쥐 장간막의 Angiogenesis 분석

스웨덴 구텐부르크에 위치한 GaN 대학 병원의 병리과에 오신 것을 환영합니다. 저는 Klaus Norby 박사이며, 지금부터 보실 방법은 저희 연구실에서 개발되었습니다. 저산소증, 고형암 또는 기타 혈관 형성 질환과 관련하여 발생하는 임상적으로 유의미한 혈관 형성은 거의 전적으로 천연 혈관이 분포된 조직에서 일어납니다. 성체 소형 설치류의 경우, 소장을 체벽 후면에 연결하는 장간막에 다수의 얇은 막성 부위가 존재합니다. 쥐의 경우, 이러한 장간막 창(mesenteric windows)이 약 40~50개 정도 있습니다. 이들은 육안으로 보기에 거의 투명하여 창과 같으며, 성체 수컷 쥐의 경우 각 창은 지방 조직으로 둘러싸여 있습니다.

장간막 창(mesenteric windows)은 본래 혈관이 분포되어 있으며 측정 가능한 생리적 혈관 신생이 일어나지 않습니다. 따라서 이곳은 성체의 본래 혈관이 분포된 포유류 조직에서 데 노보(de novo) 혈관 신생을 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 즉, 모든 정상 조직과 마찬가지로 시험 조직 내에서 내인성으로 작용하는 혈관 신생 억제 인자들을 극복하고, 아무것도 없는 상태에서 완전한 혈관 신생 반응이 시작되는 과정을 연구할 수 있습니다. 다만, 생쥐의 많은 창 부위에는 모세혈관 역할을 할 수 있는 본래의 미세혈관이 결핍되어 있어, 안타깝게도 자연 상태의 생쥐 모델에서는 분석 결과의 예측 가능성이 떨어집니다.

성체 쥐의 장간막 창(mesenteric windows)에는 보통 주변부에 상대적으로 적은 수의 미세 혈관이 포함되어 있습니다. 이러한 장간막 창의 천연 두께는 5~10 µm에 불과합니다. 이를 통해 손상되지 않은 조직을 슬라이드 위에 펼쳐 현미경으로 관찰할 수 있으며, 결과적으로 각 창 내의 모든 혈관을 관찰할 수 있고 혈관을 본질적으로 2차원적인 확장 형태로 나타낼 수 있게 합니다.

이 방법은 혈관 미세혈관의 공간적 확장, 밀도, 패턴 형성 및 크기에 대한 정량적 측정을 수행할 수 있는 독보적인 기회를 제공합니다. 피하 부위는 혈관 신생 연구에 널리 이용되지만, 내피 세포의 이질성과 조직 특이적 성질로 인해 혈관 신생 및 피하 조직, 그리고 피하에서 성장하는 종양의 혈관 신생 조절 결과가 폐, 간, 뼈, 뇌와 같은 내장 기관의 혈관 신생 및 전이 조절을 예측하지 못할 수 있습니다. 내장 전이가 대개 암의 치명률을 결정짓는 최종 원인이 된다는 점에서 이는 주목할 만한 점입니다.

장간막창(mesenteric window)이 내장기관이라는 점이 이 점에서 유리할 것입니다. 본 프로젝트의 목적은 신생 혈관 형성(de novo angiogenesis)의 양상을 정량적으로 연구하는 것입니다. 따라서 우리는 공인된 혈관 형성 촉진 인자 또는 테스트 물질을 복강 내로 주입합니다.

일반적으로 마취하지 않은 성체 랫드에 한 번에 5 mL를 주입합니다. 이 정도 부피의 액체는 주입된 유체에 전체 장간막을 빠르게 노출시킵니다. 부피가 너무 적지 않다면 복강 내로 주입되는 모든 용액은 테스트 조직의 모든 세포에 영향을 미칩니다. 특히 매우 얇은 장간막 창을 덮고 있는 중피 세포층은 용질에 대한 투과성이 매우 높습니다. 수술 과정이 포함되지 않으므로 장간막 창에서 연구할 혈관 신생이 상처 치유로 유도된 혈관 신생에 의해 영향을 받지 않으며, 따라서 혈관 신생 치료는 복강 내 주사 형태로 이루어집니다.

