결장 조직 절편의 면역조직화학적 분석을 통한 화학적 유발 대장염 평가

생쥐의 결장 점막층은 점막을 보호하는 촘촘하게 채워진 상피로 둘러싸인 고유층을 포함하는 면역 세포로 구성됩니다. 덱스트란 황산나트륨을 사용한 화학적 처리는 밀착 접합을 파괴하여 상피 세포 손상을 일으키고 내강 미생물이 고유층에 침투할 수 있도록 합니다.

결장의 미생물 인식은 케모카인 분비를 유발하여 면역 세포의 침윤과 전염증성 사이토카인의 방출로 이어집니다. 이러한 과장된 면역 반응은 결장 염증이나 대장염을 유발합니다.

화학적 유발 대장염을 평가하려면 화학적 유발 대장염을 나타내는 고정되고 전처리된 마우스 결장 조직 절편을 운반하는 유리 슬라이드로 시작합니다. 각각의 면역 세포에 결합하는 면역 세포의 수용체에 특이적인 1차 항체 칵테일로 절편을 치료합니다.

결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척하십시오. 1차 항체에 특이적으로 결합하는 비오티닐화된 2차 항체와 함께 조직 절편을 배양합니다. 비오틴과 상호 작용하여 복합체를 형성하는 스트렙타비딘-효소 접합체와 함께 배양합니다.

조직 절편을 발색 기질로 오버레이합니다. 효소-기질 상호작용은 면역 세포에 갈색 착색을 부여합니다. 세포핵을 염색하기 위해 헤마트실린 염료로 절편을 대조염색합니다.

현미경으로 염색된 슬라이드를 관찰하십시오. 손상된 부위에 갈색 면역 세포가 풍부하다는 것은 화학적 유발 대장염을 나타냅니다.

면역조직화학적 분석을 위해 핫플레이트에서 절편을 20분 동안 데운 후 슬라이드를 PBS에서 10분 동안 세척당 10분 동안 3회 세척하고 10분 동안 3% 과산화수소 배양으로 내인성 과산화효소를 제거합니다.

배양이 끝나면 시연된 대로 샘플을 PBS에서 세 번 세척하고 실온에서 최소 1시간 동안 차단 완충액으로 비특이적 결합을 차단합니다. 그런 다음 차단 완충액을 관심 있는 1차 항체 칵테일로 교체하여 섭씨 4도에서 하룻밤 배양합니다.

다음날 아침, 과잉 1차 항체 용액을 흡인하고 슬라이드를 PBS에서 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후, 슬라이드를 적절한 비오티닐화 2차 항체 칵테일과 함께 배양한 후 실온에서 스트렙타비딘 양 고추냉이 과산화효소 복합체로 라벨링합니다.

면역 반응성 세포를 시각화하려면 밝은 갈색 또는 짙은 갈색이 나타날 때까지 샘플을 DAB로 라벨링하고 헤마톡실린과 0.3% 희석 암모니아로 절편을 역조염색합니다.

슬라이드가 건조되면 광학 현미경을 사용하여 10배 배율로 조직 절편의 명시야 이미지를 얻고 이미지 처리 프로그램을 사용하여 상피와 고유층 모두에서 표시된 면역 세포의 집단을 식별하고 정량화합니다.