Name: 감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: 배우세요 Listeria monocytogenes 감염 마우스의 세균 하중 측정 및 단일 세포 현탁액 제작 방법을. FACS 분석으로 면역 반응을 특성화하고 민감성 및 저항성 마우스 계통 간 차이를 평가합니다.

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저자는 조언과 시약에 대한 안나 Walduck, 크리스티나 건배, 스튜어트 Berzins, 데일 고드프리, Yifan Zhan와 조나단 윌크쉬 감사하고 싶습니다. 이 작품은 소아 당뇨병 연구 재단 (1-2008-602)과 호주 국립 보건 의학 연구위원회 (575552)에 의해 재정 지원되었다. NW는 호주 대학원 수상에 의해 지원됩니다. 아우는 호주 국민 건강 의학 연구위원회에서 RD 라이트 원정대에 의해 지원됩니다.

<ol><li>Wing, E. J., Gregory, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+clinical+and+experimental+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: clinical and experimental update.</a> J Infect Dis. 185, Suppl 1. S18-S24 (2002).</li>
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<li>Boyartchuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+resistance+locus+sst1+controls+innate+immunity+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The host resistance locus sst1 controls innate immunity to Listeria monocytogenes infection in immunodeficient mice.</a> J Immunol. 173, 5112-5120 (2004).</li>
<li>Pan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipr1+gene+mediates+innate+immunity+to+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ipr1 gene mediates innate immunity to tuberculosis.</a> Nature. 434, 767-772 (2005).</li>
<li>Garifulin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irf3+polymorphism+alters+induction+of+interferon+beta+in+response+to+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Irf3 polymorphism alters induction of interferon beta in response to Listeria monocytogenes infection.</a> PLoS Genet. 3, 1587-1597 (2007).</li>
<li>Hof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+different+strains+of+Listeria+monocytogenes+serovar+1%2F2a%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Microbiol+Immunol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Virulence of different strains of Listeria monocytogenes serovar 1/2a.</a> Med Microbiol Immunol (Berl. 173, 207-218 (1984).</li>
<li>Wollert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+host+range+of+Listeria+monocytogenes+by+rational+protein+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design.</a> Cell. 129, 891-902 (2007).</li>
<li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+model+for+listeriosis%3A+role+of+internalin+in+crossing+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier.</a> Science. 292, 1722-1725 (2001).</li>
<li>Marco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+Listeria+monocytogenes+in+mice+infected+by+the+oral+route%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route.</a> Microb Pathog. 23, 255-263 (1997).</li>
