Immunohistochemistry : 벡터 연구소에서 Vectastain ABC 키트를 사용하여 파라핀 섹션

안녕하세요, 저는 UC 어바인 생리학 및 생물물리학과 Chandy 연구실의 대학원생 Victor Chi입니다. 오늘은 Vector Laboratories의 A b, C 키트를 사용하여 파라핀 매립 절편을 염색하는 방법을 시연하겠습니다. 이 과정에는 파라핀 매립 절편의 탈파라핀 및 함수 처리, 항원 마스킹 해제를 위한 열 유도 항원 회수, 퍼옥시다아제 및 비특이적 단백질 결합 차단, CD four 및 tyrosine hydroxylase와 2차 항체 반응, 그리고 슬라이드 발색 및 마운팅 단계가 포함됩니다.

이제 시작하겠습니다. 슬라이드가 파라핀으로 포매되어 있으므로, 첫 번째 단계는 슬라이드의 탈파라핀 과정을 거치는 것입니다. 이 작업은 보통 흄 후드 내에서 3개의 자일렌 병을 사용하여 각 5분씩 총 3회 세척함으로써 수행됩니다.

그 다음 슬라이드를 100% 에탄올에 넣습니다. 슬라이드 위의 왁스가 제거된 것을 확인할 수 있으나, 자일렌이 장갑의 고무 성분을 녹일 수 있으므로 장갑을 낀 채로 슬라이드를 취급하지 않도록 주의하십시오. 이후 100% 에탄올에 담긴 슬라이드를 다시 실험실로 옮겨 수화 단계(hydration gradient)를 진행합니다.

이제 슬라이드에 적용할 수화 구배(hydration gradient)에 대해 설명하겠습니다. 먼저 100% 에탄올 용액 두 곳을 순차적으로 거칩니다. 그 다음, 슬라이드를 95% 에탄올로 구성된 두 개의 용액조로 옮깁니다.

그런 다음 슬라이드를 70% ethanol 수조로 옮기고, 이어서 50% ethanol 수조로 옮깁니다. 그 후 슬라이드를 30% ethanol로 옮기고, 2분 뒤에 2차 증류수가 담긴 수조로 옮깁니다. 2차 증류수 처리가 끝나면 슬라이드를 PBS에 담가 둡니다.

이제 캐리지를 사용하여 슬라이드를 한 조에서 다음 조로 옮기는 방법을 보여드리겠습니다. 먼저 캐리지 홀더를 사용하여 슬라이드를 꺼낸 다음, 다음 조로 너무 많은 액체가 넘어가지 않도록 여분의 액체를 가볍게 긁어 제거합니다. 그 후, 슬라이드를 담그고 다음 농도 구배 변경 시점까지 2분 동안 기다립니다.

조직을 고정할 때 항원이 차폐되어 항체가 결합하지 못하는 경우가 매우 많습니다. 따라서 지금부터 소듐 시트레이트를 이용한 열 유도 항원 회복 방법을 보여드리겠습니다. 이제 전자레인지 앞에서 면역조직화학법으로 검출하려는 CD8 항원의 차폐를 해제해 보겠습니다.

이제 용액을 넣고 15분 동안 전자레인지에 돌리겠습니다. 슬라이드가 마르지 않도록 슬라이드와 함께 시트르산 나트륨을 15분 동안 끓입니다. 끓어 넘칠 때마다 시트르산 나트륨을 다시 채워 슬라이드가 계속 수분 상태를 유지하도록 관찰하겠습니다.

슬라이드를 시트르산 나트륨 용액에 넣기 전에, 이미 45초 동안 용액을 예열해 두었습니다. 그런 다음 슬라이드를 시트르산 나트륨 용액에 넣고 15분 동안 가열합니다. 슬라이드가 들어있는 상태에서 보통 가열 시작 후 약 2분에서 2분 30초 정도가 지나면 용액이 끓어 넘치기 시작합니다.

그 시점에서 작업을 멈추고, 소모된 시트르산 나트륨을 새 시트르산 나트륨으로 교체합니다. 시트르산 나트륨을 15분 동안 가열한 후, 슬라이드와 용액을 꺼내어 냉각시켜야 합니다. 이를 위한 가장 좋은 방법은 슬라이드 홀더의 뚜껑을 닫고 과잉 액체를 따라낸 다음, 용기 내부의 용액이 실온까지 식을 때까지 찬물 흐름에 노출시키는 것입니다.

