하고 윈도우를 만드는 방법입니다.실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

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