Name: 초기 치킨 태아의 성장 팩터 - 코팅 비즈 배치 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 배우세요 성장 인자를 이용한 병아리 태아의 세포 운명 결정 방법을. E2.5 단계 병아리 태아에 성장 인자가 함유된 비즈를 배치하여 신경 발생 및 조직 분화 메커니즘을 연구하는 실험 기법을 익히세요.

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1. 인큐베이터에서 계란을 제거합니다 E2 - 2.5에서 (~ 성 17 HH), 계란을 제거하고 그에 따라 그들을 준비합니다. 그들은 즉시에 근무하거나 몇 시간 동안 인큐베이터에 제공될 수 있습니다. 계란은 한 시간 넘게 안전하게 상온에서 설치할 수 있습니다. 계란은 노는 기간 동안 빠져 있습니다. 때때로 이들은 한 시간 이상이 걸릴 수 있습니다. 참고 : 더 이상 그들은 상온에서 앉아, 확률 그들이 생존하는 것입니다. 2. 인도 잉크의 준비 <ol><li> 멸균 PBS에서 4퍼센트 인도 잉크의 새로운 솔루션을 준비합니다. </li><li> 솔루션 3 ML의 주사기를 채우십시오. </li><li> 주사기에 27 게이지, ½ 인치의 주사를 놓으십시오. </li><li> hemostats 한 켤레를 사용하여 90 ° 각도로 바늘을 구부. </li></ol> 3. 인도 잉크의 계란과 사출 열기 <ol><li> 다시 테이프 껍질, 포셉 한 켤레를 사용하고 계란의 뒷면에 테이프의 뒷면을 사용하여 그것을 확보, 창을 엽니다. </li><li> 그것은 배 (胚) 아래에 자리잡고 단지까지 직각 바늘에 가이드. 부동 디스크에서 바늘을 배치하면 배아에 독성있는 잉크가, 직접 접촉되지 않습니다 처리됩니다. </li><li> 당신은 편안하게 대조를 만들 정도로 잉크를 주입에만 필요합니다. 이것은 일반적으로 ¼ ML보다 적습니다. </li></ol> 4. 신경 튜브 열기 <ol><li> 미세 절개의 가위를 타고 꼭대기에 자리잡고 얇은 막, 혹은 때로는 주위의 배아를 잘라. </li><li> 55 포셉 한 쌍의 또는 텅스텐 탐침을 가지고 앞쪽이 후부에서 신경 튜브를 엽니다. 시작가에 구슬을 배치하기 위해 충분히 큰 있는지 확인하십시오. </li></ol> 참고 : 나이에 따라 훌륭한 텅스텐 프로브가 같은 일을하는 데 사용할 수 있습니다. 5. 코팅 헤파린 - 아크릴 비드를 검색하는 <ol><li> 55 포셉 한 켤레를 사용하여 솔루션에 그대로 구슬을 찾으십시오. 비드가 끝에 자신을 첨부하자 천천히 포셉를 닫습니다. </li><li> 솔루션에서 비드를 제거하고 계란 위에 그것을 데려와. </li><li> 비드는 솔루션의 아웃되면 그것은 알부민에 배치되었습니다 때까지 그것은 가능성에서 오지 않습니다. </li></ol> 6. 비드 배치 <ol><li> 비드는 대상 지역의 상단에 배치되면, forebrain 방향을 안내하거나 hindbrain에서 문제를 해결하기 위해 텅스텐 탐침을 사용합니다. </li><li> 10 μL 피펫을 사용하여 PBS 몇 방울을 추가합니다. </li></ol> 7. 계란 닫기 <ol><li> 창을 종료하는 테이프의 얇은 조각을 사용하여 계란을 닫습니다. </li><li> 에서 사용할 수있는 준비 프로토콜에 따라 계란, 인감 <a href="http://jove.com/index/Details.stp?ID=306" target="_blank">http://jove.com/index/Details.stp?ID=306을</a> . </li></ol>

<ol><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+Chicken+Eggs+for+Developmental+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies.</a> Jounal of Visualized Experiments. 8, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> (2007).</li>
<li>Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+expression+of+Fgf8%2C+Otx2%2C+Bmp4%2C+and+Shh+in+the+rostral+prosencephalon+during+development+of+the+telencephalic+and+optic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles.</a> Neuroscience. 108, 183-206 (2001).</li>
<li>Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulations+by+FGF8+contribute+to+midbrain+roof+plate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity.</a> Development . 133, 2905-2913 (2006).</li>
</ol>

저자들은 공개할 사항이 없습니다.