이 과정은 보통 약 10분에서 15분 정도 소요됩니다. 싱크대에서 슬라이드를 꺼낸 후, 조직 내의 내인성 peroxidase 활성을 차단해야 합니다. 이를 위해 30% 과산화수소를 사용하여 1% 과산화수소 용액을 준비하겠습니다.

여기서 슬라이드를 과산화수소 용액으로 직접 옮깁니다. 이제 슬라이드를 과산화수소에 20분 동안 반응시킵니다. 20분이 경과한 후, 내인성 과산화효소를 차단했으므로, PBS 세척액을 사용하여 슬라이드에서 과산화수소를 씻어내겠습니다.

이제 슬라이드를 캐리지로 옮기고, 5분씩 3회 세척하겠습니다. 조직이 손상될 수 있으므로, 다른 슬라이드와 접촉하지 않도록 슬라이드를 서로 등지게 배치했습니다. 슬라이드를 조심스럽게 밀어서 조직이 유리에 닿을 가능성이 없도록 배열하겠습니다.

이제 슬라이드를 PBS로 옮깁니다. PBS로 슬라이드를 세척한 후, 5% BSA, 5% goat serum 및 0.1% sodium azide 용액을 사용하여 단백질의 비특이적 결합을 막기 위해 슬라이드를 블로킹하겠습니다. 만약 goat 항체를 사용하고 계신다면 goat serum을 다른 종의 serum으로 변경하시기 바랍니다.

이제 슬라이드를 슬라이드 홀더에 넣고 용액을 채우겠습니다. 보통은 슬라이드의 부피로 인해 조직이 충분히 잠길 수 있도록 절반 정도만 채웁니다. 슬라이드를 용기에 넣을 때 주의할 점은 조직이 용기 벽면에 닿지 않도록 하는 것입니다.

마지막 슬라이드의 경우, 조직이 용기에 닿지 않도록 안쪽으로 회전시켜 줍니다. 이제 슬라이드를 하룻밤 동안 블로킹했으므로, PBS에서 5분씩 세 번 세척하여 과잉 블로킹 용액을 씻어내겠습니다. 이 단계에서, 항체 사용량을 최소화하기 위해 액체 블로커를 사용하여 조직 주변에 원을 그려줍니다.

항체 보존이 중요하지 않은 경우에는 블로킹 단계를 수행했던 것과 동일한 케이싱에서 슬라이드를 계속 배양할 수 있습니다. 이제부터는 액체 블로커를 사용하여 조직 주변에 어떻게 선을 긋는지 보여드리겠습니다. 우선 조직에 닿지 않도록 주의하면서 과잉 액체를 제거합니다.

이제 모서리 주변을 닦아내어 과잉 액체를 제거하십시오. 이때 조직을 건드리지 않도록 매우 주의해야 합니다. 액체 블로킹 핀을 잡고 살며시 눌러 흐름을 유도한 다음, 펜으로 조직의 둘레를 그리십시오.

액체 블로커를 약 15초 동안 건조시키십시오. 이제 1차 항체를 추가할 차례입니다. 피펫을 사용하여 조직 전체가 1차 항체로 덮이도록 처리한 후, 습도가 조절되는 보관함으로 옮기십시오.

따라서 Kimwipe를 사용합니다. 1차 항체와 함께 배양하는 동안 슬라이드가 마르는 것을 방지하기 위해 이 상자 안에 di water를 적셔 둡니다. 1차 항체를 1시간 동안 배양했으므로, 이제 슬라이드를 꺼내 PBS로 과잉 항체를 씻어내겠습니다.

따라서 다시 한번 액체를 배출시킨 후 PBS 세척액에 넣으십시오. 그리고 다시 5분씩 3회 세척합니다. 5분씩 3회 세척을 마친 후, 1차 항체를 추가했던 것과 동일한 방식으로 조직에 2차 항체를 추가하겠습니다.