<li>Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+infection+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Animal model for infection with Listeria monocytogenes.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter. 19, 19-19 (2001).</li>
<li>Neuenhahn, M., Schiemann, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+in+mouse+models+of+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DCs in mouse models of intracellular bacterial infection.</a> Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).</li>
<li>Conlan, J. W., North, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+essential+for+early+anti-Listeria+defense+in+the+liver%2C+but+not+in+the+spleen+or+peritoneal+cavity%2C+as+revealed+by+a+granulocyte-depleting+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 179, 259-268 (1994).</li>
<li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+antigranulocyte+monoclonal+antibody+RB6-8C5+prevents+expression+of+acquired+resistance+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+previously+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice.</a> Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Listeria는 세포 내 세균에 대한 호스트 면역 반응을 특성화하는 데 가장 널리 사용되는 미생물 중 하나입니다6. 본 프로토콜을 통해 특정 마우스의 동일한 조직 내에서 세균 부하와 면역 세포 반응을 동시에 측정할 수 있습니다. 감염된 각 마우스의 특정 조직에 대해 이러한 이중 측정을 수행하면, 마우스 코호트 내(서로 다른 마우스 계통 또는 감염 후 시점) 및 코호트 간의 비교를 더욱 견고하게 할 수 있습니다. 경구 투여를 통한 Listeria 감염 또한 마우스의 면역 반응 연구에 사용될 수 있으나, 정맥 주사 감염이 자주 사용되는 이유는 다음과 같습니다. 1) 혈류로의 신속하고 효과적인 전달이 보장되며, 2) 동기화되고 일관된 전신 감염을 유도하고, 3) Mus 종은 E-cadherin 수용체를 인코딩하는 유전자에 돌연변이가 있어 경구 투여를 통한 Listeria 감염이 제한되기 때문입니다(이 돌연변이는 Listeria가 마우스 E-cadherin 수용체에 결합하고 위장관의 상피층을 효율적으로 통과하는 능력에 영향을 미칩니다)16-18.
본 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 생존력과 병원성을 보장하기 위해 Listeria 접종원 스톡은 신선한 overnight HBA 배양액으로부터 생성해야 합니다. 둘째, 첫 번째로 접종한 마우스와 마지막으로 접종한 마우스 간의 CFU 농도 차이가 크게 나지 않도록, 모든 마우스에 접종하기 전과 후에 접종원의 CFU 농도를 정확하게 측정하는 것이 중요합니다. 셋째, Listeria의 꼬리 정맥 주사는 모든 마우스에 대해 일관되게 수행되어야 합니다. 마지막으로, 말초 혈액을 통해 통과하는 백혈구가 아닌 간 내 면역 세포를 정확하게 측정하기 위해, 간 관류를 통해 비상주 백혈구를 제거해야 합니다. 이러한 단계들이 성공적으로 수행되지 않을 경우, Listeria에 감염된 개별 마우스 간의 세균 부하 및/또는 면역 반응에 원치 않는 변동성이 발생할 수 있습니다.
본 프로토콜의 두 가지 제한 사항은 정맥 주사를 통해 마우스에 감염시키는 연구자의 숙련도와 조직 내 세균 부하의 검출입니다. 한 사람이 다수의 마우스에 주사하는 경우, 냉동 접종원을 해동한 후 시간이 지남에 따라 Listeria의 생존력(즉, CFU 농도)이 감소할 수 있습니다(예: 첫 번째 마우스와 마지막 마우스 주사 사이에 &gt;2시간 소요). 접종원이 손상되기 전까지 몇 마리의 마우스에 주사할 수 있을지는 연구자가 결정해야 합니다. 이 방법의 또 다른 제한 사항은 배양된 조직 균질액의 양이 상대적으로 적기 때문에 Listeria 부하를 100CFU/organ 미만으로 정확하게 측정할 수 없다는 점입니다(예: 그림 3은 검출 한계가 100CFU/organ임을 나타냅니다). CFU/organ의 더 낮은 수치를 더 정확하게 측정하려면, 더 많은 양의 조직 균질액을 배양하여(플레이트당 최대 0.5mL, 여러 플레이트 사용 가능) Listeria 검출을 위해 더 많은 비율의 조직을 샘플링할 수 있습니다. Stomacher를 사용할 수 없는 경우, 단계 7.1-7.2에서 조직 균질기(tissue homogenizer)와 같은 대체 조직 균질화 방법을 사용할 수 있습니다. 실무적인 참고 사항으로, 감염된 마우스의 조직 샘플을 배양하기 위한 37°C 인큐베이터의 공간이 제한적인 경우, HBA 배양 플레이트를 실온에서 2-3일 동안 배양할 수 있습니다(실온에서는 콜로니 성장 속도가 더 느립니다). 하지만 냉동 Listeria 스톡 준비를 위한 배양물을 증식시킬 때는 실온을 사용해서는 안 됩니다.
