Immunohistochemistry : 벡터 연구소에서 Vectastain ABC 키트를 사용하여 파라핀 섹션

안녕하세요, 저는 Victor Chi이고 University of California Irvine의 생리학 및 생물 물리학과 Chandy Lab의 대학원생입니다. 오늘은 Vector Laboratories의 A, b, C 키트를 사용하여 파라핀 내장 섹션을 염색하는 방법을 시연해 드리겠습니다. 이 절차에는 파라핀 함유 절편을 왁싱 및 수화하고, 항원의 가면을 벗기고, 과산화효소 및 비특이적 단백질 결합을 차단하기 위한 열 유도 항원 회수 수행, CD 4 및 티로신 하이드록실라제 및 2차 항체로 배양, 슬라이드 개발 및 장착이 포함됩니다.

시작하겠습니다. 슬라이드는 파라핀으로 코딩되어 있기 때문에 첫 번째 단계는 슬라이드를 디왁스하는 것입니다. 이것은 일반적으로 각 세척에 대해 5분으로 구성된 세 번의 세척 후 3개의 자일렌 병을 사용하여 흄 후드에서 수행됩니다.

그런 다음 슬라이드를 100% 에탄올에 넣습니다. 슬라이드의 왁스가 사라진 것을 알 수 있지만 자일렌이 장갑의 고무를 녹이기 때문에 장갑으로 슬라이드를 다루지 않도록 주의하십시오. 거기에서 100% 에탄올의 슬라이드를 실험실로 다시 가져와 수화 구배를 거칠 것입니다.

그래서 여기서 저는 슬라이드를 통과시킬 수화 구배에 대해 이야기할 것입니다. 먼저 100% 에탄올로 만든 두 개의 목욕으로 시작합니다. 거기에서 슬라이드를 95% 에탄올로 구성된 두 개의 욕조로 옮깁니다.

그런 다음 슬라이드를 70% 에탄올 수조로 옮기고 거기에서 슬라이드를 50% 에탄올 수조로 옮깁니다. 그 후, 우리는 슬라이드를 30% 에탄올로 옮기고 2분 후에 슬라이드를 이중 증류수로 옮길 것입니다. 그리고 두 배 증류수를 가진 처리에, 우리는 우리의 활주를 PBS에서 앉게 할 것입니다.

이제 캐리지에서 한 욕조에서 다음 욕조로 슬라이드를 운반하는 방법을 보여 드리겠습니다. 따라서 첫 번째 단계는 캐리지 홀더를 사용하여 슬라이드를 제거하고 여분의 액체를 부드럽게 긁어 제거하여 다음 목욕에 너무 많은 액체를 운반하지 않도록 하는 것입니다. 거기에서 담그고 다음 그라디언트가 변경될 때까지 2분 동안 기다립니다.

조직이 고정되면 항원이 가려져 항체가 결합할 수 없는 경우가 많습니다. 이제 제가 할 일은 구연산나트륨을 이용한 열 유도 항원 회수 방법을 보여드리는 것입니다. 자, 이제 마이크로파로 가서 제 CD 8 항원의 가면을 벗겨서 면역조직화학을 사용하여 검출

그리고 여기에 용액을 넣고 전자레인지에 15분 동안 돌립니다. 따라서 슬라이드와 함께 구연산나트륨을 15분 동안 끓여서 슬라이드가 마르지 않도록 합니다. 우리는 슬라이드를 지켜보면서 끓일 때 슬라이드가 수분을 유지하도록 구연산나트륨으로 다시 채울 것입니다.

그래서 슬라이드를 구연산나트륨에 넣기 전에 이미 용액을 45초 동안 예열했습니다. 그런 다음 슬라이드를 구연산나트륨에 넣었고 이제 구연산나트륨을 15분 동안 가열하고 있습니다. 슬라이드가 들어 있으면 일반적으로 용액이 끓는 과정에 약 2-2 분 30 분이 지나면 끓기 시작합니다.

그 시점에서 저는 중단하고 손실된 구연산나트륨을 새로운 구연산나트륨으로 대체할 것입니다. 구연산나트륨을 15분 동안 끓인 후 슬라이드와 용액을 제거하고 식히고 싶습니다. 따라서 이를 수행하는 가장 좋은 방법은 슬라이드 홀더의 뚜껑을 닫고 여분의 액체를 붓고 용기 내부의 용액이 실온으로 냉각될 때까지 찬물 위에 흘려보내는 것입니다.