사용하고자하는 단백질에 따라 구슬을 준비하는 방법에 대한 다른 프로토콜이 있습니다. 이 실험에서, 우리는 헤파린 - 아크릴 구슬을 사용하지만 affi - 겔 비즈도 사용할 수 있습니다. 우리는 헤파린 - 아크릴 구슬은 알부민 계란의 수성 환경에서 조작하기 쉽게 것으로 나타났습니다. 비즈 4 ° C.에서 하룻밤 단백질의 5리터에 적셔 놓은 거지 제어 구슬은 배치의 시간까지 멸균 PBS에 배치됩니다. 비켜 준비를 사용하여 장점은 배아가 아직 살아와 정상적으로 한 개발 무료이다. explant가 유지되는 환경이 특정 변수에 대해 제어할 수 있지만, 살아있는 배아가 발달 패턴에 단백질 2-3의 영향을의 정확한 표현을 허용합니다. 당신이 explant에서 수행할 수있는 모든 assays, 당신은 배 (胚)와 함께하실 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>난자</td><td>동물</td><td></td><td></td><td>수정란, E2-2.5 (~ St. 17 HH)</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Profi-I</td><td>Lyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>인디아 잉크</td><td>도구</td><td>Higgins</td><td></td><td>멸균 PBS로 4% 용액을 준비한다.</td></tr><tr><td>멸균 PBS</td><td></td><td></td><td></td><td>대신에 항체 칵테일을 사용할 수 있다</td></tr><tr><td>1ml 주사기</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27G 1/2 바늘</td><td>도구</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td>90도 각도로 기울임</td></tr><tr><td>포셉</td><td>도구</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>크기 55</td></tr><tr><td>지혈鉗子</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>도구</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500086</td><td>vannas, 8.5cm</td></tr><tr><td>파라필름 테이프</td><td></td><td></td><td></td><td>난자 밀봉용</td></tr><tr><td>텅스텐 프로브</td><td>도구</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td>도구 #24. 핸들은 선택 사항.</td></tr></tbody></table>

초기 치킨 태아의 성장 팩터 - 코팅 비즈 배치

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

신경 튜브 개발하는 동안 특정 spatiotemporal 패턴에 많은 단백질을 표현하고 있습니다. 이러한 단백질은 세포 운명 결정, 세포 마이 그 레이션 및 신경 회로 형성을 위해 중요한 것으로 표시되었습니다. 의 연결을 유도하고 patterning 다른 사람 사이에 뼈 morphogenetic 단백질 (BMP), 소닉 헤지 호그 (쉬이잇), fibroblast의 성장 인자 (FGF)를 포함. 특히, Fgf8의 표현 패턴 BMP4 및 쉿 표현 지역 가까이에 있습니다. 이 표현식 패턴은 telencephalon의 patterning을 촉진 발달 상호 작용과 일치합니다. 우리가 비켜 준비가 forebrain의 형성에 Fgfs의 효과를 테스트하는 데 사용할 수있는 방식의 시각적 데모를 제공합니다. 비즈는 단백질로 코팅하고 지속적인 노출을 제공하는 개발 신경 튜브에 배치됩니다. 절차는 작고, 신중하게 배치 구슬을 사용하기 때문에, 그것은 법으로서 여러 구슬이 하나의 신경 튜브 내에 배치 수 있습니다. 배아는 해부학과 신경 patterning의 변화를 감지하는보다 성숙한 단계에서 분석할 수 있도록 또한, 방법은 지속적인 발전을 위해 수 있습니다. 이 간단하지만 유용한 프로토콜은 실시간으로 영상을 허용합니다. 그것은 내생 단백질 수준에 공간과 temporally 제한을 변경할 수있는 수단을 제공합니다.

성장 요인과 단백질의 다양한 세포가 개발하는 동안 다른 세포 운명을 맡을 유도하는 상호 작용. 여기 E2.5 여자의 배아에 구슬을 배치하여 개발에 서로 다른 단백질 간의 상호 작용 가능성을 해결하기 위해 비켜 준비의 사용을 보여줍니다.