본 프로토콜은 마우스의 Listeria 감염 특성을 분석하기 위한 기본적인 접근법을 제공하며, EGD 외의 다른 Listeria 균주에도 적용할 수 있습니다. 간과 비장뿐만 아니라 림프절에서도 단일 세포 현탁액을 생성할 수 있습니다. 두 경우 모두, 이러한 단일 세포 현탁액은 면역 세포 하위 집단 측정 및 분리된 면역 세포의 in vitro 자극을 포함한 다양한 분석에 사용될 수 있습니다. 기본 기술을 숙달하면, 본 프로토콜을 수정하여 Listeria 특이적 T 세포를 분리하거나19, 수지상 세포의 특성을 분석하거나20, 또는 감염 후 특정 시점에서 면역 세포 고갈을 수행함으로써21,22 Listeria에 감염된 마우스의 면역 반응을 더욱 철저하게 분석할 수 있습니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 </th></tr><tr><td> 호스 피 한천 기지 제 2 </td><td> Oxoid </td><td> CM0271 </td><td> HBA 플레이트에 대한 한천 기지의 준비 </td></tr><tr><td> 호스 피 (defibrinated) </td><td> Oxoid </td><td> HB1000 </td><td> 한천베이스 50~10% 추가 </td></tr><tr><td> 뇌 심장 주입 (BHI) 국물 (10 ML) </td><td> Oxoid </td><td> TM456 </td><td></td></tr><tr><td> 뇌 심장 주입 탈수 미디어 </td><td> Oxoid </td><td> CM1135 </td><td></td></tr><tr><td> 96 - 웰 플랫 바텀 플레이트 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 70 μm의 셀 스트레이너 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 소형 페트리 접시 </td><td> BD Biosciences </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Stomacher 80 biomaster 실험실 시스템 </td><td> 슈어드 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 플라스틱 Stomacher 가방 </td><td> Sarstedt </td><td> 86 9,924 530 </td><td></td></tr><tr><td> 소 혈청 알부민 </td><td> 시그마 </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> 외과 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 0.1 % (W / V) PBS의 소 혈청 알부민 </td></tr><tr><td> Isotonic Percoll (PBS에서 33.75 %의 Percoll) </td><td> GE 헬스케어 </td><td> 17-0891-01 </td><td> 33.75mL Percoll, 3.75mL 10X PBS는 62.5mL 1X PBS는 100mL isotonic Percoll하게 </td></tr><tr><td> TAC 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 17mM 트리스, 증류수에 140mM 암모늄 클로라이드 </td></tr><tr><td> FCS / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 10mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 태아 송아지 혈청 </td></tr><tr><td> 외과 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼 </td><td></td><td></td><td> 외과 버퍼 + 5mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td></tr><tr><td> Trypan 파랑 </td><td> 시그마 </td><td> T6146 </td><td> PBS에 0.​​4 % (W / V), 필터는 살균 </td></tr><tr><td> 2mL Cryovial </td><td> 그라 이너 바이오 원 </td><td> 121263 </td><td></td></tr><tr><td> 27 gauge/1mL 인슐린 주사기 </td><td> Terumo 의약품 </td><td> SS10M2713 </td><td></td></tr><tr><td> 바늘 </td><td> Terumo 의약품 </td><td> NN - 2516R (25G 5/8in) NN - 2613R (26G 1/2in) </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 </td><td> Terumo 의약품 </td><td> SS - 01T (1mL), SS - 053 (5mL), SS - 10 초 (10mL) </td><td></td></tr></tbody></table>