실용적인 이유로, VEGF 1 65, 1 64 및 basic FGF와 같은 특정 단백질의 혈관 형성 효과를 연구할 때의 표준 방식에 따라 월요일 아침부터 금요일 아침까지 5일 동안 하루 두 번 주사하는 처치 프로토콜을 사용합니다. 일반적으로 Pharmacia 수액 솔루션을 용매로 사용합니다. 처치 횟수가 많아 보일 수 있으나, VEGF 및 basic FGF와 같은 강력한 혈관 형성 촉진 인자를 단일 용량 또는 소수의 간격을 둔 용량으로 생리적 수준에서 투여했을 때는 통계적으로 유의미한 혈관 형성을 유도하는 것이 항상 가능한 것은 아님이 입증되었습니다. 이는 조직 내에 강력한 내인성 혈관 형성 억제제들이 작용하고 있다는 점을 고려해야 하기 때문입니다.

혈관 신생 조절 치료법의 투여는 임상 치료 상황을 모방합니다. 하나 이상의 혈관 신생 조절 인자를 전신적, 피하, 정맥 내 또는 경구로 투여할 수 있습니다. 예를 들어 다음과 같습니다.

이는 모분자뿐만 아니라 그 대사산물의 효과까지 연구할 수 있다는 점에서 임상 치료 상황을 모사합니다. 이 시스템을 통해 전신 투여된 혈관 신생 조절제의 독성 효과를 어느 정도 제어할 수 있습니다. 성체 쥐는 생리적으로 성장하며 2~3주간의 실험 기간 동안 체중이 약 40%까지 증가할 수 있으므로, 동물의 체중을 측정함으로써 치료가 체중 증가를 어느 정도 늦추었는지 파악할 수 있으며, 이는 독성 효과의 지표로 간주될 수 있습니다.

이를 통해 혈관 신생 조절 시험에서 피해야 할 물질인 독성 용량을 확인할 수 있습니다. 독성 효과가 개입된 경우 특정 항혈관 신생 효과 관점에서 결과를 해석하는 것이 불가능할 수 있으므로 이는 중요한 이점이 됩니다. 성체 쥐(rats)는 성체 생쥐(mice)보다 훨씬 빠르게 성장하므로, 독성 물질이 체중 증가에 미치는 영향은 생쥐보다 쥐에서 일반적인 독성 효과를 나타내는 더 민감한 지표가 되어야 합니다.

이제 장간막 윈도우 표본을 제작하는 방법을 보여드리겠습니다. 이 동물들은 CO2를 사용하여 안락사시켰습니다. 장간막 윈도우는 장간막의 원위부부터 시작하여 3x1인치 크기의 일반 플러스 슬라이드 위에 펼쳐 놓습니다.

회장맹장판에서 시작하여 역행 방향으로 이동하며 장간막 창(mesenteric window)에서 육안으로 혈관 신생을 관찰할 수 없는지 확인합니다. 장간막의 가장 원위부에서 채취한 4개의 창을 사용합니다. 슬라이드 위의 표본을 실온에서 20분 동안 건조합니다.

장 절단부를 잘라냅니다. 그 후 시료를 -20 °C의 냉동고에 보관합니다. 이렇게 하면 시료의 품질 저하 없이 수개월, 심지어 수년 동안 보관할 수 있습니다.

염색은 쥐 내피세포에 대한 단클론 항체를 사용하여 수행합니다. 표본을 공기 중에 건조시키고, 커버글라스를 덮어 마운팅하지 마십시오. 개별 장간막 창의 혈관 발생 빈도 정량화는 총 광학 배율 14배에서 34배 사이의 도식 현미경을 이용한 컴퓨터 보조 형태계측 현미경법으로 수행합니다. 장간막 창 전체를 시각화합니다.