신경관은 발달 과정 중 특정 시공간적 패턴으로 많은 단백질을 발현합니다. 이러한 단백질들은 세포...에 결정적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다.

Raburn Lab에 오신 것을 환영합니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스 신경생물학 및 행동학과의 Matt Korn입니다. 오늘은 알을 열어 성장 인자에 적셔진 비드를 배치하는 과정을 살펴보겠습니다.난자를 세심하게 준비하면 배아 발달의 초기 단계에서 다양한 유형의 조직 운명을 변화시킬 수 있는 성장 인자를 투입할 수 있습니다. 2.5일 차, 즉 17단계입니다. 이제 현미경 앞에 있습니다.난자와 모든 도구가 준비되었습니다. 이제 난자를 하나 꺼내어 테이프가 있는 위치를 확인하십시오. 윈도우 씰(Window seal)입니다.여기 작은 도넛 모양의 물체가 있습니다. 이것은 미술 도구점에서 구입할 수 있는 예술용 점토로 만들어졌습니다. 그리고 이제 성능이 매우 좋지 않은 핀셋 한 쌍을 사용하겠습니다.이 도구들은 오랫동안 사용되어 왔습니다. 팁 끝부분이 다소 무디지만, 창이 뜰 수 있도록 테이프를 살짝 들어 올리는 용도로는 매우 효과적입니다. 이것들을 내려놓겠습니다.이 부분을 접어서 알을 고정하고, 이 윈도우를 뒤쪽으로 이렇게 배치하겠습니다. 이제 이를 현미경 아래에 두고 원하는 조작을 수행할 수 있습니다. 이번 과정에서는 비즈를 사용할 예정이며, 지금 바로 인디아 잉크를 가져오겠습니다. 인디아 잉크가 없는 상태입니다.여기 배아반이 약간 보이며, 옆쪽으로 조금 치우쳐 있습니다. 달걀을 돌려보면 혈액의 일부가 여기서 원형을 형성하고 있는 것을 볼 수 있습니다. 이제 인디아 잉크가 담긴 바늘을 준비하겠습니다.이제 옆으로 이동하여 디스크 아래로 가겠습니다. 그곳에 배아가 있습니다. 배아가 검은색 배경과 대비되어 보일 정도로만 적당히 배치하겠습니다. 그런 다음 배아의 머리 쪽(rostral part)이 앞을 향하도록 회전시키겠습니다.여기서 보시는 부분은 두부 영역입니다. 신경관이 이쪽으로 이어지며, 배아의 연령을 추정할 수 있게 해주는 몇 개의 체절이 관찰됩니다. 화면을 확대해 보면, 심장이 매우 느리지만 일정하게 뛰고 있는 것을 확인할 수 있으며 이는 매우 긍정적인 상태입니다.심장이 그 자리에 있었지만, 뛰고 있지 않았습니다. 이것이 살아있는 샘플인지에 대해 다소 우려될 수 있는 상황입니다. 따라서 심장 위에 두꺼운 막이 없으므로, 여기 있는 텅스텐 프로브를 바로 사용하겠습니다.여기 얇은 막이 있는데, 배아에 접근할 수 있도록 살짝 옆으로 치우겠습니다. 우리는 전뇌와 후뇌에 비즈를 배치합니다. 이번에는 전뇌를 대상으로 진행하겠습니다.이제 해당 부위에 도달하기 위해 막을 절개해야 합니다. 배아가 더 어릴 때는 텅스텐 프로브를 사용하여 신경관을 통해 진입함으로써 비드를 삽입하려는 부위에 접근할 수 있습니다. 이제 텅스텐 프로브로 이동하겠습니다.손의 떨림을 방지하기 위해 두 손을 사용하고 있습니다. 이제 배아를 조절하겠습니다. 비드를 이곳에 넣은 후, 신경관으로 직접 삽입하여 전뇌까지 이동시키겠습니다.이제 배아를 개방했으므로, 전처리를 진행하고 비드를 배치하겠습니다. 프로브를 조금 더 깊게 넣어 신경관을 개방할 것이며, 이미 처리된 것을 확인하실 수 있습니다. 화면을 조금 더 확대해 보겠습니다.초점을 약간만 변경하겠습니다. 여기 보시면 작은 구멍이 하나 있는데, 꼬리 부분의 cephalon 윗부분에는 구멍을 뚫지 않았습니다. 비드가 들어갈 위치가 바로 그곳이기 때문입니다. 비드가 밖으로 떠내려갈 수 있는 구멍이 생기는 것을 방지하기 위함입니다.비드를 넣고 앞으로 밀 수 있도록 약간 뒤로 배치하겠습니다. 