감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes</em

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

리스테리아 monocytogenes는 (리스테리아) 그람 양성 통성 세포내 병원체 1입니다. 마우스 연구는 일반적으로 리스테리아의 정맥 주사를 채용, 어떤은 조직의 감염이 초래합니다. 주입 후, 리스테리아 신속하게 CD8α + 돌기 세포와 Kupffer 세포 3,4에 의해 이해로 인해 비장과 간장에 disseminates. 일단 phagocytosed, 각종 세균의 단백질은 phagosome 탈출 cytosol 내에 생존하고, 인접 세포에게 5 리스테리아 감염 수 있습니다. 감염의 처음 세 일 동안, 다른 타고난 면역 세포 (예 : monocytes, neutrophils, NK 세포, 세포 돌기) 리스테리아 확산을 최소화 bactericidal 메커니즘을 중재. CD8 + T 세포는 이후 모집 일반적으로 감염 6 10 일 이내에 호스트에서 리스테리아의 최종 통관에 대한 책임이 있습니다. 감염된 생쥐에서 리스테리아의 성공적인 허가는 호스트 면역 반응 6 해당 증상에 따라 달라집니다. 근친 마우스 종자 7,8 사이에 민감한 다양한있다. 일반적으로, 리스테리아 감염 증가 느끼기 쉬운 상태로 마우스는 마우스에 비해 저항력이 증가 세균 하중 및 / 또는 지연 허가를 보여주는, 박테리아 증식을 제어하는 덜 수 있습니다. 결합 분석 및 녹아웃 마우스 종자를 포함한 유전자 연구, 시퀀스 유사 리스테리아 감염 6,8-14에 호스트 응답에 영향을 미치는있는 다양한 유전자를 발견했습니다. 결단력과 다른 마우스 변종 사이의 감염 속도론의 비교 그러므로 리스테리아에 대한 면역 반응에 기여하는 호스트 유전 요소를 식별하는 중요한 방법입니다. 다른 리스테리아 변종에 호스트 응답의 비교도 항생제 치료 또는 예방 접종 디자인에 대한 잠재적인 대상으로 될 수있다 세균성 독성 요소를 식별하는 효과적인 방법입니다. 우리는 여기에 세균 하중 (콜로니 형성 단위 [CFU] 당 조직)을 측정하고 리스테리아에 감염된 생쥐에서 면역 반응의 외과의 분석을위한 간 및 비장의 단일 셀 suspensions을 준비를위한 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 초기 소설 마우스 종자에 리스테리아 감염의 특성뿐만 아니라, 리스테리아에 감염된 다른 마우스 종자 간의 면역 반응 비교에 특히 유용합니다. 우리는 혈액 한천에 교양하면 β - 용혈 1 (그림 1)로 인해 각각의 콜로니 주위 특성 헤일로 영역을 전시되는 변형율 15 EGD 리스테리아 monocytogenes를 사용합니다. 박테리아로드하고 면역 반응은 아래에 설명된 프로토콜을 사용하여 외과 분석을위한 혈액 한천 플레이트 및 준비 조직 세포 suspensions에 culturing 조직 homogenate에 의해 감염 후 언제든지 포인트에서 확인할 수 있습니다. 우리는 immunocompromised 또는 임신 개인 리스테리아 처리하지 말아야합니다 것이며, 작업 개시 전에 관련 기관 biosafety위원회 동물 시설 관리 자문해야합니다.

리스테리아 monocytogenes는 생쥐에서 세균을 세포에 면역 반응과 유전 자화율을 연구를위한 모델 생물이다. 이 방법은 박테리아 부하를 측정하고 리스테리아 감염으로 인한 면역 세포의 변화를 결정하는 외과 분석을위한 생쥐의 간 및 비장의 단일 셀 suspensions를 생성하는 하나 있습니다.

Listeria monocytogenes(Listeria)는 그람 양성 통성 세포 내 병원체입니다1. 마우스 연구에서는 일반적으로 ...의 정맥 주사를 이용합니다.