시료가 시야를 최대한 많이 덮을 수 있도록 배율을 일정 단계씩 조정하여 선택합니다. 창과 주변 지방 조직 사이의 경계가 뚜렷하므로 창의 전체 영역을 쉽게 묘사할 수 있습니다. 그런 다음 세심하게 정의된 기준에 따라 모든 혈관화된 부분을 그립니다.

고배율 확대 시 직경이 약 2.5에서 3.0 µm로 확인된 아주 작은 신생 혈관조차 명확하게 식별할 수 있습니다. 쥐 적혈구의 평균 직경이 6.3 µm 이상이라는 사실은 이 혈관들이 얼마나 작은지를 잘 보여줍니다. 전체 창 영역에서 혈관이 형성된 모든 부분의 면적이 차지하는 비율(%)은 상대적 혈관 형성 면적 va로 정의됩니다.

이는 사실상 혈관의 공간적 확장을 측정하는 것으로, 혈관은 본질적으로 2차원적 확장을 가지므로 예를 들어 컴퓨터 보조 텔레메트리를 사용하여 VA를 쉽게 측정할 수 있습니다. 다음 단계에서는 각 윈도우의 혈관 형성 부위 중 중심부 3곳 내의 미세혈관 밀도와 패턴 형성을 기록합니다. 이 부위들은 80배 광학 배율에서 무작위로 체계적으로 선택됩니다.

각 혈관은 도면 현미경을 사용하여 하나의 선으로 시각화합니다. 각 시야의 이미지는 디지털 이미지와 이미지 분석기로 전송되며, 이후 디지털 이미지 내의 모든 혈관은 두께가 1픽셀로 축소됩니다. 그런 다음 기기가 혈관을 나타내는 픽셀 수를 측정하며, 이는 시야 내 전체 픽셀 수에 대한 비율로 표시됩니다.

이 백분율 수치인 미세혈관 길이(MVL)는 혈관화된 면적의 단위당 미세혈관 길이를 나타내며, 이는 미세혈관 밀도의 복합 측정값입니다. 동물당 4개 윈도우의 VA 평균값에 해당 처리군의 평균 MVL을 곱하여 동물당 총 미세혈관 길이인 TMVL을 계산합니다. 또한, 저희는 이미지 분석을 이용해 미세혈관의 밀도와 구성에 대한 세밀한 정량적 분석 기법을 개발하였습니다.

측정 항목에는 두 연속적인 미세혈관 분지점 사이의 실제 거리, 즉 개별 미세혈관 분절의 길이(LEMS), 단위 조직 부피당 미세혈관 및 분절의 수(NOMS), 그리고 단위 조직 부피당 미세혈관 분지점의 수(NOBP)가 포함됩니다. 미세혈관의 굴곡도(MVT)는 두 연속적인 분지점 사이의 최단 거리와 실제 거리의 차이로 구하며, 미세혈관의 교차 발생 정도를 나타내는 교차 지수(INIS)와 상호 연결된 루프 형성 정도를 측정합니다. 루프 형성 지수(INLF) 또한 미세혈관 네트워크의 주변부에서 유사한 기술을 사용하여 정확하게 측정할 수 있습니다.

우리는 동일한 처리 그룹 내의 동물 간, 그리고 심지어 한 마리의 동물 내에서도 장간막 창(mesenteric windows) 사이에 상당한 차이가 있을 수 있으므로, 이를 고려하여 실험을 설계함으로써 싹의 길이, LESP, 단위 조직 부피당 싹의 수(NOSP)를 포함한 싹의 해당 변수들을 정량화할 수 있습니다. 우리는 다음과 같은 설계가 실용적임을 확인했습니다: 관찰 기간 동안 처리 그룹당 동물 수는 8~12마리로 하며, VA 관점에서 분석되는 동물당 창의 수, 미세혈관 길이(MVL) 측면에서 분석되는 각 창당 시야의 수, 미세혈관 세그먼트의 길이(LEMS), 미세혈관 세그먼트 수(NOMS), 미세혈관 수, 분지점 수(NOBP), 미세혈관 굴곡도(MVT), 교차 지수(I), 루프 형성 지수(INF)를 측정합니다. 대조군으로는 벡터(vehicle)로 처리한 동물 3마리를 사용합니다. 장간막 창 혈관신생 분석법은 용량-반응 연구 및 혈관신생 역학 분석에 매우 적합합니다.