조직이 충분히 잠길 정도의 부피로 2차 항체(여기서는 goat anti rabbit 사용)를 첨가한 후, 슬라이드를 다시 습도 조절 챔버로 옮깁니다. ABC 방법을 사용할 때 필수적인 비오틴화된 goat anti rabbit 2차 항체를 사용하고 있습니다. 따라서 슬라이드를 습도 조절 챔버로 옮겨 1시간 동안 배양합니다.

2차 항체를 반응시키는 동안 ABC 시약을 준비해야 합니다. 여기서는 Vector Laboratories의 Vector Stain 키트에 포함된 ABC 시약을 사용합니다. 시약 A'를 꺼내어 15 mL의 PBS에 세 방울을 떨어뜨리십시오. 이때 방울의 양과 크기가 정확하게 측정되어야 하므로 튜브를 세게 짜지 않도록 주의하십시오.

2차 항체 반응을 약 1시간 동안 진행한 후, 슬라이드를 꺼내어 1차 항체 때와 마찬가지로 PBS로 다시 세척합니다. 5분씩 총 3회 세척한 다음, 30~45분 전에 미리 준비해 둔 ABC 시약이 담긴 용기에 슬라이드를 옮깁니다. 여기에 ABC 시약을 추가하여 슬라이드가 충분히 잠기게 한 뒤, 30~45분 동안 추가로 반응시킵니다.

슬라이드를 ABC 용액에 약 3~5분 동안 담가둔 후, 과잉의 ABC 용액을 씻어내야 합니다. 슬라이드를 꺼내어 PBS 용액에 넣으십시오. 이러한 세척 과정을 PBS에서 5분씩 총 3회 반복합니다.

슬라이드를 세척하는 동안, Vector Laboratories의 DAB peroxidase substrate를 준비합니다. pH 7.5 buffer를 취하여 두 방울 첨가합니다. pH 7.5 buffer 다음으로, DAB substrate react reagent를 취하여 두 방울 첨가합니다.

다시 한번 강조하지만, 방울 크기가 매우 중요하므로 병을 짜지 말고 방울이 자연스럽게 떨어지게 하십시오. pH 7.5 완충액을 위해 두 방울을 넣습니다. 그런 다음 DAB 기질 시약 4방울을 똑같이 떨어뜨려 추가합니다.

마지막으로 과산화수소 기질 시약 두 방울을 추가합니다. 이것이 DAB 기질 시약 혼합물의 모습입니다. 이제 슬라이드에 추가할 준비가 되었습니다. 슬라이드를 꺼내 PBS가 자연스럽게 흘러내리도록 하십시오.

시간이 지남에 따라 DAB 시약의 색이 점점 더 갈색으로 변합니다. 이때 슬라이드에 시약을 첨가해야 합니다. 조직을 충분히 덮을 수 있는 양을 취해 조직 샘플 위에 직접 첨가하십시오.

적절한 부피를 취해 조직 샘플 위에 직접 가하고, 시간이 지남에 따라 조직 샘플이 갈색으로 변하도록 용액을 반응시킵니다. DAB 용액을 첨가한 후, 이 뇌 절편에서 조직이 여기와 여기에 갈색으로 변하는 것을 확인할 수 있습니다. 갈색으로 염색된 DAB는 중뇌 도파민성 뉴런이 포함된 영역을 나타냅니다.

슬라이드를 2분에서 10분 정도 현상한 후, 반응을 중단시키기 위해 슬라이드를 얼음물에 넣어야 합니다. 용액이 충분히 빠지도록 한 뒤, 슬라이드를 얼음물에 직접 넣으십시오. 슬라이드를 얼음물에 담근 후, 염색조를 싱크대로 옮겨 약 5분 동안 찬물을 흘려보내 염색조에서 모든 DAB 용액이 완전히 배출되도록 하십시오.

따라서 싱크대에 넣을 때, 물줄기가 조직에 직접 닿지 않도록 주의하고, 대신 모서리 부분에 닿게 하여 물이 자연스럽게 넘쳐흐르도록 함으로써 물의 흐름으로 인해 조직이 손상되지 않도록 하십시오. 세척 후 슬라이드를 꺼냈다면, 이제 대조 염색을 수행해야 합니다. 대조 염색이 필요한 이유는 무엇일까요?

우선, 조직의 구조를 확인하고 싶을 때 사용할 수 있습니다. 또 다른 이유는 모든 세포를 시각화하기 위함입니다. 따라서 본 실험의 목적을 위해, 핵을 염색하는 hematoxylin으로 대조 염색을 진행하겠습니다.