이 영상에서는 생쥐의 간과 비장에서 박테리아 양을 측정하고 단일 세포 현탁액을 생성 및 분석하는 방법을 설명합니다. 먼저, listeria 접종액을 준비하여 생쥐에 정맥 주사합니다. 그 후, 정해진 시점에 안락사시킨 생쥐로부터 혈액, 간 및 비장을 채취합니다.수확한 조직 및 말 혈액 한천 배지에서 배양된 조직 균질물로부터 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 이렇게 생성된 세포 현탁액은 FACS 분석을 통해 생존율과 면역 세포 함량을 분석할 수 있으며, 세균 부하는 콜로니 형성 단위(CFU)를 기반으로 측정합니다. 이 방법은 감염된 장기 내의 세균 부하를 동시에 결정하면서, 감수성 및 저항성 말 균주 간의 차이와 같이 스테로이드 감염에 대한 면역 반응을 특성화하는 데 도움이 될 수 있습니다.원하는 농도로 리스테리아(listeria) 접종액을 준비하여 이 절차를 시작하십시오. 리스테리아의 배양, 보관 및 준비에 관한 지침은 함께 제공된 서면 프로토콜에서 확인할 수 있습니다. 접종액이 준비되면, 900 µL의 PBS가 들어 있는 멸균 마이크로 퓨즈 튜브에 100 µL씩 두 개의 분주액을 옮겨 1:10 희석액을 만듭니다. 그다음, 각 희석액 100 µL를 말 혈액 배지(HBA) 플레이트에 옮기고 멸균 스프레더로 충분히 도말하여 집락 형성 단위(CFU) 수를 측정하며, 플레이트를 뒤집어 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이후, 마우스를 깨끗한 케이지로 옮깁니다.꼬리 정맥이 확장되도록 케이지를 250 watt 적외선 램프 아래 50 centimeters 거리에서 5분 동안 둡니다. 이렇게 하면 주입 시 시각화가 더 용이해집니다. 여기서 리스테리아 저항성 마우스 계통인 C 57 black six와 리스테리아 감수성 마우스 계통인 BALB/c에 주입할 것입니다. 튜브를 몇 번 뒤집어 리스테리아 현탁액을 부드럽게 혼합하십시오.그 다음, 마우스당 200 µL를 주입하기 위해 27 gauge 바늘이 장착된 1 mL 주사기에 약물을 충전합니다. 주입 전 주사기 내부의 공기 방울을 완전히 제거하십시오. 마우스를 보정 장치에 고정합니다.그런 다음, 먼저 등쪽 중앙에 위치한 꼬리 동맥을 확인하여 마우스의 외측 꼬리 정맥의 위치를 찾습니다. 그다음 꼬리를 외측으로 약간 돌려 정맥을 확인합니다. 70% ethanol 솜으로 꼬리를 부드럽게 닦아낸 후, 주사기를 꺼내어 주입합니다.멸균 거즈 패드로 주입 부위를 가볍게 압박합니다. 검은색 털을 가진 마우스의 경우 주사 후 미미정맥을 확인하는 것이 훨씬 더 어렵다는 점에 유의하십시오. 모든 마우스에게 주입을 완료한 후 마우스를 케이지로 돌려보내고, 남은 접종액은 콜로니 형성 단위(CFU) 측정을 위해 배양합니다.전날과 마찬가지로 다음 날에 콜로니 수를 측정하고, 주입 전과 주입 후의 리스테리아(listeria) 접종액 농도를 결정합니다. 여기에 표시된 것처럼 개별 콜로니 주변의 특징적인 후광은 베타 용혈(beta hemolysis)로 인해 나타납니다. 주입 전과 주입 후의 수치가 결정되면, 주입 전 콜로니 형성 단위(colony forming unit) 수와 주입 후 콜로니 형성 단위 수를 더한 뒤 2로 나누어 평균 콜로니 형성 단위를 계산합니다.마지막으로, 주입 후 다양한 시점에서 혈액을 채취하고 안락사시킨 마우스로부터 간과 비장을 적출합니다. fax 분석을 수행할 경우, 혈액을 제거하기 위해 적출 전 간을 관류시켜야 하며, 안락사 직후 심장 채혈을 실시하여 적절한 수집 튜브에 가능한 많은 양의 혈액을 수집합니다. 