그리고 이것은 보통 약 10-15분 정도 걸립니다. 따라서 싱크대에서 슬라이드를 제거한 후 조직의 내인성 과산화효소 활성을 차단해야 합니다. 그래서 우리가 할 일은 30%의 과산화수소를 사용하여 과산화수소 용액을 만들고 1%의 과산화수소 용액을 만드는 것입니다.

그리고 여기에서 슬라이드를 과산화수소 용액으로 직접 옮깁니다. 이제 우리는 과산화수소에서 슬라이드를 20분 동안 배양할 것입니다. 이제 20분이 지난 후 내인성 과산화효소를 차단한 후 PBS를 사용하여 슬라이드에서 과산화수소를 씻어낼 것입니다.

그래서 저는 슬라이드를 캐리지로 옮기고 각각 5분씩 세 번 세척할 것입니다. 따라서 이러한 슬라이드는 조직을 손상시킬 수 있는 다른 슬라이드와의 접촉을 피하기 위해 연속적으로 배치되었습니다. 그래서 저는 단순히 슬라이드에서 미끄러져 내려가고 조직이 유리에 닿을 가능성이 없도록 슬라이드를 배열

거기에서 슬라이드를 PBS로 전송합니다. 그래서 PBS로 슬라이드를 세척한 후 이제 5% BSA 5% 염소 혈청과 0.1% 아지드화나트륨 용액으로 단백질의 비특이적 결합을 위한 슬라이드를 차단할 것입니다. 따라서 염소 항체를 다루는 경우 염소 혈청을 다른 종으로 변경하고 싶습니다.

그래서 지금 당장은 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 솔루션으로 채울 것입니다. 그래서 일반적으로 슬라이드의 볼륨이 티슈가 물에 잠기도록 반쯤 채웁니다. 따라서 슬라이드를 용기에 넣을 때 확인해야 할 한 가지는 이러한 조직이 용기의 측면에 닿지 않도록 하는 것입니다.

따라서 마지막 슬라이드의 경우 조직이 용기에 닿지 않도록 안쪽으로 회전합니다. 이제 하룻밤 사이에 슬라이드를 막았으므로 PBS에서 5분으로 구성된 5회씩 3회 세척으로 과도한 차단 용액을 씻어낼 것입니다. 따라서 이 시점에서 우리는 사용되는 항체의 양을 최소화하기 위해 조직 주위에 액체 차단제를 사용하여 원을 그리고자 합니다.

항체 보존에 대해 걱정하지 않는다면 차단 단계를 수행한 것과 동일한 케이스에서 슬라이드를 항상 배양할 수 있습니다. 이 시점부터 조직 주위에 액체 차단제로 그림을 그리는 방법을 보여 드리겠습니다. 그래서 우리는 먼저 조직을 만지지 않도록주의하면서 여분의 액체에서 혈액을 제거합니다.

따라서 모서리를 닦아서 과도한 액체를 제거하십시오. 다시 말하지만, 티슈를 만지지 않도록 매우 조심해야 합니다. 액체 차단 핀을 잡고 부드럽게 눌러 흐름을 진행한 다음 거기에서 펜으로 조직을 둘러쌉니다.

액체 차단제를 약 15초 동안 건조시킵니다. 이 시점에서 1차 항체를 추가하려고 합니다. 따라서 피펫을 사용하여 조직을 1차 항체로 덮고 습도 조절 상자로 옮기십시오.

그래서 우리는 Kim wipe를 사용합니다. 수요일은 1차 항체와 함께 배양하는 슬라이드가 마르는 것을 방지하기 위해 이 상자에 약간의 물과 결합했습니다. 이제 1차 항체가 한 시간 동안 배양되었으니, 슬라이드를 제거하고 PBS로 여분의 항체를 씻어낼 것입니다.

따라서 다시 말하지만 액체가 배수되도록 하고 PBS 세척에 삽입하십시오. 그리고 다시 5분 동안 세 번 씻는다. 그래서 5분 동안 세 번 씻은 후, 1차 항체를 추가한 것과 같은 방식으로 조직에 2차 항체를 추가할 것입니다.

따라서 조직을 덮을 수 있을 만큼 충분한 부피를 사용하고, 우리가 사용하는 염소 안티 토끼인 2차 항체를 추가하고, 슬라이드를 습도 조절 챔버로 다시 옮기십시오. 그래서 우리는 2차 항체인 비오틴화된 염소 항토끼를 사용하고 있는데, 이는 A BC 방법을 사용할 때 필수적입니다. 그래서 우리는 슬라이드를 습도 조절 챔버로 옮기고 한 번 배양할 수 있도록 합니다.