슬라이드를 꺼내어 과잉 액체를 제거한 다음, Hemat Hematin 용액에 한 번 담급니다. 한 번 담갔다 꺼낸 후 즉시 물에 넣으십시오. 수돗물에 슬라이드를 넣은 후, 이전에 얼음 냉수욕에서 했던 것과 마찬가지로 슬라이드에 물을 흘려보내십시오.

따라서 헤마톡실린 세척의 경우, 병 안의 물이 맑아질 때까지 흐르는 물에 두십시오. 대조 염색된 슬라이드를 물에서 꺼낸 후, 슬라이드를 다시 탈수해야 합니다. 그러므로 에탄올 농도 구배를 역순으로 다시 통과시켜야 합니다.

따라서 탈이온수로 1회, 30% ethanol로 1회, 50% ethanol로 1회, 70% ethanol로 1회, 95% ethanol로 2회, 그리고 100% ethanol로 2회 세척하며, 각 단계는 2분씩 진행합니다. 슬라이드를 꺼내어 여분의 액체를 닦아낸 후 30% ethanol에 바로 넣고 2분 동안 둡니다. 마지막 100% ethanol 세척이 끝나면 슬라이드를 다시 xylene에 넣습니다.

슬라이드를 다시 꺼내어 여분의 액체를 닦아내고, 첫 번째 자일렌에 5분 동안 담급니다. 이렇게 하여 5분씩 세 번의 연속적인 자일렌 세척 과정을 거칩니다. 이제 슬라이드를 마운팅할 준비가 되었습니다.

제가 보통 하는 방식은 슬라이드가 준비되기 1분 전에 파스퇴르 피펫으로 영구 봉입액을 취해 두고, 슬라이드가 나올 때까지 약 1분 정도 기다리는 것입니다. 자일렌으로 마지막 세척을 마친 후, 장갑이 자일렌에 잠기거나 젖지 않도록 주의하며 조직이 어느 쪽에 있는지 확인하고 핀셋으로 슬라이드를 꺼냅니다. 조직이 닿지 않도록 주의하며 킴와이프로 여분의 자일렌을 가볍게 닦아내는데, 모서리와 가장자리만 조심스럽게 닦아 대부분의 자일렌이 증발하도록 합니다. 슬라이드 하나가 마르기 전까지 아마 두 장 정도의 슬라이드를 작업할 수 있을 것입니다.

한 슬라이드의 건조가 완료되면 다른 슬라이드가 작업 준비가 될 것입니다. 슬라이드가 완전히 마르기 전에 작업을 진행해야 합니다. Perimount를 사용하여 조직 옆에 얇은 선을 그리되, 조직에 닿지 않도록 주의하십시오.

커버슬립을 덮으면서 페리마운트(perimount)를 도포합니다. 45도 각도로 적용하여 자연스럽게 내려앉게 합니다. 그 다음, 페리마운트가 모든 조직을 덮을 수 있도록 커버슬립을 밀어줍니다.

그다음 그것을 내려놓고 중앙을 부드럽게 눌러 모든 과잉 기포를 제거합니다. 두 번째 조직을 처리하는 동안 건조시키십시오. 사실 슬라이드를 관찰할 때는, Permount가 하룻밤 동안 건조될 때까지 기다린 후 슬라이드를 확인해야 합니다.

그렇지 않으면 현미경 조명 아래에서 영구 봉입제가 기포를 형성하여 샘플을 망칠 수 있습니다. 여기 화학 물질과 tyrosine hydroxylase에 대한 토끼 폴리클로날 항체로 염색한 뇌 절편의 모습이 있습니다. 다시 한번 말씀드리자면, 갈색 DAB 염색은 중뇌 도파민성 뉴런의 위치를 나타냅니다.

헤마틴 대조 염색을 통해 이 조직의 모든 핵이 파란색으로 염색되었습니다. 지금까지 Vector Laboratories의 ABC 키트를 사용하여 파라핀 매립 섹션을 염색하는 방법을 보여드렸습니다. 이제 염색하려는 조직의 종류와 사용하는 항체에 따라 조건을 조정하시기 바랍니다.

그럼 여러분의 실험에 행운을 빕니다.