간을 관류시키기 위해, 먼저 복강을 절개하고 담낭을 제거하여 폐기합니다.하대정맥은 척추와 평행하게 뻗어 있으며 간을 포함한 신체 하부의 혈액을 심장으로 운반하는 정맥입니다. 가위를 사용하여 심장 바로 아래의 정맥을 절단하여 관류액이 배출될 수 있는 통로를 만듭니다. 다음으로, 간엽을 머리 쪽으로 젖히고 장을 오른쪽으로 밀어 간 하단으로 이어지는 간문맥을 노출시킵니다.오른쪽 하단에서 굽혀진 0.5인치 길이의 26게이지 바늘을 간문맥에 삽입하고 10밀리리터의 PBS를 주입합니다. 1~2밀리리터의 PBS가 주입되면 간의 색이 진한 붉은색에서 연한 갈색으로 변합니다. 주입된 용액은 절단된 하대정맥을 통해 배출됩니다. 간 관류를 통해 회수된 세포가 순환 혈액이 아닌 간에서 유래했음을 보장할 수 있습니다.다음으로, 관류된 간을 마우스의 체강에서 꺼내어 얼음 위에 둔 facts 완충액 튜브에 담급니다. 그런 다음 비장을 제거하여 얼음 위에 두고, 다음 섹션에서 설명하는 것과 유사한 방식으로 처리합니다. 단일 간세포 현탁액을 생성하기 위해, 관류된 간을 facts 완충액에서 60mm 페트리 접시 안에 놓인 70 micron 세포 스트레이너로 옮깁니다.5L 시린지 플런저를 사용하여 조직을 셀 스트레이너를 통해 페트리 접시로 밀어냅니다. 단일 세포 현탁액을 50mL 원추형 스크류 캡 튜브로 옮기고, 차가운 FACS 버퍼를 사용하여 전체 부피를 40mL로 맞춥니다.세포 현탁액을 볼텍싱합니다. 그런 다음 박테리아 부하량 측정을 위해 1 mL 분량을 따로 떼어 둡니다. 이후 절차에서, 50 mL 튜브를 원심분리기에 넣고 4 °C에서 500 ×g로 5분간 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다.상청액을 버린 후, 펠렛을 40 mL의 차가운 fax buffer에 재현탁하고 원심분리하여 세척 단계를 반복합니다. 다시 펠렛을 실온에서 20 mL의 isotonic per hole에 재현탁한 후, 세포 현탁액을 실온에서 700 ×g로 12분간 원심분리합니다.원심분리 후, 간세포가 Percoll 층 위에 디스크 형태의 시트로 떠오르고 백혈구는 튜브 바닥에 다시 침전됩니다. 간세포 층과 Percoll을 폐기물 용기에 따라내어 제거하십시오. 그다음, 백혈구가 포함된 펠릿을 4 mL의 TAC 버퍼에 재현탁하여 적혈구를 용해시키고, 빈번하게 도립 섞기를 하며 실온에서 최대 10분 동안 세포를 배양하십시오. 배양 후, 세포 현탁액을 100 µm 나일론 멤브레인으로 여과하여 새로운 10 mL 원심분리 튜브에 옮기십시오.여기에 표시된 것처럼 여과된 세포 현탁액 아래에 1 mL의 FACS EDTA 버퍼를 깔아줍니다. 그런 다음 4 °C에서 350 ×g로 5분간 원심분리합니다. 원심분리 후 5 mL의 FACS EDTA 버퍼로 재현탁하고 다시 원심분리하며, 펠릿의 크기에 따라 0.5~3 mL의 FACS EDTA 버퍼로 펠릿을 재현탁합니다. 트라이판 블루 배제법을 기반으로 혈구계수기를 사용하여 생존 가능한 간 백혈구의 수를 결정합니다.이후 단일 세포 현탁액을 원하는 세포 표면 마커에 특이적인 항체로 라벨링하여 FACS로 분석할 수 있습니다. 간 및 비장 조직으로부터 단일 세포 현탁액이 생성되면, 절차의 일부로 세균 부하량을 측정합니다. 누출을 방지하기 위해 Stomach ER 백을 닫은 상태로 조직을 균질화하는 stomach co machine을 사용합니다.클린 벤치 위에 평평하게 놓는 것으로 시작합니다. 조직이 백 안에서 으깨질 때까지 두껍고 둥근 펜으로 조직 위를 굴립니다. 