이는 서로 다른 용량의 혈관 형성 촉진 인자를 동물 그룹에 처리하고, 혈관 형성 반응이 일어나는 동안 서로 다른 시점에서 해당 동물들을 희생시킴으로써 수행할 수 있습니다. 이를 통해 확장기, 정점 및 이후의 혈관 퇴행기를 정량적 관점에서 식별할 수 있습니다. 이러한 종류의 연구를 통해 테스트된 모든 성장 인자 사이토카인에 대한 신규 혈관 형성 반응이 속도, 효능 및 지속 기간 측면에서 구체적으로 용량 의존적이라는 것이 밝혀졌습니다.

또한, 미세 혈관의 공간적 확장과 밀도 변화 측면에서 새로운 혈관의 패턴은 생리적 농도의 VEGF 또는 basic FGF에 의해 매개되는 혈관 형성보다 용량 및 시간 의존성이 훨씬 뚜렷하게 나타나는 경우가 많습니다. 비만세포 내 선택적 활성화를 통해 유도된 비만세포 매개 혈관 형성(MCMA)은 상당히 더 높은 효능과 현저하게 더 긴 지속 시간을 보입니다. 실제로, 객관적인 혈관 형성 변수를 정량화할 수 있는 능력, 시스템의 높은 생물학적 관련성 및 독성 처리를 확인할 수 있는 가능성 덕분에 이 분석법을 사용하여 비만세포 매개 혈관 형성이 처음으로 기술되었습니다.

이 방법론은 구조 활성 및 용량 반응 분석에 매우 적합합니다. 쥐 MWAA는 생리적 혈관 형성이 일어나지 않으며 수술의 영향을 받지 않는 성체의 천연 혈관화된 내장 조직에서 혈관 형성을 연구할 수 있는 모델로, 이를 통해 상처 치유로 유도된 혈관 형성의 영향을 배제할 수 있습니다. 이 분석법은 진정한 정량적 분석이 가능하며, 미세혈관의 공간적 확장, 밀도 및 패턴 형성을 설명하는 생물학적으로 유의미한 다수의 객관적 변수들을 정확하게 평가합니다.

이 분석법은 혈관 신생의 전신적 영향 및 조절 인자 연구, 그리고 구조-활성 및 용량-반응 연구에 매우 적합합니다. 여기에 설명된 방법론은 스웨덴 고텐버그의 Borg 대학교 Reka 대학 병원 병리학과의 Dr.Kloss Carl Norby 연구실에서 개발되었습니다. 본 프로젝트의 모든 연구는 스웨덴 의료연구위원회(Swedish Medical Research Council)의 프로젝트 번호 5 9 4 2의 지원을 받았습니다.

프로젝트 시작부터 참여해주신 Gun Effer 씨와 참석하지 못한 Monica Anderson 씨, 그리고 Ann Nemar Lindgren 씨의 숙련된 기술적 지원에 깊은 감사를 표합니다.

이 짧은 발표가 이 분석법의 잠재력에 대해 이해하시는 데 도움이 되었기를 바랍니다. 귀하의 실험실에서 이 분석법을 사용하시다가 기술적인 문제에 부딪히신다면 기꺼이 도와드리겠습니다. 아울러, 제안하실 사항이 있다면 언제든 말씀해 주시면 감사하겠습니다.

감사합니다.