따라서 2차 항체가 배양하는 동안 A BC 시약을 준비해야 합니다. 그래서 우리는 벡터 염색 키트의 벡터 실험실, A, B, C 시약을 사용하고 있습니다. 따라서 시약을 제거하고 프라임으로 만들고 15 밀리리터의 PBS에 세 번 떨어 뜨리십시오. 방울은 특별히 계량되고 특정 크기이어야하기 때문에 튜브를 짜지 않도록주의하십시오.

2차 항체를 한 시간 정도 배양한 후, 1차 항체를 사용할 때와 마찬가지로 슬라이드를 PBS로 다시 씻습니다. 따라서 각각 5분씩 세 번 세척한 후 슬라이드를 이 용기로 옮겨 30-45분 전에 준비한 A B, C 시약을 추가합니다. 여기에 A, B, C 시약을 넣고 슬라이드를 채우고 30분에서 45분 동안 더 배양합니다.

따라서 슬라이드를 약 34분에서 5분 동안 a, B, C에 앉힌 후 여분의 A, B, C 용액을 씻어내고 싶습니다. 따라서 슬라이드를 제거하고 PBS 솔루션에 추가하기만 하면 됩니다. 그래서 우리는 PBS에서 5분씩 같은 세척 절차를 세 번 반복하고 싶습니다.

슬라이드를 세척하는 동안 벡터 실험실에서 DAB 과산화효소 기질을 준비합니다. pH 7.5 버퍼를 두 방울 떨어뜨립니다. pH 7.5 완충액 후 DAB 기질 반응 시약을 취하고 두 방울을 추가합니다.

다시 말하지만, 방울 크기가 중요하므로 병을 쥐지 말고 방울이 떨어지도록 하십시오. 완충액 pH 7.5를 위한 두 방울. 따라서 DAB 기질 시약을 4방울 떨어뜨려 떨어뜨리고 싶습니다.

당신은 또한 마지막에 추가하고 싶고, 과산화수소 기질 시약 두 방울을 추가하려고 합니다. 따라서 DAB 기질 시약 혼합물이 어떻게 보여야 합니다. 이제 슬라이드에 추가하고, 슬라이드를 제거하고, PBS가 슬라이드를 배수할 준비가 되었습니다.

따라서 시간이 지남에 따라 DAB 시약은 더 갈색이 됩니다. 따라서 이 시점에서 슬라이드에 추가하려고 합니다. 따라서 조직을 덮을 수 있을 만큼 충분한 부피를 취하고 조직 샘플에 직접 추가하기만 하면 됩니다.

따라서 적절한 부피를 취하여 조직 샘플 위에 직접 추가하고 시간이 지남에 따라 조직 샘플이 더 갈색으로 변할 때 용액이 개발되도록 하십시오. DAB 용액을 추가한 후 이 뇌 섹션에서 조직이 여기와 여기에서 갈색으로 변하는 것을 볼 수 있습니다. 갈색 DAB는 중뇌 도파민 뉴런이 있는 영역을 나타냅니다.

2분에서 10분 사이에 슬라이드를 현상한 후 슬라이드를 추가하고 싶기 때문에 반응을 멈추기 위해 얼음처럼 차가운 물에 슬라이드를 추가하고 싶습니다. 따라서 용액이 배수되도록 하고 슬라이드를 얼음처럼 차가운 물에 직접 추가하십시오. 슬라이드를 얼음처럼 차가운 물에 담근 후 목욕을 싱크대로 가져가 약 5분 동안 찬물을 흘려보내 이 수조에서 모든 DAB 용액이 배수

따라서 싱크대를 추가할 때 물줄기가 조직에 부딪히지 않도록 주의하고 모서리 중 하나에 부딪혀 넘치도록 하여 조직이 흐르는 물의 흐름에 의해 방해받지 않도록 하십시오. 따라서 세탁물에서 슬라이드를 제거한 후 카운터 염색을 하고 싶습니다. 그렇다면 왜 카운터 염색을 원할까요?

글쎄요, 한 가지 이유는 조직의 구조를 보고 싶을 수 있기 때문입니다. 또 다른 방법은 모든 셀을 시각화하는 것입니다. 그래서 우리의 목적을 위해, 우리는 핵을 의미하는 hemat toin으로 염색을 막을 것입니다.