조직이 으깨진 각 위(stomach) 샘플 백에 5 mL의 PBS를 추가합니다.위 또는 백을 스토맥커(stomach)에 넣고 고속으로 10분 동안 가동합니다. 스토맥커 기기에는 두 개의 패들이 있어 지정된 속도로 위 또는 백을 압착함으로써 내용물을 균일한 균질액으로 혼합하고 에어로졸 발생을 방지합니다. 피펫을 사용하여 백 속의 균질액을 혼합합니다. 그 후 300 µL를 96-well 평저 플레이트에 두 번씩 분주합니다.96-웰 플레이트의 웰 내에서 10배 단계 희석을 수행하여 10⁻⁵ 희석액까지 준비합니다. 각 조직 균질액 샘플에 대해, 멸균 스프레더를 사용하여 각 희석액 0.1 milliliters를 미리 건조시킨 HBA 플레이트에 조심스럽게 도말합니다. 플레이트를 37 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 각 희석 배수별로 집락 형성 단위(colony forming units)의 수를 측정하고, 조직의 일부, 희석 배수 및 균질액의 부피를 고려하여 조직당 집락 형성 단위를 계산합니다. C 57 black six 마우스에 약 2000 colony forming units의 listeria를 감염시킨 후, 감염 3일 및 7일 차에 마우스를 안락사시키고 간을 관류한 뒤 비장과 함께 적출하였습니다. 비장 균질액 또는 간 단일 세포 부유액을 희석하여 HBA 플레이트에서 배양함으로써 세균 부하량을 측정하였습니다.여기에 제시된 결과에서 점선은 장기당 100 colony forming units의 검출 한계를 나타냅니다. listeria 부하량이 7일째보다 3일째에 더 높다는 점에 유의하십시오. 이는 7일째가 되면 다양한 면역 세포들이 listeria의 제거를 유도하기 때문입니다.비장과 간의 두 조직에서 단일 세포 현탁액을 트라이판 블루(trypan blue)로 염색한 후 혈구 계수기로 로딩하였습니다. 빨간색 상자로 표시된 계수 영역 내의 세포들을 측정합니다. 사멸 세포는 트라이판 블루를 흡수하여 파란색으로 나타나며, 생존 세포는 염색되지 않은 상태로 유지됩니다.여기에 나타난 바와 같이, 왼쪽의 비장 내 생존 세포 수와 오른쪽의 간 내 생존 백혈구 수는 감염 과정 동안 증가합니다. 이러한 증가는 호중구와 림프구를 포함하여 활성화되고 증식하여 이 두 감염 부위로 이동하는 면역 세포들로 인해 발생합니다. listeria 감염 과정 중 면역 세포 수준의 예시로, 대표적인 fax plot과 CD8 양성 T 세포 수가 여기에 제시되어 있습니다.CD8 양성 T 세포의 수는 림프구 감소증으로 인해 감염 후 2~3일째에 비장에서 일시적으로 감소하며, 5일째부터는 비장과 간 모두에서 눈에 띄게 증가합니다. 이 절차 이후, 안드로겐의 진동, 항원 특이적 T 세포 및 분류된 면역 세포의 기능 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 리스테리아 감염에 대한 면역 반응을 추가로 특성화할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Lo, B. C. 외 만성 살모넬라 감염으로 인한 장섬유증. J. Vis. 경험 (2019)이 영상은 스트렙토마이신 내성 살모넬라 티피무리움 에 감염된 마우스 모델에서 박테리아 부하를 정량화하는 과정을 보여줍니다. 안락사와 멸균 해리 후에는 맹장과 비장 조직을 채취하여 박테리아를 방출하기 위해 강철 구슬로 균질화하고, 연속적으로 희석합니다. 희석액은 선택적 한천에 도판되며, 가시적 군락을 세기 위해 장 및 전신 부위의 조직당 세균 부하를 추정합니다.