이제 비드를 가져오겠습니다. 보시는 것처럼 크기가 매우 다양합니다.이것들은 PBS에 담긴 헤파린 아크릴입니다. 55 포셉을 사용하여, PBS 내에서 적당한 것을 하나 골라내겠습니다.PBS에서 꺼내면 보통 포셉에 붙어 있는데, 여기서 확인할 수 있습니다. 이제 비드를 덮어주세요. 난자를 다시 가져옵니다.난자의 초점을 맞추겠습니다. 55번 포셉으로 비드를 가져오겠습니다. 포셉의 위치가 제가 선호하는 것보다 약간 높지만, 여기 있습니다.그리고 신경관에 뚫어놓은 구멍 쪽으로 유도하겠습니다. 일단 신경관 내부로 들어가면 발달 중인 뇌의 앞쪽으로 조작하기가 쉬워집니다. 이제 텅스텐 프로브를 사용하여 밀어 넣겠습니다.비드를 두부(cephalon)에 배치할 때는 주의가 필요합니다. 배아가 성장함에 따라 앞쪽으로, 그리고 옆쪽으로 굽어지기 시작하기 때문입니다. 전뇌(forebrain)를 포함한 두부에 비드를 배치할 때, 비드가 부리 쪽으로 떨어지는 경우가 많은데, 이는 뇌가 등쪽(dorsal region)에 위치하는 반면 부리는 배아의 배쪽(ventral portion)에서 형성되기 때문입니다. 하지만 현재 상태는 매우 양호해 보입니다.저는 이 결과에 상당히 만족합니다. 이제 10 µL의 멸균 PBS가 든 피펫을 사용하여 여기에 몇 방울 떨어뜨리겠습니다. 이제 알을 닫아도 좋습니다.이제 창을 위로 들어 올려 옆으로 옮기겠습니다. 아직 알이 밀봉되지 않은 상태입니다. 따라서 내부가 건조해지는 것을 방지하기 위해, 사용해 온 플라스틱 테이프를 창 크기보다 약간 더 크게 잘라 준비하겠습니다.이를 약간 잡아당겨 여기 창 위에 놓고 빈틈없이 밀착시킵니다. 이렇게 하면 알부민을 배출하거나 창을 만들 때 생긴 모든 구멍이 밀봉됩니다. 이제 달걀이 밀봉되어 알부민이 소실되지 않으며 건조해지지 않습니다.정상적으로 성장할 수 있어야 합니다. 이것으로 비드 배치 과정을 마치겠습니다. 병아리 실험에서 좋은 결과가 있기를 바라며, 원하시는 결과를 얻으셨기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 개발 대뇌 피질의 explants에 성장 인자와 함께 코팅했습니다 구슬을 준비하고 삽입을위한 두 가지 방법을 보여줍니다. 이 구슬은 forebrain의 explants 같은 신경 조직을 개발 공간 제한 유전자 발현을 유도하는 데 사용할 수 있습니다. 방법은 Affi - 젤 구슬과 헤파린 acryllic 구슬을 모두 사용 주어집니다.

도설 Forebrain의 Explants에 대한 성장 인자 - 코팅 비드 배정

이 비디오는 새로운 문화, 병아리의 배아는 최대 24 시간까지 계란 이외의 양식하는가하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 초기 개발 (14 솜으로 원시적인 승리.) 마우스 E7 - 9에 해당하는 기간 동안 공부를 하나 있습니다. 이 기술의 응용은 현장 하이브리드화과 immunohistochemistry에 electroporation을 포함합니다.

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

초기 여자는 배아에서 Morphogenetic 조직 Deformations 추적

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발달 중에 닭 배아를 보고 접근하는 것은 어려울 수 있습니다. 우리는 간단하고 비용 효율적이며 교실이나 연구 환경에서 쉽게 사용할 수 있는 ex ovo 방법을 개발했습니다. 이 방법은 배아가 배아 발달의 후기 단계로 들어갈 수 있도록 합니다(HH 40).

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