그래서 우리는 슬라이드를 가져 와서 여분의 액체를 제거하고 Hemat Hematin 용액에 한 번만 담그고 싶습니다. 첫째, 꺼내서 물에 직접 넣으십시오. 수돗물에 슬라이드를 추가한 후에는 이전에 얼음물 수조에서 했던 것처럼 슬라이드를 가져와서 물 속에서 실행하고 싶습니다.

따라서 헤마트 토인 세척의 경우 항아리 내부의 물이 맑아질 때까지 흐르는 물에 흘려보내십시오. 따라서 물에서 카운터 스테인드 슬라이드를 제거한 후 슬라이드를 다시 탈수시키고 싶습니다. 그래서 우리는 그것을 에탄올 그라디언트를 통해 되돌려 놓기를 원하지만 역순으로 원합니다.

따라서 탈이온수로 한 번 씻고, 30% 에탄올로 한 번 씻고, 50% 에탄올로 한 번 씻고, 70% 에탄올로 한 번 씻고, 두 번 씻고, 95% 에탄올로 두 번 씻고, 두 번 씻고, 각각 2분씩 100% 에탄올로 씻습니다. 따라서 슬라이드를 제거하고 여분의 액체를 닦아내고 30% 에탄올에 직접 넣고 2분 동안 그대로 두십시오. 그래서 마지막 100% 에탄올 세척 후, 우리는 슬라이드를 자일렌에 다시 넣고 싶습니다.

따라서 슬라이드를 다시 가져 가서 여분의 액체를 긁어 내고 슬라이드를 가져 와서 5 분 동안 첫 번째 자일렌에 첨가하십시오. 그래서 그것은 각각 5 분 동안 3 회 연속 자일렌 세척입니다. 이제 슬라이드를 장착할 준비가 되었습니다.

그래서 제가 보통 하는 일은 슬라이드가 준비되기 1분 전에 목초지 피펫을 가지고 파마 마운트 용액을 뽑고 슬라이드가 나오기 약 1분 전에 자일렌을 마지막으로 씻은 후 장갑이 물에 잠기거나 장갑이 자일렌에 젖지 않도록 주의하는 것입니다. 핀셋으로 어느 쪽에 조직이 들어 있는지 주의하면서 제거합니다. Kim wipe로 여분의 XLE을 부드럽게 닦아내고 조직을 만지지 않도록 주의하고 모서리와 가장자리를 조심스럽게 닦아내면 대부분의 자일렌이 증발합니다. 하나가 마르기 전에 두 개의 슬라이드에서 작업할 수 있습니다.

따라서 한 슬라이드를 건조하면 다른 슬라이드를 사용할 준비가 되어야 합니다. 이제 완전히 마르기 전에 작업해야 합니다. 따라서 perimount를 잡고 조직 옆에 얇은 선을 긋고 조직을 만지지 않도록 주의해야 합니다.

커버 슬립을 잡고 페리마운트를 제거합니다. 45도 각도로 바르고 아래로 구부리십시오. 그런 다음 커버 슬립을 밀어 perimount가 모든 조직을 덮는지 확인합니다.

그런 다음 눕히고 내려놓고 중앙을 부드럽게 눌러 과도한 기포를 모두 제거합니다. 두 번째 조직에서 작업하는 동안 건조시키려면 실제로 슬라이드를 볼 때가 아니라 슬라이드를 볼 때입니다. 따라서 슬라이드를 보기 전에 퍼마 마운트를 밤새 건조시켜야 합니다.

그렇지 않으면 현미경의 빛 아래에서 perma 마운트가 거품을 일으키고 샘플을 망칠 것입니다. 다음은 티로신 하이드록실라제에 대항하는 토끼 다클론 항체인 화학 물질로 염색한 후의 뇌 단면을 살펴보겠습니다. 다시 말하지만, 갈색 DAB 염색은 중뇌 도파민 뉴런의 위치를 보여줍니다.

헤마틴 계수기 염색은 이 조직의 모든 핵을 파란색으로 바꿉니다. Vector Laboratories의 A BC 키트를 사용하여 파라핀 내장 섹션을 염색하는 방법을 보여드렸습니다. 이제 염색할 조직 유형과 사용할 항체에 따라 조건을 조정

그러니 당신의 실험에 행운을 빕니다.