만성 장 감염 마우스 모델에서 조직 세균 부하의 정량화

출처: McMullen, P. D., Freitag, N. E. 리 스테리아 모노사이토제네를 이용한 감염 생쥐의 심장 세포 배양 내 박테리아 침범 및 심장 정착 평가. J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 쥐의 꼬리정맥에 리스테리아 모노사이토제네스 를 주입하여 전신 감염을 확립하는 과정을 시연합니다. 이 영상은 박테리아 순환, 장기 정착, 그리고 조직 균질 처리, 연속 희석, 플레이트 부착을 통한 심장 내 박테리아 부하 정량화를 보여줍니다.

리스테리아 모노사이토제네스 꼬리정맥 주입 후 마우스 심장 내 박테리아 부하 정량화

Source: Ahn, J. J., et al. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates bacterial load measurement in spleen and liver tissues isolated from mice infected with an intracellular bacterial pathogen. Bacteria, accumulated within tissue-resident phagocytes during systemic infection, are released using detergent-based lysis and mechanical disruption. Serial dilutions of the homogenates are plated on...

Quantification of Bacterial Load in Mouse Spleen and Liver After Systemic Infection

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

이 비디오는 리스테리아 모노사이토제네스에 감염된 관류된 쥐 뇌의 감염성 박테리아 부하를 정량화하는 방법을 보여줍니다.

리스테리아 모노사이토제네스 감염에 따른 쥐 뇌의 박테리아 집락화 평가

이 논문은 사용하는 마우스의 경구 감염에 대한 새로운 방법을...

경구 전송<em&gt; 리스테리아</em&gt; 오염 된 음식의 섭취를 통해 마우스의

리스테리아 단세포 유전자는 취약한 인구에 있는 임산부및 뇌막염에 있는 태아 감염을 일으키는 원인이 됩니다.  박테리아의 하위 인구는 심장 조직을 식민지화 할 수 있습니다, 환자와 실험실 동물에 심근염을 일으키는.  여기에서 우리는 감염된 동물에 있는 체외 및 심장 식민지에 있는 L. monocytogenes 심장 세포 침략을 평가하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

리스테리아 단세포 유전자를 사용하여 감염된 마우스에 있는 문화와 심혼 식민지에 있는 심장 세포의 세균성 침략 평가

이 프로토콜은, 리스테리아의 EGD 균주 (L. 모노 사이토 겐)을 C57BL / 6J 마우스에 접종하고, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포에 의한 인터페론 - γ (IFN-γ) 응답을 측정하는 방법을 설명 적응 T 포스트 감염 림프구. 이 프로토콜은 또한 병원균의 수정 된 LD (50) 투여로 감염 후 쥐에서 생존 연구를 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

와 실험 감염<em&gt; 리스테리아</em&gt; 호스트 인터페론-γ 응답 유학을위한 모델로

감염, 동안 Listeria monocytogenes 는 두뇌를 식민지로 혈액 뇌 장벽을 교차 수 있습니다. 이 프로토콜, 쥐의 감염에 따라 장기의 세균성 식민지를 평가 하는 방법을 보여 줍니다. 뇌 실질에 세균 숫자의 특정 결정에 대 한 전체 기관 살포를 수행 하는 절차를 제공 합니다.

Listeria monocytogenes 뇌의 감염

우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 감염 분석 호스트 인코딩 요인의 활동을 분석 하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다.

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

여기 선물이 vivo에서 백신의 평가 위한 우아한 프로토콜 효과 호스트 면역 반응. 이 프로토콜은 바이러스 성, 세균성, 백신 모델 또는 기생 병원 균에 대 한 적응 될 수 있다.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

배우세요 Listeria monocytogenes 감염 마우스의 세균 하중 측정 및 단일 세포 현탁액 제작 방법을. FACS 분석으로 면역 반응을 특성화하고 민감성 및 저항성 마우스 계통 간 차이를 평가합니다.

감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes

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